蔣新龍 吳小剛 郭葉瑩 陳品品 葉小霞 蔣益花

(浙江樹人大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，杭州 310015)

鞣花酸是廣泛存在于各種軟果、堅果等植物組織中的天然多酚類物質(zhì)，是一種多酚二內(nèi)酯，是沒食子酸的二聚衍生物，呈反式?jīng)]食子酸單寧結(jié)構(gòu)[1]，具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抗菌、皮膚增白等多種生物活性[2-4]。但由于鞣花酸分子的剛性平面結(jié)構(gòu)，在水、脂質(zhì)介質(zhì)中均難以溶解，生物利用度低，嚴(yán)重制約了它的應(yīng)用范圍[5，6]。

為了克服鞣花酸水溶性差、藥效短暫等問題，許多國內(nèi)外科研工作者紛紛運用各種技術(shù)進(jìn)行研究。馬晶等[7]采用海藻酸鈉/殼聚糖對石榴皮鞣花酸進(jìn)行包裹制備成復(fù)合物微球，發(fā)現(xiàn)把石榴皮鞣花酸做成海藻酸鈉/殼聚糖微球，可以控制所需鞣花酸的緩慢釋放，能夠保證微球具有更好的生物相容性；范高福等[8]采用以羥丙基-β-環(huán)糊精為包合材料，分別采用溶液研磨法、超聲法、攪拌-超聲法制備石榴鞣花酸-羥丙基-β-環(huán)糊精包合物，其包合物的表觀溶解度提高了約10倍；山田泰司等[9]發(fā)現(xiàn)將含有番石榴葉提取物并且在固體成分中含有1～5%的游離鞣花酸的原料與水性介質(zhì)混合，可以制備在水中的溶解性優(yōu)異的鞣花酸組合物；山田泰司等[10]還發(fā)現(xiàn)將水溶性多酚類混合于難水溶性多酚類通過高溫處理可以提高難水溶性多酚類溶于水中的溶解濃度；趙修華等[11]用反溶劑法制備了水溶性較好的鞣花酸超微粉；鄭丹丹等[12]將鞣花酸溶于乳劑基質(zhì)中制備成鞣花酸自微乳藥物，提高了鞣花酸的溶解度和生物利用度。許多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，多酚類化合物與磷脂之間具有特殊的親和力，通過制備磷脂復(fù)合物，可以改善多酚類化合的脂溶性[13-17]。本團(tuán)隊也制備了槐花黃酮磷脂復(fù)合物，發(fā)現(xiàn)該復(fù)合物在水和在正辛醇中溶解性都有明顯改善[18]，但鞣花酸磷脂復(fù)合物制備以提高鞣花酸的溶解度和生物活性鮮有報道。

本研究以石榴皮鞣花酸為原料采用超聲-微波協(xié)同技術(shù)制備鞣花酸磷脂復(fù)合物，利用正交實驗優(yōu)化制備工藝條件，并初步探索該復(fù)合物的理化性質(zhì)及其對植物油抗氧化作用，為開拓石榴皮鞣花酸的應(yīng)用范圍提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

石榴皮鞣花酸(90%)、植物油為新鮮精煉核桃油和葡萄籽油、鞣花酸(476-66-4標(biāo)準(zhǔn)品，98%)、大豆卵磷脂(磷脂酸PA4-7，磷脂酰肌醇PI12-15，磷脂酰乙醇胺PE18-22，磷脂酰膽堿PC22-25)；其他試劑均為分析純。

UV-1600型紫外可見光譜儀，UV2450紫外可見分光光度計，TENSOR27紅外光譜儀，CW-2000型超聲-微波協(xié)同萃取/反應(yīng)儀，F(xiàn)W100型高速萬能粉碎機(jī)。

1.2 實驗方法

1.2.1 石榴皮鞣花酸的含量測定

鞣花酸含量的測定：采用紫外分光光度法測定鞣花酸得率[19]。精確稱取0.01 g鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)品，在常溫攪動下滴加4 mL 0.1 mol/L NaOH 溶液溶解，再用水定容至100 mL配制成100 μg/mL鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。將鞣花酸標(biāo)液稀釋至一定濃度，在200～400 nm波長掃描，確定278 nm為最大吸收波長。再依據(jù)鄧小莉等[18]方法制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到鞣花酸質(zhì)量濃度C(μg/mL)與吸光度A之間的關(guān)系式為：A=0.062 6C-0.009 6，其線性范圍為0.00～10.00 μg/mL，相關(guān)系數(shù)R2=0.996 6。待測樣品同法在278 nm處測定吸光值，根據(jù)回歸方程計算鞣花酸含量。

