汪瑞，錢燕，魏偉，汪敏，趙競

(安慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校生理教研室，安慶 246052)

據(jù)2020年全球最新癌癥統(tǒng)計報告，世界范圍內(nèi)肝癌新發(fā)病例91萬例，死亡83萬例，發(fā)病率和死亡率分別位居第6位和第3位。我國肝癌的發(fā)病率和死亡率均高于歐美國家。2020年我國新發(fā)肝癌病例41萬，約占全球的一半，死亡病例39萬，位居我國癌癥死亡的第2位[1]。肝癌患者一經(jīng)確診，大多已發(fā)展至中晚期，且常伴隨有HBV感染及肝硬化，手術(shù)難度大且術(shù)后復(fù)發(fā)率較高。As2O3是砒霜的有效成分，在我國傳統(tǒng)中醫(yī)藥研究中具有悠久的歷史。2000年，F(xiàn)DA批準(zhǔn)As2O3用于急性早幼粒細(xì)胞白血病的治療。此后，體內(nèi)外實驗及臨床研究均顯示，As2O3可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，抑制肝癌細(xì)胞增殖，并可抑制腫瘤的生長[2‐5]。

自噬是一種基本的生命現(xiàn)象，在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。自噬機(jī)制失調(diào)與神經(jīng)退行性疾病、代謝性疾病和腫瘤等復(fù)雜性疾病密切相關(guān)。近年來的研究表明，自噬不僅對肝癌的發(fā)生發(fā)展具有雙向調(diào)節(jié)作用，且在肝癌的治療中亦具有雙重作用。一方面，抗癌藥物可通過激活細(xì)胞自噬，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)自噬過量，引起腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬性死亡。另一方面，自噬可通過對腫瘤細(xì)胞內(nèi)組分的降解和再利用為細(xì)胞生存提供必需的物質(zhì)和能量，使腫瘤細(xì)胞獲得抗藥性，逃避抗癌藥物的作用，得以存活[6,7]。有研究表明，As2O3在多種腫瘤細(xì)胞中均可通過對細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)影響細(xì)胞存活，包括肝癌細(xì)胞[8‐10]。本研究建立穩(wěn)定的慢性 As2O3誘導(dǎo)細(xì)胞系，應(yīng)用平板克隆實驗、軟瓊脂集落形成實驗、Transwell 實驗、Western blot及免疫熒光實驗對肝癌細(xì)胞 HepG2和 SMMC7721細(xì)胞中細(xì)胞自噬相關(guān)指標(biāo)、細(xì)胞增殖和遷移能力進(jìn)行檢測分析，以探究自噬在 As2O3影響肝癌細(xì)胞增殖、遷移過程中的作用。

材料與方法

1 細(xì)胞培養(yǎng)及處理

人肝癌細(xì)胞（HepG2和SMMC7721細(xì)胞）用含10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基置37℃、5% CO2、飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2~3 d傳代一次。每次傳代，取生長對數(shù)期細(xì)胞5×105接種于6 cm培養(yǎng)皿中。2 h后，將培養(yǎng)基分別換成含或不含0.1 μmol/L As2O3的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。每次傳代均重復(fù)上述操作。

2 平板克隆實驗

取上述處于對數(shù)生長期的第20代和40代的HepG2和SMMC7721細(xì)胞及其對照細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化后制成單細(xì)胞懸液，以500個細(xì)胞的密度均勻接種于6孔板，繼續(xù)培養(yǎng) 2~3周，期間每隔2 d換一次培養(yǎng)基。出現(xiàn)肉眼可見的克隆時，即終止培養(yǎng)。棄去上清液，用PBS洗2次后，加4%多聚甲醛，15 min后，將多聚甲醛吸出，加入適量GIMSA應(yīng)用染色液，10~30 min后，流水緩慢洗去染色液，空氣干燥，計數(shù)克隆數(shù)，并拍照。

取對數(shù)生長期的0.1 μmol/L As2O3、5 mmol/L 3‐MA單獨(dú)或聯(lián)合處理的HepG2和SMMC7721細(xì)胞及對照細(xì)胞，按同樣的實驗操作流程檢測細(xì)胞的克隆形成數(shù)目，細(xì)胞接種密度為500個/孔。

