林維斌，陳祥榮，曾以勒，徐朝陽，陳峻嚴(yán)

（福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)外科，泉州 362000）

小膠質(zhì)細(xì)胞在創(chuàng)傷性腦損傷（traumatic brain injury, TBI）后繼發(fā)病理生理過程中發(fā)揮著神經(jīng)損傷與保護(hù)雙重作用，而這一雙重作用與活化的小膠質(zhì)細(xì)胞亞型密切相關(guān)[1]。根據(jù)分泌細(xì)胞因子的不同，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞可分為致炎的M1型和抑炎的M2型[1]。促使小膠質(zhì)細(xì)胞 M1向 M2亞型極化，有效抑制TBI后小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的早期炎癥反應(yīng)，可改善傷后神經(jīng)功能[2‐5]。高遷移率族蛋白B1（high mobility group box 1，HMGB1）是一種重要的炎性介質(zhì)，其可通過去乙?；{(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞極化，在神經(jīng)炎癥反應(yīng)中發(fā)揮極為重要的作用[6‐8]。進(jìn)一步深入探討HMGB1通路調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞極化對(duì)TBI后神經(jīng)炎癥反應(yīng)的影響，有助于為TBI后繼發(fā)性顱腦損傷的治療尋找可能的干預(yù)靶點(diǎn)。甘草酸是常用的HMGB1拮抗劑，其可通過直接結(jié)合HMGB1抑制其活性和釋放，降低HMGB1表達(dá)發(fā)揮抗炎作用[9]。本研究擬利用大鼠TBI模型，選用甘草酸作為拮抗劑探討HMGB1通路對(duì)大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后神經(jīng)炎癥的影響。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)材料

HMGB1、膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）購置于美國CST公司；核轉(zhuǎn)錄因子‐κB（NF‐kB）、離子鈣結(jié)合適配器分子‐1（Iba‐1）、CD16、CD206購置于美國Abcam公司；TNF‐α、IL‐1β，IL‐6和IFN‐γ購置于美國Signalway Antibody公司；HMGB1拮抗劑甘草酸（glycyrrhizic acid，GL）購置于美國Sigma公司。

2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

成年健康雄性清潔級(jí)SD大鼠購置于福建醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，共96只，體重250 g左右，根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，利用隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組（Sham）、腦損傷組（TBI）、腦損傷+溶劑組（TBI+Vehicle）、腦損傷+ HMGB1拮抗劑組（TBI+GL），按模型制作后第1、3、7、14 d 4個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)4個(gè)亞組，每亞組均為6只。該實(shí)驗(yàn)經(jīng)福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并在其監(jiān)督下執(zhí)行。

3 TBI模型建立及動(dòng)物處理

根據(jù)既往實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭谱鱗10‐12]，TBI大鼠模型采用Feeney自由落體撞擊法：戊巴比妥鈉腹腔麻醉(45 mg/kg)后，右側(cè)冠狀縫后2 mm、旁中線2 mm處作為打擊部位，刀片切開頭皮至骨面，高速磨鉆磨出直徑5 mm的骨孔，注意誤穿破硬膜，取30 g重的擊錘至20 cm高處自由墜落沖擊撞桿致大鼠中型顱腦損傷，棉球壓迫止血，骨蠟封閉骨孔，縫合頭皮。Sham組大鼠僅開骨窗不予撞擊。TBI+GL組大鼠于模型建立后30 min腹腔注射GL（劑量50 mg/kg），每日一次，連續(xù)干預(yù)3 d。其余各組同一時(shí)間也給予等劑量溶劑二甲基亞砜注射。

4 神經(jīng)功能損傷的評(píng)定

采用改良神經(jīng)功能評(píng)分表（modified neurological severity scores, mNSS）對(duì)大鼠傷后第1、3、7、14 d神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)價(jià)[12]，綜合評(píng)價(jià)大鼠運(yùn)動(dòng)（肌肉狀態(tài)、異常動(dòng)作）、感覺（視覺、觸覺、平衡覺）和反射反應(yīng)。當(dāng)大鼠無法正確完成某項(xiàng)指令動(dòng)作或所測試的反射消失時(shí)即為陽性結(jié)果。測試得分越高代表神經(jīng)功能損傷程度越重。