1.2.2 鞣花酸磷脂復(fù)合物制備實驗

以石榴皮鞣花酸和大豆卵磷脂為原料，采用超聲-微波協(xié)同技術(shù)，參考制備槐花黃酮磷脂復(fù)合物方法[18]，制備鞣花酸磷脂復(fù)合物。以鞣花酸與磷脂的復(fù)合率為評價指標(biāo)。

單因素實驗：固定初始條件其他量不變，采用控制變量法，考察投料比(磷脂與鞣花酸的質(zhì)量比)、鞣花酸質(zhì)量濃度、微波功率和反應(yīng)時間等因素對復(fù)合率的影響。超聲條件固定(超聲輸出功率50 W，頻率40 kHz)，分別設(shè)置鞣花酸質(zhì)量濃度梯度1、3、5、7、10 mg/mL；投料比梯度1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6；微波功率梯度100、150、200、250、300 W；反應(yīng)時間梯度20、25、30、35、40 min。

正交優(yōu)化實驗：在單因素實驗的基礎(chǔ)上，選擇鞣花酸質(zhì)量濃度、投料比、微波功率和反應(yīng)時間4個因素為主要變量，以復(fù)合率為指標(biāo)，采用 L9(43)進(jìn)行正交實驗。

1.2.2 鞣花酸磷脂復(fù)合物的理化性質(zhì)實驗

光譜分析：將一定量的磷脂、鞣花酸、鞣花酸磷脂復(fù)合物分別溶于無水乙醇溶液中，制成一定濃度的乙醇溶液，將3種溶液進(jìn)行紫外全波長掃描；采用KBr壓片法分別對磷脂、鞣花酸磷脂復(fù)合物在400～4 000 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行紅外掃描。

溶解度的測定：取20 mL溶劑(正辛醇、水)，分別加入過量的鞣花酸或鞣花酸磷脂復(fù)合物于室溫下攪拌6 h，取上清液過0.45 μm濾膜，測定其上清液濃度，計算溶解度。

1.2.3 鞣花酸磷脂復(fù)合物對植物油抗氧化影響實驗

1.2.3.1 鞣花酸磷脂復(fù)合物植物油樣品液的制備

鞣花酸磷脂復(fù)合物油母液的制備：考慮鞣花酸磷脂復(fù)合物的脂溶性不強(qiáng)，根據(jù)GB 2760—2014《國家食品安全標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》和褚盼盼等[20]研究方法，將4%聚甘油酯加入植物油中，混合均勻，再加入0.1%的鞣花酸磷脂復(fù)合物，均質(zhì)化處理10 min(1 000 r/min)，即得鞣花酸磷脂復(fù)合物油母液。

參照 GB 2760—2014中一般在植物油脂中加入天然抗氧化劑用量，本實驗鞣花酸磷脂復(fù)合物濃度梯度設(shè)置為 0.01%～0.06%。按設(shè)計所需的質(zhì)量分?jǐn)?shù)將適量的鞣花酸磷脂復(fù)合物母液添加到植物油中，磁力攪拌至鞣花酸磷脂復(fù)合物母液與植物油充分混勻，得到系列鞣花酸磷脂復(fù)合物植物油樣。

以油脂的過氧化值為衡量指標(biāo)[21]，用所得到的系列鞣花酸磷脂復(fù)合物植物油樣，采用GB/T5538—2005法測定過氧化值，分別測定常溫下和98 ℃加熱 6 h 后的POV值，根據(jù)加熱后過氧化值的相對大小，確定最佳添加量。

1.2.3.2 植物油表觀活化能測定

采用Schaal烘箱法[22]測定樣品POV隨貯藏溫度、時間的變化。將最佳鞣花酸磷脂復(fù)合物添加量的植物油置于碘量瓶中密封，分別測定每隔2 d(共10 d)的置于45、55、65 ℃的電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中的樣品POV0。同法空白參照。