3 軟瓊脂集落形成實驗

將1.2%的瓊脂糖膠與2×DMEM培養(yǎng)基（含20% 胎牛血清）1:1混合均勻，按1.5 mL/孔加入至6孔板中，室溫凝固。取上述處于對數(shù)生長期的第20代和40代的HepG2和SMMC7721細(xì)胞及其對照細(xì)胞，分別制備細(xì)胞密度為1×105/ mL的單細(xì)胞懸液。將0.7%的瓊脂糖膠與2×DMEM培養(yǎng)基1:1混合均勻，加入100 μL單細(xì)胞懸液，混合均勻后，每孔加入1.5 mL，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng) 每隔 3 d補(bǔ)加培養(yǎng)基。2~3周后，計數(shù)＞50個細(xì)胞的克隆，計算集落形成率。倒置顯微鏡（Olympus公司，TMT2‐21 ECLIPSE TS100）下觀察并照相。

4 Transwell實驗

取0.1 μmol/LAs2O3慢性誘導(dǎo)處理的第20代和40代處于對數(shù)生長期的 HepG2和SMMC7721細(xì)胞及其對照細(xì)胞，胰酶消化離心后，PBS 洗1~2次， 用無血清培養(yǎng)基重懸至密度為5×105/mL。取Transwell小室放入24孔板內(nèi)，上室加入細(xì)胞懸液100 μL，在下室加600 μL含20%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞 12 h。培養(yǎng)結(jié)束后，取出小室，棄孔板內(nèi)的培養(yǎng)基，無鈣PBS洗小室2次，甲醇固定細(xì)胞30 min，適當(dāng)風(fēng)干小室后加入500 μL 0.1%結(jié)晶紫室溫染色 2 h，棄上室液，蒸餾水浸泡3次脫色，取出小室，用棉簽輕輕擦去小室上層未遷移的細(xì)胞后每室加入 200 μL 0.1% SDS放置過夜，吸取下室液，用酶標(biāo)儀（Thermo公司，Varioskan LUX）在570 nm測OD值。

取對數(shù)生長期的HepG2和SMMC7721細(xì)胞，按上述相同的實驗操作制備細(xì)胞懸液并加入至小室中，在接種細(xì)胞的上室中分別加入對照溶劑（DM‐SO）、0.1 μmol/L As2O3、5 mmol/L 3‐MA、0.1 μmol/L As2O3+ 5 mmol/L 3‐MA，繼續(xù)培養(yǎng) 12 h。按上述相同的方法進(jìn)行細(xì)胞固定及結(jié)晶紫染色，顯微鏡（Olym‐pus公司，TMT2‐21 ECLIPSE TS100）下拍照，每組細(xì)胞取3~5個視野計數(shù)遷移的細(xì)胞數(shù)目，并取平均值用于統(tǒng)計分析。

5 Western blot檢測

分別收集 0.1 μmol/L As2O3孵育不同時間（0 h、6 h、12 h、24 h）的 HepG2和SMMC7721細(xì)胞，RIPA蛋白裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度。配置12% SDS‐PAGE分離膠和 5%濃縮膠。上樣，每孔蛋白總量為 20 μg。電泳（90V，30 min；120V，90 min），半干轉(zhuǎn)（恒流，電流大小為膜面積總和的2.5倍，45 min）。5% 脫脂牛奶室溫封閉 1 h后，加入抗β‐actin（Proteintech公司，1:5000）、抗LC3B（Sigma公司，1:1000）和抗p62（Sigma公司，1:1000）一抗工作液，4 ℃ 孵育過夜。PBS洗3次，5 min/次。HRP標(biāo)記的二抗（Proteintech公司，1:5000）室溫孵育1 h，PBS洗3次，5 min/次。ECL顯色液（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）顯色，F(xiàn)luorChem FC3化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（ProteinSimple公司）成像，Image J軟件對蛋白表達(dá)進(jìn)行定量分析，以目的蛋白條帶光密度與內(nèi)參蛋白β‐actin條帶光密度比值代表目的蛋白相對水平。

