王文濤 張 華 劉興麗 相啟森 陳一凡 張艷艷

(鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院；食品生產(chǎn)與安全河南省協(xié)同創(chuàng)新中心；河南省冷鏈?zhǔn)称焚|(zhì)量安全控制重點實驗室，鄭州 450002)

花生是我國四大油料作物之一，國家統(tǒng)計局信息顯示2019年我國花生的產(chǎn)量達(dá)1 751.96萬t，占全球的39.4%，居世界首位。其中46%的花生用于榨油，產(chǎn)生大量的花生粕?；ㄉ筛缓鞍踪|(zhì)、維生素及礦物質(zhì)，其中蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)40%～55%，且氨基酸種類齊全，與動物蛋白相近，不含膽固醇，可消化性高，具有豐富的營養(yǎng)價值[1]。然而，由于花生蛋白經(jīng)過了高溫變性、機械壓榨等使得其口感和風(fēng)味也發(fā)生了改變，大部分被用作為畜禽類動物的飼料，產(chǎn)品附加值低[2]。因此，花生蛋白的改性和資源利用成為該領(lǐng)域的研究熱點[3-6]。

等離子體是由原子或原子團(tuán)失去電子后電離產(chǎn)生的帶電離子及中性粒子組成的離子化氣體狀物質(zhì)，被認(rèn)為是除固體、液體和氣體以外，物質(zhì)的“第四態(tài)”?？赏ㄟ^體系中大量的帶電粒子和活性粒子的作用實現(xiàn)對樣品的加工，是近年來迅速發(fā)展起來的新型加工技術(shù)，已經(jīng)在食品工業(yè)中顯現(xiàn)出了極大的應(yīng)用潛力，比如對食品體系中的有機大分子淀粉[7]和蛋白質(zhì)[8]進(jìn)行改性與功能性優(yōu)化。

本研究采用常壓等離子體射流處理花生蛋白，研究等離子體對花生蛋白功能特性、結(jié)構(gòu)和熱特性的影響，以期通過非化學(xué)途徑改性提高花生蛋白的功能特性，為其在食品領(lǐng)域的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

熱榨花生粕，金龍魚大豆油，溴化鉀光譜純，其他試劑均為分析純或優(yōu)級純。

1.2 儀器與設(shè)備

TS-PL200等離子體處理機，Q100差示掃描量熱儀(DSC)，Vertex 70 FTIR儀，LGJ-10冷凍干燥機，納米粒度儀。

1.3 實驗方法

1.3.1 花生蛋白懸浮液的制備及等離子體處理

將花生粕原料粉碎后，按照王章存等[9]方法提取蛋白，蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85.5%。稱取6.00 g花生蛋白，緩慢倒入200 mL去離子水，制成濃度為30 g/L的花生蛋白懸浮液。將花生蛋白懸浮液置于等離子體處理機的探頭(直徑5 mm)下，調(diào)節(jié)探頭到樣品的高度為15 mm，處理功率750 W，射頻25 kHz，氣體壓力為0.18 MPa的壓縮空氣，射流出口流速為30 L/min。在室溫下分別處理0、30、60、90、120和150 s，處理后的樣品冷凍干燥、研磨、收集，備用。

1.3.2 花生蛋白功能特性的測定

準(zhǔn)確稱取等離子體處理后的花生蛋白粉末0.4 g溶解于10 mL的去離子水中，參照邵悅等[10]方法進(jìn)行蛋白溶解性的測定。持水性和吸油性的測定參考文獻(xiàn)[10]中的方法進(jìn)行，起泡性及泡沫穩(wěn)定性、乳化性及乳化穩(wěn)定性的測定參考文獻(xiàn)[11]中的方法進(jìn)行。

1.3.3 粒徑分布

參考Crudden等[12]測定方法，稱取一定量的花生蛋白粉溶解于磷酸鹽緩沖溶液(0.05 mol/L，pH7.0)中，配置成0.2%的花生蛋白溶液，采用納米粒度儀測定花生蛋白溶液的粒徑分布。

