陳潔玲 沈 杰 劉國正

（安徽省中醫(yī)院亳州分院，亳州市中醫(yī)院，安徽亳州236800）

潰瘍性結(jié)腸 炎（ulcerative colitis，UC） 是一種慢性、進(jìn)展性和異質(zhì)性的炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）。在腸道結(jié)構(gòu)與功能方面，UC的疾病進(jìn)展有6種主要表現(xiàn)形式：近端延伸；狹窄形成；腸道假性息肉和纖維化形成；腸道彈性和適應(yīng)性下降，造成腸道動(dòng)力障礙；肛門直腸功能障礙；黏膜屏障通透性改變[1]。根據(jù)UC患者黏液膿血便的臨床表現(xiàn)及反復(fù)發(fā)作、遷延難愈的病情特點(diǎn)，可歸屬于中醫(yī)學(xué)“久痢”范疇。本病病位在大腸，與脾、肝、腎、肺諸臟的功能失調(diào)密切相關(guān)，病理性質(zhì)為本虛標(biāo)實(shí)，病理因素主要有濕邪（熱）、熱毒、瘀熱、痰濁、氣滯、血瘀等[2]。鐵死亡作為一種新型的細(xì)胞死亡方式，通過鐵離子水平升高、氧化應(yīng)激和谷氨酸興奮性毒性作用等，參與炎癥、神經(jīng)、腫瘤等疾病的發(fā)生發(fā)展過程。然而，鐵死亡與腸黏膜炎癥的關(guān)系及其可能的分子機(jī)制仍不十分清楚。本課題組以往的研究表明，益氣解毒化瘀方能明顯降低UC模型大鼠的疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）、大體形態(tài)損傷指數(shù)（CMDI）、組織學(xué)損傷指數(shù)（TDI），降低大鼠血清白介素-6（IL-6）、轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）含量，升高IL-10含量[3]。因此，本研究試圖從鐵死亡與腸黏膜炎癥的角度，探討益氣解毒化瘀方干預(yù)潰瘍性結(jié)腸炎的療效及作用機(jī)理，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選擇2018年1月至2020年1月安徽省中醫(yī)院亳州分院收治的60例潰瘍性結(jié)腸炎患者，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為治療組與對照組，每組30例。治療組男16例，女14例；年齡18～54歲，平均年齡（37.8±3.2）歲；平均病程（1.3±0.2）年；輕度18例，中度12例；病變范圍蒙特利爾（Montreal）分類，直腸型（E1）10例，左半結(jié)腸型（E2）15例，廣泛結(jié)腸型（E3）5例；大腸濕熱證15例，熱毒熾盛證8例，脾虛濕蘊(yùn)證5例，其他2例。對照組男15例，女15例；年齡19～56歲，平均年齡（34.1±3.4）歲；平均病程（1.4±0.3）年；輕度20例，中度10例；直腸型（E1）8例，左半結(jié)腸型（E2）18例，廣泛結(jié)腸型（E3）4例；大腸濕熱證17例，熱毒熾盛證7例，脾虛濕蘊(yùn)證3例，其他3例。2組患者性別、年齡、病程、證型分布等一般資料比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究通過安徽省中醫(yī)院亳州分院倫理委員會(huì)審核。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) UC的診斷標(biāo)準(zhǔn)及輕重程度判定參照《炎癥性腸病診斷與治療的共識意見（2018年·北京）》[4]中的標(biāo)準(zhǔn)。中醫(yī)診斷及分型辨證標(biāo)準(zhǔn)參照《潰瘍性結(jié)腸炎中醫(yī)診療專家共識意見（2017）》[2]擬定。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn) 符合UC的中西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)，屬于輕度或中度；年齡18～65 歲；患者自愿參加本研究并簽署知情同意書；能堅(jiān)持完成1 個(gè)療程治療。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn) 重度UC患者；妊娠期、哺乳期患者；合并有心、肝、腎和血液系統(tǒng)等嚴(yán)重原發(fā)性疾病或精神病患者；病情惡化或出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)事件，需要退出臨床試驗(yàn)者；過敏體質(zhì)者。

2 治療方法

2.1 對照組 予維持水電解質(zhì)和酸堿平衡；美沙拉秦腸溶片（美莎欣，批號：H20103359；規(guī)格：250 mg/片），口服，4片/次，4次/d。