6 細(xì)胞免疫熒光

將專用細(xì)胞爬片放入24孔板里，可預(yù)先在24孔板中滴加少量的培養(yǎng)基使細(xì)胞爬片更好地貼附。取上述處于對數(shù)生長期的 HepG2和SMMC7721細(xì)胞，用0.25% 胰蛋白酶消化后制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104~1×105/ mL，每孔加入1 mL細(xì)胞懸液。2 h后，將培養(yǎng)基分別換成含或不含0.1 μmol/L As2O3的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng) 12 h。棄培養(yǎng)基，PBS浸洗2次后加4%多聚甲醛固定15 min，棄多聚甲醛，PBS 浸洗 2 次，0.1% Triton‐100 打孔5 min，PBS 浸洗 2 次，5% BSA室溫封閉 1 h，加入 抗LC3B 抗體（Sigma公司，1:1000）4 ℃ 孵育過夜，PBS 浸洗 2 次，Alexa Fluor 549標(biāo)記的抗小鼠熒光二抗（Sigma公司，1:2000）室溫孵育 1 h。1 mg/ml DAPI （北京索萊寶公司）復(fù)染細(xì)胞核。倒置熒光顯微鏡（Carl Zeiss公司，Observer A1）觀察，拍照。每組照片選取3~5個視野，采用Image J 軟件對熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量分析，并取平均值用作后續(xù)統(tǒng)計分析。

7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS22.0 和 GraphPad Prism 7.0 進(jìn)行統(tǒng)計分析和繪圖，所有數(shù)據(jù)呈現(xiàn)形式均為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。采用非配對t檢驗比較兩組間的統(tǒng)計學(xué)差異。

結(jié) 果

1 As2O3 抑制 HepG2 和 SMMC7721 細(xì)胞增殖

平板克隆實驗分析顯示，與對照細(xì)胞相比，經(jīng)0.1 μmol/L As2O3慢性誘導(dǎo)的第20代和第 40代HepG2 細(xì)胞形成的克隆數(shù)明顯減少，在SMMC7721細(xì)胞中亦獲得相似的結(jié)果（圖1）。由此表明，0.1 μmol/LAs2O3慢性誘導(dǎo)可顯著抑制肝癌細(xì)胞增殖。

圖1 As2O3 (0.1 μmol/L)慢性誘導(dǎo)對肝癌細(xì)胞增殖能力影響的平板克隆實驗檢測。 A，代表性平板克隆實驗結(jié)果。B，細(xì)胞克隆數(shù)的統(tǒng)計分析；與對照組相比：*0.01＜P＜0.05，**P＜0.01；n=3Fig.1 Detection of cell proliferation by plate clone formation assay of hepatoma cells. A, representative results of plate clone formation assay; B, statis‐tical analysis of colony numbers in plate clone formation assay; compared with control group: *0.01＜P＜0.05, **P＜0.01; n=3

2 As2O3 降低HepG2 和 SMMC7721 細(xì)胞的克隆形成能力

軟瓊脂集落形成實驗顯示：與對照組相比，0.1 μmol/L As2O3處理的 HepG2 和 SMMC7721 細(xì)胞的克隆形成率均明顯降低，且細(xì)胞的克隆形成能力與As2O3慢性誘導(dǎo)的時間呈負(fù)相關(guān)：隨著誘導(dǎo)時間的增加，細(xì)胞克隆形成能力越弱（圖2），表明0.1 μmol/L As2O3慢性誘導(dǎo)可顯著抑制肝癌細(xì)胞的克隆形成能力。

圖2 As2O3慢性誘導(dǎo)對肝癌細(xì)胞克隆能力影響的軟瓊脂集落形成實驗檢測。A，代表性軟瓊脂集落形成實驗結(jié)果；比例尺，100 μm。B，細(xì)胞克隆形成率統(tǒng)計分析；與對照組相比：*0.01＜P＜0.05，**P＜0.01；n=3Fig.2 Assay of soft agar colony formation of hepatoma cells. A, representative results of soft agar colony formation assay; scale bar, 100 μm; B, statis‐tical analysis of colony formation rate in soft agar colony formation assay; compared with control group: *0.01＜P＜0.05, **P＜0.01; n=3

3 As2O3 抑制HepG2和SMMC7721細(xì)胞的遷移能力

Transwell遷移實驗分析顯示：經(jīng) 0.1 μmol/L As2O3慢性誘導(dǎo)的 HepG2 和 SMMC7721 細(xì)胞穿過膜的細(xì)胞均明顯少于對照組，As2O3慢性誘導(dǎo)的時間越長，穿過的細(xì)胞越少（圖3），表明As2O3慢性誘導(dǎo)可顯著抑制肝癌細(xì)胞的遷移。