1.3.4 花生蛋白結(jié)構(gòu)特性的測定

1.3.4.1 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)

參考Laemmli[13]的方法，SDS-PAGE在12%分離膠(pH8.6)和4%濃縮膠(pH 6.7)的垂直電泳板中進(jìn)行。非還原條件下，蛋白樣品溶解于0.01 mol/L Tris-HCl 緩沖液(pH 6.8，含10% SDS、10%甘油和0.1%溴酚藍(lán))中，沸水浴5 min后，8 000 r/min離心，取上清液上樣10 μL。還原條件下，在Tris-HCl 緩沖液中添加5% β-巰基乙醇。凝膠采用0.25%考馬斯亮藍(lán)(R-250)溶液染色，脫色后于凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行成像處理。

1.3.4.2 二級結(jié)構(gòu)

參考Li等[14]方法，稱取2 mg的花生蛋白粉，加入KBr充分研磨均勻后壓制成薄片，利用傅里葉紅外光譜對薄片進(jìn)行波段(4 000～400)cm-1掃描。

1.3.4.3 紫外光譜

稱取200 mg花生蛋白粉溶解于15 mL磷酸鹽緩沖溶液(0.05 mol/L, pH7.0)中，在4 670 g下離心10 min后留上清液。參考涂宗財?shù)萚15]方法，取0.5 mL蛋白上清液稀釋至12倍，進(jìn)行紫外光譜掃描。掃描參數(shù)：掃描范圍：200～400 nm，掃描速度：60 nm/min，光程1.0 cm，狹縫寬度0.2 nm。

1.3.5 花生蛋白熱特性的測定

參考Meng等[16]方法，采用差示掃描量熱法(DSC)分析花生蛋白的熱特性。稱取5 mg樣品置于鋁盒中，壓片密閉后進(jìn)行測定。設(shè)定N2速率為50 mL/min，在25～120 ℃進(jìn)行掃描，掃描速率為10 ℃/min，并選擇空密閉鋁盒作為參照。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有試驗結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n≥3)，通過SPPS 16.0、Origin 2018及PeakFit v4.12等軟件進(jìn)行處理和分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 等離子體對花生蛋白功能特性的影響

由表1可以看出，等離子體對花生蛋白的各項功能特性均產(chǎn)生了顯著變化。隨著處理時間的延長，花生蛋白的溶解性、持水性和吸油性不斷增大。與對照組相比，分別提高了278%、25.9%和73.7%。隨著等離子體處理時間的延長，花生蛋白的起泡性不斷降低，乳化性呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢，起泡穩(wěn)定性和乳化穩(wěn)定性不斷提高。等離子體處理可向生物大分子中引入大量的親水性功能基團(tuán)如氨基、羧基和羥基等[17]，使蛋白與水通過氫鍵的結(jié)合能力提高，持水性增加[18]。親水性基團(tuán)增多也可以提高花生蛋白的溶解性。Buβler等[19]也發(fā)現(xiàn)介質(zhì)阻擋放電等離子體處理提高了豌豆分離蛋白的持水、吸油能力和溶解性。對于蛋白的起泡性隨著等離子體處理時間的增加而降低，可能是因為大量親水基團(tuán)的增加，覆蓋了疏水基團(tuán)，影響蛋白分子與乳液的非極性相互作用，蛋白的兩性性質(zhì)減弱，對乳化性和起泡性產(chǎn)生不利影響[20]。