2.2 治療組 在對照組治療的基礎(chǔ)上給予中藥益氣解毒化瘀方。藥物組成：黨參15 g，炒白術(shù)10 g，赤芍10 g，白芍10 g，煨木香6 g，馬齒莧15 g，炒薏苡仁15 g，白及10 g，三七粉6 g，炒谷芽10 g，黃連5 g，黃柏10 g。隨證加減：大腸濕熱證，原方白芍加至30 g，黨參減至9 g，白術(shù)減至6 g，加當(dāng)歸15 g、檳榔6 g、肉桂5 g、大黃9 g等。熱毒熾盛證：原方黨參減至9 g，白術(shù)減至6 g，加白頭翁15 g、秦皮12 g、仙鶴草15 g等。脾虛濕蘊(yùn)證：原方去黃柏，馬齒莧減至9 g，加桔梗15 g、山藥15 g、茯苓15 g等。每日1劑，由醫(yī)院中藥煎煮機(jī)煎煮為200 mL，早晚各服100 mL。

2組療程均為2個(gè)月。

3 療效觀察

3.1 觀察指標(biāo)

3.1.1 中醫(yī)證候評分 治療前后參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則（試行）》[5]對2 組患者的中醫(yī)證候進(jìn)行評分，腹痛、腹瀉、膿血便評分按無、輕、中、重分別記0、2、4、6 分，里急后重按無、輕、中、重分別記0、1、2、3 分。

3.1.2 Mayo評分 治療前后對2組患者進(jìn)行Mayo評分。該評分包括排便次數(shù)、便血、黏膜表現(xiàn)和醫(yī)師評估病情4項(xiàng)[4]，評分越高表示病情越重。

3.1.3 UC的內(nèi)鏡下疾病嚴(yán)重指數(shù)（UCEIS）評分 治療前后對2組患者進(jìn)行UCEIS評分。UCEIS是一種用于評估UC內(nèi)鏡下嚴(yán)重度的工具，對患者的血管模式（正常，斑片狀閉塞，閉塞）、出血（無，黏膜、管腔輕度，管腔中度，管腔重度）和糜爛、潰瘍（無，糜爛，淺表性潰瘍，深部潰瘍）進(jìn)行評分，評分越高表示疾病越嚴(yán)重[6]。

3.1.4 組織病理學(xué)Geboes評分 治療前后對2組患者進(jìn)行組織病理學(xué)Geboes評分。評分項(xiàng)目包括隱窩結(jié)構(gòu)不整齊、黏膜固有層慢性炎癥細(xì)胞浸潤、黏膜固有層中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞浸潤、上皮細(xì)胞嗜中性粒細(xì)胞浸潤、隱窩破壞、糜爛/潰瘍等6項(xiàng)，評分越高表示病變越嚴(yán)重[7]。

3.1.5 外周血白細(xì)胞中超氧化物歧化酶1（SOD1）mRNA、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2（PTGS2）mRNA及谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）mRNA表達(dá) 治療前后2組患者空腹取外周血2 mL，肝素抗凝，加入紅細(xì)胞裂解液，混勻后離心，棄上清，留白細(xì)胞沉淀，加入TRIZOL混勻，提取RNA之后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲得cDNA，再進(jìn) 行 定 量PCR擴(kuò) 增。 引 物 序 列 如 下：SOD1，forward 5’-CTCAGGAGACCATTGCATCA-3’，reverse 5’-ACAAGCCAAACGACTTCCAG-3’；PTGS2，forward 5’-GGTTGCTGGTGGTAG GAATC-3’，reverse 5’-TAAAGCGTTTGGGGTAC TCA-3’；GPX4，forward 5’-GCCCCTCCATC TACGA CTTC-3’，reverse 5’-TTGGTGATGA TGCAGACGAAG-3’；GAPDH，forward 5’-CCAC TCCTCCACCTTTG-3’，reverse 5’-CACCACCC TGTTGCTGT-3’。引物由上海生工公司設(shè)計(jì)、合成。

3.1.6 血清及腸黏膜SOD1、PTGS2及GPX4蛋白含量 治療前后2 組患者取血分離血清，采用酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）試劑盒檢測血清中SOD1、PTGS2 及GPX4 蛋白含量，試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司。治療前后2 組患者行腸鏡檢查，取腸黏膜組織，采用western-blot方法檢測SOD1、PTGS2 及GPX4 蛋白含量，抗體購自Abcam公司。

3.2 療效判定標(biāo)準(zhǔn) 參照《潰瘍性結(jié)腸炎中醫(yī)診療專家共識意見（2017）》[2]中的中醫(yī)證候療效評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。臨床緩解：治療后癥狀和體征明顯改善，療效指數(shù)≥95%；顯效：治療后癥狀和體征明顯改善，70%≤療效指數(shù)＜95%；有效：治療后癥狀和體征有改善，30%≤療效指數(shù)＜70%；無效：治療后癥狀和體征無明顯減輕或加重，療效指數(shù)＜30%。療效指數(shù)（%）=（治療前積分-治療后積分）/治療前積分×100%。