植物油的氧化、添加促氧化劑和抗氧化劑后植物油的氧化都符合一階動力學(xué)反應(yīng)[23-25]。本研究根據(jù)一級反應(yīng)動力學(xué)方程ln(POV/POV0)=-kt，對加熱時間t和POV進(jìn)行擬合，得到相關(guān)系數(shù)和回歸方程，求得反應(yīng)速率常數(shù)k。根據(jù)Arrhenius經(jīng)驗公式(lnk=lnk0-Ea/RT)，用lnk對1/T作圖，得到一條斜率為-Ea/R的直線，由斜率求得表觀活化能Ea[18,23]。同法空白參照。

1.3 統(tǒng)計方法及分析軟件

指標(biāo)均重復(fù)測定3次并取平均值，利用Ori gin8軟件作圖，應(yīng)用SPSS20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，用Duncan多重比較(SSR法)檢驗各處理平均數(shù)之間的差異顯著性(P<0.05)。

2 結(jié)果與討論

2.1 鞣花酸磷脂復(fù)合物制備

2.1.1 單因素實驗

投料比的確定：投料比對復(fù)合率有較大的影響，復(fù)合率隨體系中磷脂比例的增加而增加。圖1可知，在磷脂∶石榴皮鞣花酸質(zhì)量比為3∶1時，磷脂復(fù)合物的復(fù)合率最高。說明當(dāng)磷脂∶石榴皮鞣花酸質(zhì)量比為3∶1時，二者的相互作用最充分。

鞣花酸濃度的確定：鞣花酸濃度對復(fù)合率有較大影響。因為鞣花酸在溶液中須經(jīng)碰撞才能發(fā)生反應(yīng)，合適的濃度有利于反應(yīng)的進(jìn)行[26]。鞣花酸濃度較小，二者相互作用不充分；鞣花酸濃度較大，鞣花酸在溶液中也不能完全碰撞發(fā)生反應(yīng)。圖1可知，在反應(yīng)物濃度為1～5 mg/mL時，磷脂復(fù)合物的復(fù)合率隨著鞣花酸濃度的增大而增大，當(dāng)反應(yīng)物濃度為5 mg/mL時，磷脂復(fù)合物的復(fù)合率最高。

反應(yīng)時間的確定：反應(yīng)時間對復(fù)合率有較大影響。反應(yīng)時間過短，反應(yīng)不完全；反應(yīng)時間過長，微波的熱效應(yīng)會使鞣花酸產(chǎn)生降解。圖1可知，在反應(yīng)時間為20～30 min時，磷脂復(fù)合物的復(fù)合率逐漸增大，當(dāng)反應(yīng)30 min時，磷脂復(fù)合物的復(fù)合率最高。

微波功率的確定：超聲-微波協(xié)同技術(shù)的最大優(yōu)勢在于能同時充分利用超聲波的空化作用以及微波的高能作用和熱效應(yīng)。微波功率增加，鞣花酸和磷脂分子的熱力學(xué)活動趨于活躍。但微波功率過大，微波的熱效應(yīng)會使鞣花酸產(chǎn)生降解；溫度過高也不利于磷脂復(fù)合物的穩(wěn)定。圖1可知，在微波功率為200 W時，磷脂復(fù)合物的復(fù)合率達(dá)到最大值。