5 Nissl染色檢測神經(jīng)元凋亡

標(biāo)本組織取自腦挫裂傷灶邊緣約2 mm腦挫傷皮質(zhì)，甲醛固定后以石蠟包埋，5 μm切片后經(jīng)二甲苯脫蠟，無水乙醇、90%乙醇、70%乙醇、蒸餾水梯度水化，檸檬酸緩沖液煮沸法修復(fù)抗原。常溫下尼氏染色液染色10 min，蒸餾水沖洗后95%酒精脫水，二甲苯處理后封片。細(xì)胞調(diào)亡陽性：細(xì)胞胞體縮小、形狀不規(guī)則、呈斑駁的藍(lán)紫色。采取雙盲法方法計(jì)數(shù)，在光學(xué)顯微鏡（20物鏡）下觀察腦損傷灶周圍調(diào)亡神經(jīng)元，隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)神經(jīng)元凋亡率用于統(tǒng)計(jì)分析。

6 免疫熒光染色

標(biāo)本組織取自腦挫裂傷灶邊緣約2 mm腦挫傷皮質(zhì)，甲醛固定后以石蠟包埋，5 μm切片后經(jīng)二甲苯脫蠟，無水乙醇、90%乙醇、70%乙醇、蒸餾水梯度水化，檸檬酸緩沖液煮沸法修復(fù)抗原。羊血清封閉，滴入一抗Iba‐1抗體（1:100），CD16抗體（1:200），CD206抗體（1:200），置入保持潮濕的染色暗盒內(nèi)，孵育過夜，PBS沖洗3遍，加1:100稀釋的FITC標(biāo)記的羊抗兔或羊抗鼠二抗IgG，孵育30 min后，DAPI（1:3000）染核，封片，熒光顯微鏡（×200）觀察染色結(jié)果，拍照。

7 酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）檢測

在大鼠干預(yù)后各時(shí)間點(diǎn)，抽取鼠尾靜脈血約10 ml，離心5 min（10 000 r/min，離心半徑13.5 cm）取上清液。參照ELISA試劑盒檢測流程測定TNF‐α、IL‐1β、IL‐6、IFN‐γ和HMGB1血清濃度。檢測因子與單抗結(jié)合后，加入生物素化的抗大鼠抗體形成免疫復(fù)合物，測量OD值。參照標(biāo)準(zhǔn)品換算成相應(yīng)濃度值，統(tǒng)一匯總表格并統(tǒng)計(jì)分析。

8 Western blot檢測

取骨窗邊緣約2 mm腦挫傷皮質(zhì)置于‐4°冰上剪碎片后進(jìn)行裂解，蛋白定量，煮沸變性，離心，提取上清液，‐20℃保存?zhèn)溆?。提取蛋白量?5 μg，經(jīng)SDS‐PSGE電泳分離蛋白,轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，于含100 g/L脫脂奶粉液中室溫封閉2 h。加入一抗（抗IBa：1:1000；抗CD206：1:600；抗CD16：1:400；抗GAPDH：1:5000）置于4℃下過夜，加入HRP 偶聯(lián)的山羊抗兔二抗室溫孵育1 h，用 ECL 發(fā)光液顯像，拍照，用Iamge Quant Las 4000 mini軟件（GE公司，美國）分析測定條帶光密度值，以目的蛋白條帶與內(nèi)參蛋白GAPDH條帶光密度值的比值代表目的蛋白相對(duì)水平。

9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析,單因素方差分析進(jìn)行組間比較，進(jìn)一步采用LSD‐t檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 特異性抑制HMGB1減少TBI后神經(jīng)元凋亡和神經(jīng)功能損傷

Nissl染色顯示：正常神經(jīng)元胞體形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，核仁清晰；凋亡神經(jīng)元細(xì)胞胞體縮小、形狀不規(guī)則、核固縮深染、呈斑駁的藍(lán)紫色。TBI組各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)元凋亡率比Sham組均明顯升高；而TBI+GL組大鼠神經(jīng)元凋亡率比TBI組顯著降低（圖1A、B）。

mNSS評(píng)分結(jié)果顯示： TBI組各時(shí)間點(diǎn)mNSS評(píng)分比Sham組明顯升高；而TBI+ GL組神經(jīng)功能損害評(píng)分比TBI組明顯下降，神經(jīng)功能明顯改善（圖1C）。