3.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件，等級資料采用秩和檢驗(yàn)，計(jì)量資料以（）表示，采用成組t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.4 治療結(jié)果

3.4.1 2組患者中醫(yī)證候療效比較 結(jié)果見表1。

3.4.2 2組患者治療前后Mayo、UCEIS、組織病理學(xué)Geboes評分比較 結(jié)果見表2。

3.4.3 2組患者治療前后外周血白細(xì)胞中SOD1 mRNA、PTGS2 mRNA及GPX4 mRNA水平比較 結(jié)果見表3。

3.4.4 2組患者治療前后血清SOD1、PTGS2及GPX4蛋白 含 量比較 結(jié)果見表4。

3.4.5 2 組患者治療前后腸黏膜組織中SOD1、PTGS2 及GPX4 比較 結(jié)果見圖1、表5。

4 討論

UC是一種發(fā)生于結(jié)腸黏膜及黏膜下層的彌漫性、慢性炎性疾病，發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚。研究發(fā)現(xiàn)，UC活動(dòng)期患者脂質(zhì)過氧化物（LPO）、丙二醛（MDA）、晚期氧化蛋白產(chǎn)物（AOPP）、一氧化氮（NO）等氧化應(yīng)激指標(biāo)表達(dá)水平均明顯高于結(jié)腸息肉患者[8]。目前認(rèn)為，炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激共同作用于腸黏膜組織，引起多種基因突變，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致結(jié)腸腫瘤的發(fā)生。

鐵 死亡（Ferroptosis）是 一種鐵依賴性的氧化性程序性細(xì)胞死亡，其具有明確的鐵依賴性且與脂質(zhì)過氧化相關(guān)，谷胱甘肽（GSH）明顯耗竭，GPX4是鐵死亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因。目前已知鐵死亡參與多種病理過程，包括缺血/再灌注引起的腎或肝損傷、神經(jīng)毒性和神經(jīng)退行性疾病、癌癥等[9]。PTGS2活化后可促進(jìn)前列腺素合成，并激活下游一系列炎癥反應(yīng)信號，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。因此，我們推測鐵死亡與UC腸道炎癥存在著密切的關(guān)系。

益氣解毒化瘀方是在經(jīng)方四君子湯合香連丸的基礎(chǔ)上化裁而成，以健脾益氣、清熱解毒、活血化瘀為治則立法。本方以黨參、白術(shù)為君，補(bǔ)脾益氣、燥濕利水。馬齒莧、黃連、黃柏、木香共為臣藥：馬齒莧清熱解毒、涼血止??；黃連配黃柏燥濕清熱、涼血解毒而止大便膿血；黃連配木香，行腸胃滯氣，除里 急后重。赤芍、三七 粉、白及、白芍共為佐藥：赤芍、白芍合用，白芍?jǐn)筷帲嗌譀鲅?，退血分之熱；白及、三七功專活血行瘀、斂瘡生肌。炒薏苡仁、炒谷芽健脾消積利水共為使藥。該方配伍嚴(yán)謹(jǐn)，切中病機(jī)，用藥精良。本研究結(jié)果顯示，加用益氣解毒化瘀方治療可有效改善患者中醫(yī)證候。目前UC的疾病管理策略正由控制癥狀發(fā)展為達(dá)到臨床/患者報(bào)告緩解（直腸無出血、排便頻率正常）和內(nèi)鏡緩解（黏膜愈合），以阻斷疾病進(jìn)展，改善遠(yuǎn)期預(yù)后。本研究結(jié)果顯示，治療后2組患者M(jìn)ayo評分和UCEIS、組織病理學(xué)Geboes評分均較治療前明顯下降，治療組上述評分明顯低于對照組，說明加用益氣解毒化瘀方可更好地促進(jìn)黏膜愈合。

表1 治療組與對照組患者中醫(yī)證候療效比較 單位：例（%）

表2 治療組與對照組患者治療前后Mayo、UCEIS、組織病理學(xué)Geboes評分比較（） 單位：分

表2 治療組與對照組患者治療前后Mayo、UCEIS、組織病理學(xué)Geboes評分比較（） 單位：分

注： 與本組治療前比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與對照組治療后比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別 例數(shù) 時(shí)間 Mayo評分 UCEIS評分 組織病理學(xué)Geboes評分治療組 30 治療前 5.64±1.12 6.32±1.52 4.68±1.22治療后 1.74±0.58**△ 3.07±0.83**△△ 2.85±0.94**△對照組 30 治療前 5.36±1.28 6.54±1.36 4.82±1.31治療后 2.86±0.67** 4.68±1.05* 3.42±1.08*