圖3 Transwell實驗檢測As2O3慢性誘導(dǎo)對肝癌細(xì)胞遷移的影響。A，代表性Transwell實驗結(jié)果；比例尺，100 μm。B，細(xì)胞遷移能力統(tǒng)計學(xué)分析；與對照組相比：*0.01＜P＜0.05，**P＜0.01；n=3Fig. 3 Detection of cell migration of hepatoma cells by transwell migration experiment. A, representative results of transwell migration experiment;scale bar, 100 μm; B, statistical analysis of cell migration numbers; compared with control group: *0.01＜P＜0.05, **P＜0.01; n=3

4 As2O3 上調(diào)自噬相關(guān)蛋白 LC3B-Ⅱ 和 p62水平

Western blot 檢測顯示，0.1 μmol/L As2O3處理顯著上調(diào)肝癌細(xì)胞 HepG2 和 SMMC7721 細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白 p62 和 LC3B‐Ⅱ的表達(dá)水平，且LC3B‐Ⅱ與LC3B‐I的比值顯著增大，并具有時間依賴性（圖4）。免疫熒光染色檢測顯示，與對照細(xì)胞相比，0.1 μmol/L As2O3處理的細(xì)胞中LC3B免疫反應(yīng)性明顯增強(qiáng)（圖 5），提示As2O3可增強(qiáng)肝癌細(xì)胞自噬。

圖4 As2O3 對肝癌細(xì)胞中 LC3B 和 p62水平的影響。A，HepG2 細(xì)胞中LC3BII 和 p62水平代表性Western blot檢測結(jié)果與統(tǒng)計學(xué)分析；B，SMMC7721 細(xì)胞中LC3BII和 p62水平代表性Western blot檢測結(jié)果與統(tǒng)計學(xué)分析；C，LC3BII和LC3BI水平比值統(tǒng)計學(xué)分析；與對照組相比：*0.01＜P＜0.05，**P＜0.01，#P＞0.05；n=3Fig.4 Effect of As2O3 on the level of LC3B and p62 in hepatoma cells. A, representative Western blot results and statistical analysis of the level of LC3B and p62 in HepG2 cells treated with As2O3; B, representative Western blot results and statistical analysis of the level of LC3B and p62 in the SMMC7721 cells treated with As2O3; C, statistical analysis of the LC3BII to LC3BI ratio; compared with control group: *0.01＜P＜0.05, **P＜0.01, #P＞0.05; n=3

5 3-MA逆轉(zhuǎn)As2O3 所致的肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為改變

與上述結(jié)果一致，0.1 μmol/L As2O3處理后HepG2和SMMC7721細(xì)胞的克隆形成數(shù)量及穿過膜的細(xì)胞數(shù)目均明顯少于對照組；與As2O3單獨(dú)處理的細(xì)胞相比，As2O3與3‐MA聯(lián)合處理的細(xì)胞的克隆形成數(shù)量及穿過膜的細(xì)胞數(shù)目均有所增加，且在SMMC7721細(xì)胞中，單獨(dú)自噬抑制劑3‐MA 處理明顯增加細(xì)胞克隆數(shù)目，而在HepG2細(xì)胞中并未觀察到該現(xiàn)象（圖6）。以上結(jié)果表明自噬抑制劑3‐MA處理可逆轉(zhuǎn)As2O3對肝癌細(xì)胞增殖和遷移的抑制作用。

圖 5 免疫熒光檢測As2O3 處理對肝癌細(xì)胞 LC3B 表達(dá)的影響。A，代表性免疫熒光檢測結(jié)果；比例尺，50 μm。B，LC3B免疫反應(yīng)性（熒光強(qiáng)度）統(tǒng)計分析；與對照組相比，***P＜0.001； n=3。Fig.5 Immunofluorescence examination for the effect of As2O3 on the expression of LC3B in hepatoma cells. A, representative immunofluorescent stain‐ing results; scale bar, 50 μm; B, statistical analysis of LC3B immunoreactivity (fluorescent intensity); compared with control group, ***P＜0.001; n=3