表1 等離子體處理不同時間對花生蛋白功能特性的影響

2.2 等離子體對花生蛋白粒徑分布的影響

圖1顯示，對照組中花生蛋白分子的粒徑大小主要為1 000～10 000 μm，占63.2%。隨著等離子體處理時間的延長，粒徑大的分子含量降低，而粒徑小的分子含量不斷升高。等離子體處理后，花生蛋白分子的粒徑大小主要分布在10～100 μm和100～1 000 μm。當(dāng)處理時間為150 s時，粒徑大小在0～10 μm的蛋白分子占9.6%，粒徑大小在10～100 μm的分子占46.1%，粒徑大小在100～1 000 μm的分子占32.8%，而粒徑大小在1 000～10 000 μm的分子由63.2%(對照)降至11.5%。在一定條件下等離子體處理可向生物大分子中引入大量的自由電子和帶電離子，可能使大分子蛋白解聚，蛋白分子粒徑變小。當(dāng)?shù)入x子體處理150 s時，粒徑大小在1 000～10 000 μm的蛋白分子含量增加，可能是由于等離子體處理破壞了花生蛋白分子的微觀結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致蛋白分子在水中時顆粒膨脹。

圖1 等離子體處理不同時間的花生蛋白粒徑分布

2.3 等離子體對花生蛋白結(jié)構(gòu)特性的影響

植物蛋白的功能特性與其相對分子質(zhì)量分布、亞基的大小、組成、空間特性及其熱穩(wěn)定性有密切的關(guān)系[21,22]。為了揭示等離子體對花生蛋白功能特性的作用機制，展開了等離子體對花生蛋白結(jié)構(gòu)的影響分析。

2.3.1 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)

在還原和非還原條件下，對等離子體處理了不同時間的花生蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析，研究等離子體處理對蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)聚集體的影響。通過對比圖2a與圖2b，發(fā)現(xiàn)非還原性條件下，在63～75 ku的蛋白亞基中存在著二硫鍵。非還原條件下，在17～25 ku和25～35 ku范圍內(nèi)的亞基條帶，在0～120 s內(nèi)隨著時間的延長不斷變深變寬。表明等離子體處理引入的大量的自由電子、帶電離子和親水基團(tuán)，可能破壞或降低了花生蛋白大分子的靜電作用和氫鍵等，使大相對分子質(zhì)量蛋白亞基降解為小相對分子質(zhì)量的蛋白亞基。等離子體處理150 s時，非還原條件下在63～75 ku范圍內(nèi)的亞基條帶顯著變淺變窄，17～25 ku范圍內(nèi)的亞基條帶顯著變深，還原條件下在35～48 ku和63～75 ku范圍內(nèi)的亞基條帶顯著變淺變窄，表明等離子處理150 s時破壞了大分子蛋白亞基(63～75 ku)內(nèi)以SS鍵為主的分子結(jié)構(gòu)作用力，也破壞了蛋白亞基(35～48 ku)中除二硫鍵外的作用力，從而降解成相對分子質(zhì)量更小的亞基(17～25 ku)。Mehr等[23]也通過電泳研究了大氣冷等離子體處理對草豌豆分離蛋白亞基的影響，得到了相同的結(jié)果，等離子體處理使交聯(lián)的蛋白質(zhì)聚合物或蛋白質(zhì)聚集體發(fā)生了破碎。

注：非還原性SDS-PAGE(a)和還原性SDS-PAGE(b)；泳道M為蛋白分子標(biāo)樣；自左向右依次是等離子體處理0、30、60、90、120、150 s的蛋白樣品。圖2 等離子體處理不同時間的花生蛋白亞基分布

2.3.2 二級結(jié)構(gòu)