表3 治療組與對照組治療前后外周血白細(xì)胞中SOD1、PTGS2及GPX4 mRNA水平比較

表3 治療組與對照組治療前后外周血白細(xì)胞中SOD1、PTGS2及GPX4 mRNA水平比較

注： 與本組治療前比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與對照組治療后比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別 例數(shù) 時(shí)間 SOD1 mRNA PTGS2 mRNA GPX4 mRNA治療組 30 治療前 1.02±0.23 1.01±0.16 1.03±0.12治療后 2.58±0.48**△△ 0.33±0.12**△△ 2.88±0.47**△對照組 30 治療前 1.07±0.27 1.05±0.21 1.07±0.18治療后 1.78±0.32** 0.76±0.20* 2.02±0.42**

表4 治療組與對照組治療前后血清SOD1、PTGS2及GPX4蛋白含量比較

表4 治療組與對照組治療前后血清SOD1、PTGS2及GPX4蛋白含量比較

注： 與本組治療前比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與對照組治療后比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別 例數(shù) 時(shí)間 SOD1/（pg/mL） PTGS2/（pg/mL） GPX4/（ng/mL）治療組 30 治療前 356.45±53.48 750.14±93.74 3.56±0.64治療后 846.85±109.28**△ 350.94±63.54**△△ 8.75±1.32**△△對照組 30 治療前 327.74±44.06 720.21±80.72 3.29±0.52治療后 684.32±78.28** 526.35±63.22* 6.42±1.13**

圖1 治療組與對照組治療前后腸黏膜組織中SOD1、PTGS2及GPX4蛋白表達(dá)

表5 治療組與對照組治療前后腸黏膜組織中SOD1、PTGS2及GPX4蛋白含量比較

表5 治療組與對照組治療前后腸黏膜組織中SOD1、PTGS2及GPX4蛋白含量比較

注： 與本組治療前比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與對照組治療后比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別 例數(shù) 時(shí)間 SOD1/（pg/mL） PTGS2/（pg/mL） GPX4/（ng/mL）治療組 30 治療前 0.78±0.12 0.81±0.12 0.92±0.14治療后 1.98±1.21**△△ 0.31±0.04*△ 1.87±0.28**△對照組 30 治療前 0.72±0.09 0.74±0.08 0.89±0.11治療后 1.24±0.14* 0.45±0.07* 1.46±0.23*

SOD1是細(xì)胞內(nèi)重要的抗氧化劑，對清除自由基，維持細(xì)胞內(nèi)外氧化還原平衡起到重要的作用，保護(hù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)及功能不受過氧化物的干擾及損害[10]。本研究結(jié)果顯示，治療后2組患者SOD1 mRNA表達(dá)和蛋白含量均較治療前明顯升高，且治療組明顯高于對照組。GPX4是GSH依賴性酶，可對抗依賴鐵和脂質(zhì)過氧化，并保持細(xì)胞膜脂雙層的穩(wěn)態(tài)。如果GPX4表達(dá)下降，細(xì)胞對鐵死亡更加敏感；GPX4表達(dá)上調(diào)，則細(xì)胞表現(xiàn)出對鐵死亡的適應(yīng)性耐受[11-12]。PTGS2也被稱為環(huán)氧化酶-2（COX-2），是UC活動(dòng)期關(guān)鍵基因。研究發(fā)現(xiàn)，PTGS2單倍型與炎癥性腸病易感性相關(guān)[13]，PTGS2-1195G多態(tài)性與UC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)具有相關(guān)性[14]。本研究結(jié)果顯示，治療后2組患者PTGS2蛋白含量及mRNA表達(dá)均較治療前明顯下降，GPX4蛋白含量及mRNA表達(dá)均較治療前明顯上升，且治療組改善效果明顯優(yōu)于對照組，表明加用益氣解毒化瘀方可抑制氧化應(yīng)激，減輕鐵死亡。

綜上，本研究結(jié)果顯示，益氣解毒化瘀方聯(lián)合西醫(yī)常規(guī)療法治療潰瘍性結(jié)腸炎患者療效更為顯著，可能與改善氧化應(yīng)激狀態(tài)，減輕細(xì)胞鐵死亡，促進(jìn)黏膜修復(fù)有關(guān)。在今后的研究中，我們將探討鐵死亡與腸黏膜通透性及與炎癥反應(yīng)通路的關(guān)系，篩選更加有效、更有針對性的治療方藥，進(jìn)一步提高本病的治療效果，減少復(fù)發(fā)，從而改善患者的臨床預(yù)后。