圖1 鞣花酸磷脂復(fù)合物制備條件單因素實驗結(jié)果

2.1.2 正交實驗結(jié)果及分析

表1和表2分別為正交實驗的因子與水平及結(jié)果。

表1 4因子在3水平正交實驗的因子與水平

表2 正交實驗設(shè)計及結(jié)果

表3 方差分析表

由表2極差R表明，影響復(fù)合率的因素主次依次排列為：鞣花酸質(zhì)量濃度(A)>反應(yīng)時間(C)>微波功率(D)>投料比(B)。由表3方差分析表明，對復(fù)合率的影響主次依次排列為：鞣花酸質(zhì)量濃度(A)>反應(yīng)時間(C)>微波功率(D)>投料比(B)。極差分析和方差分析在復(fù)合率影響主次排列上完全一致。表3還表明，鞣花酸質(zhì)量濃度(A)和反應(yīng)時間(C)對復(fù)合率的影響顯著，其他則不顯著。直觀分析，實驗的最優(yōu)水平組合為A1B3C3D3；根據(jù)每個因素K1、K2、K3實驗的最優(yōu)水平組合為A1B2C3D3。因為投料比(B)1∶2與1∶3、1∶4差異顯著，而投料比1∶3、1∶4之間差異不顯著，綜合分析提取成本和復(fù)合率，確定最佳工藝條件A1B2C3D3，即鞣花酸質(zhì)量濃度3 mg/mL，投料比1∶3 g/g，反應(yīng)時間35 min，微波功率300 W。因為最佳工藝條件A1B2C3D3在正交實驗中未出現(xiàn)，因此根據(jù)最佳工藝條件進(jìn)行工藝驗證實驗，平行3次，復(fù)合率分別為91.83%、91.79%、91.78%，平均91.80%，高于正交表中其他組合的復(fù)合率，由此證明正交實驗結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

2.2 理化性質(zhì)實驗

2.2.1 光譜分析

紫外掃描如圖2所示。卵磷脂沒有共軛結(jié)構(gòu)，卵磷脂只有在215 nm處有紫外最大吸收峰出現(xiàn)；鞣花酸在 265 nm、370 nm處有強(qiáng)烈吸收峰，這是由于鞣花酸具有共軛不飽和結(jié)構(gòu)所致，與單書香[27]等學(xué)者研究結(jié)果較一致；鞣花酸磷脂復(fù)合物與鞣花酸在紫外圖譜中沒有顯著差異，只不過鞣花酸和磷脂的復(fù)合，磷脂的極性基團(tuán)與鞣花酸發(fā)生了較強(qiáng)的非共價鍵相互作用[28]，因此紫外吸收光譜特征有所改變，表現(xiàn)為最大吸收波長的少許位移。鞣花酸與卵磷脂在形成復(fù)合物的過程中僅僅是通過非共價結(jié)合，沒有產(chǎn)生新的共軛結(jié)構(gòu)。

圖2 紫外吸收光譜圖

圖3 紅外吸收光譜圖

而卵磷脂具有羥基(3 358 cm-1)、亞甲基(2 926 cm-1)和羰基(1 740 cm-1)的特征吸收峰。鞣花酸和鞣花酸磷脂復(fù)合物的吸收光譜大致相同，復(fù)合物在掃描范圍內(nèi)吸收峰只出現(xiàn)少許位移并沒有出現(xiàn)新的吸收峰。鞣花酸在 1 000 cm-1到 1 500 cm-1之間的大部分特征吸收特征峰變化比較大，表明鞣花酸和磷脂在形成復(fù)合物的過程中不是簡單的一種混合狀態(tài)，鞣花酸與卵磷脂通過非共價鍵發(fā)生了相互作用。

經(jīng)光譜分析初步看出在復(fù)合物中并無新的化學(xué)鍵生成。從結(jié)構(gòu)上看，磷脂帶有正電性的季胺氮，鞣花酸酚羥基具有負(fù)電性的氧，兩者可產(chǎn)生弱的偶極-偶極相互作用力而使兩分子結(jié)合[30]，形成鞣花酸磷脂復(fù)合物。

2.2.2 溶解度測定結(jié)果

鞣花酸在25 ℃水中溶解度為 0.606 4 mg/mL；而鞣花酸卵磷脂復(fù)合物在水中的溶解度增加至0.849 2 mg/mL，水溶性增加了1.4倍。鞣花酸在 25 ℃正辛醇中的溶解度為 0.441 9 mg/mL；而鞣花酸卵磷脂復(fù)合物在正辛醇中的溶解度增加至0.917 9 mg/mL，脂溶性增加了2.1倍。相對槐花黃酮磷脂復(fù)合物對溶解性的影響(水溶性增加了19.1倍，脂溶性增加了6.4倍)[18]，鞣花酸磷脂復(fù)合物對溶解性的改善甚微，可能還是因為鞣花酸分子的剛性平面結(jié)構(gòu)起了決定性的作用[5]。