圖6 自噬抑制劑3‐MA對As2O3抑制肝癌細(xì)胞增殖和遷移的影響。A，細(xì)胞增殖的代表性平板克隆實驗檢測；B，細(xì)胞克隆數(shù)的統(tǒng)計分析；C，細(xì)胞遷移的代表性Transwell分析檢測；D，細(xì)胞遷移數(shù)目統(tǒng)計分析；比例尺，50 μm；與對照組相比：**0.001＜P＜ 0.01，***P＜0.001；與As2O3 組相比，#0.01＜P＜0.05；n=3Fig.6 Effect of autophagy inhibitor 3‐MA on the As2O3‐induced repression of cell proliferation and migration. A, representative colony formation assay results; B, statistical analysis of colony numbers; C, representative transwell assay results; D, statistical analysis of cell migration numbers; scale bar, 50 μm; compared with control group: **0.001＜P＜0.01, ***P＜0.001; compared with As2O3 group, #0.01＜P＜0.05; n=3

討 論

研究表明，As2O3可通過自噬、氧化應(yīng)激和調(diào)節(jié)miRNA表達(dá)等多種機(jī)制抑制肝癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制肝細(xì)胞癌的生長[5,8,11,12]。本研究在As2O3慢性誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞中檢測了其對肝癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)As2O3慢性誘導(dǎo)的 HepG2和SMMC7721細(xì)胞的增殖受抑、克隆形成率降低、細(xì)胞遷移能力明顯減弱，表明As2O3可抑制肝癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。

自噬參與肝細(xì)胞癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、靶向治療和藥物抵抗[6]，在肝癌的研究中有著舉足輕重的地位。研究顯示，As2O3在人骨肉瘤細(xì)胞、人頭頸鱗癌細(xì)胞、人肝細(xì)胞、小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等多種類型的細(xì)胞中均可調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬[9,13‐16]。 本實驗在HepG2和SMMC7721細(xì)胞中檢測了As2O3處理對細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3B和p62表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng) As2O3處理的兩種細(xì)胞中自噬小體形成金標(biāo)準(zhǔn) LC3B‐II與LC3B‐I 比值明顯高于未經(jīng)As2O3處理的對照組細(xì)胞，且隨著As2O3處理時間的增加，這種差異更加顯著。p62是一種分子量為 62 kD的多功能蛋白，是第一個被發(fā)現(xiàn)可調(diào)節(jié)選擇性自噬的受體蛋白[17]。在自噬過程中，自噬連接蛋白p62可同時與底物及LC3‐II結(jié)合，包裹入自噬體中，并在隨后與溶酶體融合形成自噬溶酶體。p62 在溶酶體中被蛋白水解酶降解。故此，p62 蛋白水平通常被認(rèn)為與自噬活性負(fù)相關(guān)。然而，在我們的研究中發(fā)現(xiàn)，As2O3顯著上調(diào)肝癌細(xì)胞中p62的表達(dá)。這可能是由于p62作為一種應(yīng)激蛋白在細(xì)胞應(yīng)對As2O3的毒性刺激時，As2O3誘使p62的轉(zhuǎn)錄活性顯著增強(qiáng)，從而產(chǎn)生了大量的p62蛋白，雖然自噬增強(qiáng)消耗了部分蛋白，但細(xì)胞內(nèi)仍有部分p62蛋白堆積。這在實際檢測中是一種常見現(xiàn)象，也與Gao等[13]和Liang等[15]的研究結(jié)果相符。以上結(jié)果表明，As2O3誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞自噬增加。

為探究As2O3所致的肝癌細(xì)胞自噬增加在其誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、遷移改變中的作用，我們通過3‐MA阻斷細(xì)胞自噬，在體外實驗中檢測了3‐MA 對As2O3抑制HepG2和SMMC7721細(xì)胞增殖、遷移的影響。3‐MA是一種廣泛用于自噬相關(guān)研究的自噬阻斷劑，可在自噬發(fā)生早期阻斷自噬體的形成[18]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3‐MA可阻礙As2O3對HepG2和 SMMC7721細(xì)胞增殖、遷移的抑制作用。這一結(jié)果表明As2O3所致的肝癌細(xì)胞自噬增加在其抑制細(xì)胞增殖、遷移的過程中發(fā)揮正向調(diào)節(jié)作用，As2O3所致自噬增加可能進(jìn)一步誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的自噬性凋亡。

綜述所述，As2O3在體外可抑制人肝癌細(xì)胞增殖、克隆形成和遷移，并可上調(diào)肝癌細(xì)胞的自噬水平。自噬水平升高是As2O3抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移的可能機(jī)制。