圖1 抑制HMGB1對(duì)TBI后神經(jīng)元凋亡和神經(jīng)功能的影響。A，抑制HMGB1對(duì)TBI后神經(jīng)元凋亡的代表性Nissl染色檢測（比例尺，50 μm）；B，神經(jīng)元凋亡統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。C，抑制HMGB1對(duì)TBI后神經(jīng)功能影響的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。**P＜0.05；ns P＞0.05Fig.1 Effect of HMGB1 inhibition on neuronal apoptosis and neurological function after TBI in rat. A, representative Nissl staining result of the effect of HMGB1 inhibition on neuronal apoptosis after TBI (scale bar, 50 μm); B, statistical analysis of neuronal apoptosis rate; C, statistical analysis of effect of HMGB1 inhibition on neurological function after TBI; **P＜0.05; ns P＞0.05

2 抑制HMGB1減少大腦皮層損傷區(qū)域小膠質(zhì)細(xì)胞上HMGB1表達(dá)

免疫熒光雙染顯示：相對(duì)于Sham組，TBI組皮層損傷區(qū)域Iba‐1陽性小膠質(zhì)細(xì)胞上HMGB1陽性率明顯增多；HMGB1特異性拮抗劑甘草酸干預(yù)后，相對(duì)于TBI組，TBI+GL組腦皮層損傷區(qū)域Iba‐1陽性小膠質(zhì)細(xì)胞上HMGB1陽性率明顯減少（圖2）。

圖2 抑制HMGB1對(duì)大鼠TBI后小膠質(zhì)細(xì)胞HMGB1表達(dá)的影響。A，抑制HMGB1對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞HMGB1表達(dá)影響的代表性免疫熒光雙染圖片；比例尺，50 μm。B，Iba‐1和HMGB1共表達(dá)小膠質(zhì)細(xì)胞統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；**P＜0.05；ns P＞0.05Fig. 2 Effect of HMGB1 inhibition on expression of HMGB1 in microglia after TBI. A, representative images of double immunofluorescent staining for the effect of HMGB1 inhibition on expression of HMGB1 in rat microglia; scale bar, 50 μm; B, statistical analysis of microglia with co‐expression of Iba‐1 and HMGB1; **P＜0.05; ns P＞0.05

3 抑制HMGB1促使小膠質(zhì)細(xì)胞M1向M2亞型極化

免疫熒光雙染結(jié)果顯示：相對(duì)于Sham組，TBI組腦皮質(zhì)CD16+ M1型小膠質(zhì)細(xì)胞明顯增多；與TBI組比較，TBI+GL組CD16+ M1型小膠質(zhì)細(xì)胞減少，而CD206+ M2型小膠質(zhì)細(xì)胞明顯增多，即小膠質(zhì)細(xì)胞由M1向M2亞型極化（圖3A、B）。

Western blot檢測同樣顯示：TBI組腦皮層Iba‐1、CD16水平比Sham組明顯升高，TBI+GL組Iba‐1、CD16水平比TBI組明顯降低，CD206水平顯著升高（圖3C、D）。

圖3 HMGB1抑制對(duì)TBI后腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞M1/M2亞型極化的影響。A，M1和M2型小膠質(zhì)細(xì)胞的免疫熒光雙染分析（比例尺，50 μm）；B，M1和M2型小膠質(zhì)細(xì)胞比例的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。C，腦內(nèi)Iba‐1、CD16和CD206水平的Western blot檢測；D，Iba‐1、CD16和CD206水平的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。**P＜0.05；ns P＞0.05Fig.3 Effect of HMGB1 inhibition on the polarization of M1/M2 subtypes of microglia in rat brain after TBI. A, double immunofluorescent staining analysis of M1 and M2 subtypes of the microglia (scale bar, 50 μm); B, statistical analysis of M1 and M2 subtypes of the microglia; C, Western blotting detection for levels of Iba‐1, CD16 and CD206 in the brains; D, statistical analysis of levels of Iba‐1, CD16 and CD206; **P＜0.05; ns P＞0.05

4 抑制HMGB1減少大鼠TBI后炎癥因子的水平

ELISA檢測顯示：與Sham組比較，TBI組傷后第3 d血清TNF‐α、IL‐1β，IL‐6和IFN‐γ水平升高；與TBI組比較，TBI+GL組傷后大鼠血清炎癥因子水平明顯下降（圖4）。

圖4 抑制HMGB1對(duì)大鼠TBI后血清炎癥因子水平影響的ELISA檢測。 **P＜0.05；ns P＞0.05Fig.4 ELISA detection for the effect of HMGB1 inhibi‐tion on levels of TBI‐induced inflammatory factors in rat sera. **P＜0.05; ns P＞0.05