2.3 石榴皮鞣花酸磷脂復(fù)合物對油樣的抗氧化效果

2.3.1 濃度對石榴皮鞣花酸磷脂復(fù)合物抗油脂氧化效果的影響

圖4表明，添加石榴皮鞣花酸磷脂復(fù)合物后，隨著其添加量的增加，植物油的過氧化值逐漸降低，說明石榴皮鞣花酸磷脂復(fù)合物對葡萄籽油和核桃油具有抗氧化作用，且對葡萄籽油和核桃油的抗氧化能力有一定的量效關(guān)系。圖4表明，抗油脂氧化效果最好的是0.06%石榴皮鞣花酸磷脂復(fù)合物，用以進(jìn)行Schaal烘箱加速氧化實驗。

圖4 濃度對石榴皮鞣花酸抗油脂氧化效果影響

表4 植物油過氧化值的回歸方程及活化能參數(shù)

2.3.2 溫度對石榴皮鞣花酸磷脂復(fù)合物抗油脂氧化效果的影響

由圖5可知，在45、55、65 ℃時，隨著溫度升高和加熱時間的延長，植物油的過氧化值逐漸升高，氧化速度加快。鞣花酸磷脂復(fù)合物(EA-PC)、鞣花酸(EA)對葡萄籽油和核桃油的過氧化值變化趨勢大體相同。

圖5 植物油抗氧化穩(wěn)定性在不同溫度、時間下的變化

由表4可知，根據(jù)1.2.3.2方法得到過氧化值的回歸方程，回歸系數(shù)R>0.97，擬合度高。植物油的氧化反應(yīng)屬于一級反應(yīng)，與其他學(xué)者的研究結(jié)果一致[23-25]。比較添加鞣花酸、鞣花酸復(fù)合物及空白對照的植物油的活化能，活化能的相對大小依次為：鞣花酸復(fù)合物(EA-PC)>鞣花酸(EA)>不添加，而且添加鞣花酸復(fù)合物比添加鞣花酸和不添加升高明顯。說明添加石榴皮鞣花酸磷脂復(fù)合物能提高相應(yīng)植物油的抗氧化性，實驗結(jié)果與槐花黃酮磷脂復(fù)合物對植物油的抗氧化性影響相似[18]。其主要原因也是因為鞣花酸磷脂復(fù)合物所含可提供氫原子的酚類結(jié)構(gòu)，中斷自由基反應(yīng)[31]。

表4同樣表明，表觀活化能增大百分率，核桃油比葡萄籽油增大明顯，說明鞣花酸對核桃油的抗油脂氧化作用比葡萄籽油更好，實驗結(jié)果與槐花黃酮磷脂復(fù)合物相似[18]。比較鞣花酸和槐花黃酮，鞣花酸對核桃油的抗油脂氧化作用比槐花黃酮更好。究其原因，核桃油與葡萄籽油含有不同的脂肪酸成分[32]，鞣花酸和槐花黃酮也有不同的酚類結(jié)構(gòu)，當(dāng)然還有含多不飽和脂肪酸油脂的氧化敏感性較高[32]等原因。

3 結(jié)論

以石榴皮鞣花酸為原料，以復(fù)合率為衡量指標(biāo)，采用超聲-微波協(xié)同技術(shù)，利用正交設(shè)計對制備鞣花酸磷脂復(fù)合物工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。最佳制備工藝為：無水乙醇為反應(yīng)溶劑，鞣花酸質(zhì)量濃度3 mg/mL，磷脂與鞣花酸的投料質(zhì)量比3∶1，反應(yīng)時間35 min，微波功率300 W，此制備條件下，鞣花酸磷脂復(fù)合物復(fù)合率為91.80%。

光譜分析表明，鞣花酸與卵磷脂不是簡單的一種混合狀態(tài)，在形成復(fù)合物的過程中僅僅是通過非共價結(jié)合。磷脂復(fù)合物可改善鞣花酸的溶解性能，脂溶性增加了2.1倍，水溶性增加了1.4倍，改善溶解性能的效果不顯著。

抗氧化實驗結(jié)果表明，添加鞣花酸磷脂復(fù)合物后植物油的氧化符合一階動力學(xué)反應(yīng)。添加鞣花酸磷脂復(fù)合物后核桃油和葡萄籽油的氧化反應(yīng)活化能都增大，核桃油表觀活化能增大百分率比葡萄籽油大，鞣花酸磷脂復(fù)合物對核桃油的抗油脂氧化效果更好。