表2中數(shù)據(jù)顯示，隨著等離子體處理時間的延長，α-螺旋含量呈先降低后上升的趨勢。β-折疊由42%逐漸下降至38.82%，而β-轉(zhuǎn)角由20.34%逐漸提高至23.74%，無規(guī)則卷曲含量無明顯變化。隨著處理時間的延長，α-螺旋的下降是因為等離子體處理破壞了氫鍵，原來有序結(jié)構(gòu)的次級鍵打開，空間有序度降低。當(dāng)處理時間大于90 s時，蛋白分子發(fā)生了局部聚集，從而α-螺旋含量上升。隨著等離子體處理時間的延長，β-折疊含量不斷降低，而β-轉(zhuǎn)角含量不斷提高，表明等離子體處理可能使β-折疊轉(zhuǎn)化為β-轉(zhuǎn)角，這與氫鍵的破環(huán)有關(guān)[24]。而β-轉(zhuǎn)角含量與蛋白質(zhì)水合性質(zhì)成正比，β-轉(zhuǎn)角含量上升，會提高蛋白質(zhì)水合性質(zhì)[25]，即持水性和溶解性增加，這與前面結(jié)果一致。季慧等[26]采用低溫等離子體處理花生分離蛋白，也得到相似的結(jié)果，蛋白的有序結(jié)構(gòu)被破壞，蛋白結(jié)構(gòu)由緊密變松散，親水性增強。

表2 等離子體處理不同時間的花生蛋白二級結(jié)構(gòu)

表3 等離子體處理不同時間的花生蛋白熱特性

圖3 等離子體處理不同時間的花生蛋白紫外光譜

2.3.3 紫外光譜

紫外吸收光譜可推斷蛋白質(zhì)分子三級構(gòu)象的變化，蛋白質(zhì)產(chǎn)生紫外吸收主要由于蛋白的發(fā)色基團(tuán)對紫外光的吸收作用[27]。等離子體處理不同時間的花生蛋白紫外光譜圖見圖3，等離子體處理30～60 s，蛋白的最大吸收波長(λmax)發(fā)生藍(lán)移，吸光度增加，說明蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，蛋白分子展開，更多發(fā)色基團(tuán)暴露。處理90～150 s，吸收峰下降，λmax紅移，說明等離子體處理使大分子蛋白解聚。

2.4 等離子體對花生蛋白熱特性的影響

變性溫度(Td)反映了蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性，與氨基酸組成和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象有關(guān)。如圖4所示，花生蛋白有兩個吸熱峰，分別為花生伴球蛋白和花生球蛋白，花生伴球蛋白肽鏈更易吸收熱量伸展變性，花生球蛋白相對伴球蛋白具有更高的熱穩(wěn)定性[28]。

變性焓值(ΔH)體現(xiàn)了未變性蛋白質(zhì)的比例和結(jié)構(gòu)的有序程度，也可以反映蛋白質(zhì)分子的聚集程度[29]。變性溫度范圍(ΔT)在一定程度代表著變性協(xié)同性。峰越窄，說明協(xié)同性越高[30]。如表3所示，伴球蛋白的變性焓值(ΔH)隨等離子體處理時間的延長逐漸提高，變性溫度范圍(ΔT)逐漸增大。而球蛋白的變性焓值隨等離子體處理時間的延長呈現(xiàn)下降的趨勢。表明花生蛋白在等離子體處理后，花生伴球蛋白具有更多有序的空間構(gòu)象以及維持空間構(gòu)象所需要的疏水鍵、二硫鍵和離子鍵，變性協(xié)同性降低。相反地，花生球蛋白的空間構(gòu)象有序度降低。

圖4 等離子體處理不同時間的花生蛋白DSC曲線

3 結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)，花生蛋白在等離子體處理150 s后，其溶解性、持水性和吸油性均顯著(P<0.05)提高。花生蛋白分子受到等離子體作用，蛋白大分子聚合物解聚為小分子物質(zhì)，分子粒徑變小，二級結(jié)構(gòu)中有序結(jié)構(gòu)被破壞，蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生變化。DSC結(jié)果表明，與對照組相比，等離子體處理后的花生伴球蛋白具有更多有序的空間構(gòu)象以及維持空間構(gòu)象所需要的化學(xué)作用力，變性協(xié)同性降低。相反，等離子體處理降低了花生球蛋白的空間構(gòu)象有序度?？偟膩碚f，等離子體對花生蛋白的功能、結(jié)構(gòu)和熱力學(xué)性質(zhì)具有明顯的改善作用，在蛋白改性方面體現(xiàn)出巨大的價值。