討 論

眾所周知，TBI引起繼發(fā)性損傷是包括氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等多因素綜合作用的結(jié)果。作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)固有免疫反應(yīng)的主要介質(zhì)，小膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)炎癥中發(fā)揮重要作用。以往研究發(fā)現(xiàn)在TBI后，HMGB1作為重要炎性介質(zhì)參與調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞極化及介導(dǎo)炎癥的病理過程[7,8]，但作用機(jī)制尚不完全清楚。本研究旨在探討HMGB1與調(diào)控大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后小膠質(zhì)細(xì)胞極化及其神經(jīng)炎癥反應(yīng)可能的作用機(jī)制，為顱腦損傷治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。研究結(jié)果顯示：在TBI后HMGB1通路參與調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞極化及介導(dǎo)神經(jīng)炎癥的過程，特異性抑制HMGB1可減少腦損傷皮層小膠質(zhì)細(xì)胞上HMGB1陽性表達(dá)，并促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞M1亞型向M2亞型極化,減輕神經(jīng)炎癥反應(yīng)，進(jìn)而改善傷后神經(jīng)功能。機(jī)制可能與其調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞向M2亞型極化發(fā)揮抑炎作用有關(guān)。

HMGB1作為一種晚期重要炎性介質(zhì)已被證實(shí)在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[6‐8]。甘草酸是常用的HMGB1拮抗劑，其原理是通過直接結(jié)合HMGB1抑制其活性和釋放，降低HMGB1表達(dá)發(fā)揮抗炎作用[9]。本實(shí)驗(yàn)免疫熒光雙染檢測小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物（Iba‐1+）及HMGB1表達(dá)的結(jié)果顯示TBI大鼠腦損傷灶皮層Iba‐1染色陽性的小膠質(zhì)細(xì)胞上HMGB1共表達(dá)的陽性率明顯減少，表明藥物特異性抑制可減少腦損傷傷皮層小膠質(zhì)細(xì)胞上HMGB1陽性表達(dá)。由于小膠質(zhì)細(xì)胞為腦內(nèi)固有免疫細(xì)胞，故針對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞上HMGB1表達(dá)的干預(yù)可作為未來治療TBI后小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥的潛在靶點(diǎn)[12,13]。

小膠質(zhì)細(xì)胞活化及其介導(dǎo)神經(jīng)炎癥反應(yīng)在TBI后繼發(fā)病理改變中起極其重要作用[4,12,13]，其主要表現(xiàn)為：致炎的M1型和抑炎的M2型兩種表型。M1型分泌大量促炎因子，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生毒性損傷作用[7,8]；而M2型則卻能分泌抑炎因子和神經(jīng)血管生成因子，促進(jìn)組織修復(fù)[5,9,11]。抑制TBI后小膠質(zhì)細(xì)胞活化，改變膠質(zhì)細(xì)胞M1、M2表型比例，可減輕其介導(dǎo)神經(jīng)炎癥，改善TBI患者預(yù)后[1,12,15]。本實(shí)驗(yàn)采用免疫熒光雙染檢測小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物（Iba‐1+）、M1型標(biāo)志物（CD16+）、M2型標(biāo)志物（CD206+），發(fā)現(xiàn)TBI后3 d腦損傷皮層M1型小膠質(zhì)細(xì)胞明顯增多，相關(guān)的炎癥因子TNF‐α、IL‐l和IFN‐γ血清水平均相應(yīng)升高，提示在顱腦損傷早期，活化小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在TBI后二次損害中發(fā)揮著重要作用。利用HMGB1特異性抑制劑處理TBI大鼠后，M1型小膠質(zhì)細(xì)胞減少，M2型小膠質(zhì)細(xì)胞明顯增多，TNF‐α、IL‐1β、IL‐6和IFN‐γ水平均明顯降低，Nissl染色顯示的凋亡神經(jīng)元顯著減少，神經(jīng)功能損害評(píng)分下降，神經(jīng)功能明顯改善。這些均表明：HMGB1通路參與調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞極化的過程，特異性抑制HMGB1表達(dá)能減少小膠質(zhì)細(xì)胞M1亞型，增加M2亞型極化，減輕神經(jīng)炎癥反應(yīng)，進(jìn)而改善傷后神經(jīng)功能。

綜上所述，HMGB1通路參與調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥，在創(chuàng)傷性腦損傷中發(fā)揮著重要作用。在TBI后，特異性抑制HMGB1表達(dá)能減少小膠質(zhì)細(xì)胞M1亞型，增加M2亞型極化，減輕神經(jīng)炎癥反應(yīng)，進(jìn)而改善傷后神經(jīng)功能。