薛亞爽

（陜西中醫(yī)藥大學 體育部，陜西 咸陽 712000）

0 引言

運動性貧血是體育運動過程中出現(xiàn)血紅蛋白、紅細胞水平和紅細胞比積水平顯著下降的一種貧血癥狀［1］.作為體育運動中較常見的現(xiàn)象，運動性貧血生理機理復雜，對運動性貧血的發(fā)生機制仍不清楚，但其中鐵缺乏是導致貧血的重要因素［2-3］.鐵作為必須的人體微量元素，通過參與血紅蛋白的組成，構(gòu)建呼吸鏈的重要成分［4］，也是許多蛋白質(zhì)合成和酶合成的主要輔助因子，因此，鐵與運動能力息息相關［5-6］.當運動訓練導致鐵代謝混亂時，及時檢測機體早期鐵缺乏狀態(tài)，并給與含鐵制劑補充，確保運動員訓練狀態(tài)十分必要［7］.目前，應用廣泛的含鐵制劑主要采用含鐵中藥等營養(yǎng)補充劑，該方法簡單有效，效果也較好，但容易造成一系列副作用，如降低人的消化功能，導致食欲減退等［8］.因此，采用膳食補充來改善運動貧血癥具有更高的安全性，成為當前的熱點［9］.蚯蚓因獨有的生物態(tài)含鐵蛋白質(zhì)與哺乳動物血紅蛋白的血紅素相似，具有極高的應用開發(fā)價值［10］.本文根據(jù)蚯蚓血紅蛋白含鐵特征，采用雙水相萃取對蚯蚓血紅蛋白提取、純化，制備具有高品質(zhì)的生物肽含鐵蛋白質(zhì)產(chǎn)品，并選擇運動性貧血大鼠分析了功能食品對大鼠血細胞、血紅蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白等參數(shù)的影響，以期改善機體鐵代謝水平.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅蚯蚓：長約6~8 cm，購自當?shù)仞B(yǎng)殖專業(yè)戶；紅棗汁、蜂蜜等食品添加劑購自當?shù)亟?jīng)銷商；乙醇（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；甲醇（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；0.1 mol/L 的光合細菌（Photosynthetic bacteia，PSB）培養(yǎng)基（色譜純，南京建成生物工廠研究所）；丙二醛測試盒（分析純，南京建成生物工廠研究所）；血紅蛋白、血清蛋白ELISA檢測試劑（色譜純，武漢博士德公司）；紅細胞稀釋液（分析純，鼎國生物公司）.

1.2 儀器與設備

Pro025自動勻漿機（上海書俊儀器設備公司）；Beckman Coulter超速離心機（美國貝克曼庫爾特有限公司）；DIP-1高壓均質(zhì)機（意大利PSI均質(zhì)機公司）；Hemo Cue WBC全自動血細胞分析儀（瑞典Hemocue公司）；Multiskan酶標儀（美國賽默飛世爾Thermo公司）DWG-7A灌裝機（中國航空制造工廠研究所）；Z2血細胞計數(shù)器（貝克曼庫爾特有限公司）；LGJ-18S真空冷凍干燥機（上海豫明儀器設備有限公司）；DHG-9303恒溫干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）.

1.3 實驗方法

血紅蛋白提取與純化工藝：將蚯蚓清洗干凈后，加入部分蒸餾水置于勻漿機中破碎，取離心后的上層清液，加入分子量6 000的聚乙二醇和硫酸銨達到12%（W/W），混合均勻，靜置，去掉溶于聚乙二醇相中蛋白質(zhì)以及非蛋白類雜質(zhì)，待溶液分層后，取紅色的下層血紅蛋白相.將血紅蛋白相沉淀，在10 mmol/L、PH為5.05的磷酸緩沖液中透析過濾，獲得純化后的血紅蛋白沉淀相.取部分樣品溶于蒸餾水中置于-2 ℃冷凍箱中冰凍用于制備冷凍成品，另一部分樣品通過層析柱平衡液20 mmol/L、PH為7的HCl緩沖液中溶解，在1 200 r/min的離心機上高速離心，取上清液為待上柱子樣品；用20 mmol/L、PH為7的HCl緩沖液平衡Q Sepharose fast flow 柱子，將待上柱子樣品上柱，并制備0~800 mmol/L的NaCl洗脫液進行洗脫，收集紅色蛋白部分，用于制備真空冷凍成品.

用蒸餾水將冷凍保存的血紅蛋白溶解成濃度3 mg/mL溶液，根據(jù)質(zhì)量比1∶1∶1的比例加入紅棗汁、蜂蜜混合，調(diào)配風味（比例為血紅蛋白溶液∶紅棗汁∶蜂蜜），充分混合均勻后脫氣處理灌裝，經(jīng)過超高溫滅菌至室溫備用.

實驗對象優(yōu)選：選擇60只8周齡雄性Wistar大鼠，體重200±15 g.隨機分為三組：對照組（20只）、跑臺運動組（20只），跑臺運動+營養(yǎng)組（20只）.運動組和運動組+營養(yǎng)組大鼠進行跑臺訓練，每日跑臺訓練30 min，跑臺速度30 m/min.同時向兩組大鼠皮下注射2%苯肼，注射48 h內(nèi)大鼠未死亡，測定其紅細胞含量，證明已建立貧血模型.模型建立后，兩組保持運動狀態(tài)，跑臺運動+營養(yǎng)補充組大鼠每日補充自制的功能食品3次，每次2 mL，實驗過程中控制飼養(yǎng)環(huán)境溫度23±2 ℃，濕度40%~60%，自由飲食，自然晝夜節(jié)律變化光照.實驗共進行12天，結(jié)束后處死所有大鼠，分離大鼠血液、血清等，進行相關指標檢測.

取樣檢測方式：根據(jù)分組要求，在最后一次運動24 h后，由腹部主動脈取血，部分血樣肝素抗凝來測定大鼠血樣中紅細胞數(shù)（RBC）、紅細胞比積（Hct）、血紅蛋白（Hb）；其余血樣注入離心管，于3 000 r/min離心15 min分離血清，置于-20 ℃冷凍箱測定鐵蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白.采用ELISA法測量大鼠血清轉(zhuǎn)鐵蛋白，由抗凝血測定紅細胞參數(shù)測定大鼠血紅蛋白及血紅細胞參數(shù).訓練過程中，每隔2天對三組大鼠斷尾取血20 μL、采用氰化高鐵血紅蛋白法測定大鼠血紅蛋白水平.

數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理：利用SPSS10.0軟件包的one-way ANOVA檢驗對擦劑的指標數(shù)據(jù)進行分析，數(shù)據(jù)以±標準差表示，對各指標進行相關性分析，顯著性水平P<0.05，非常顯著性水平P<0.01.

2 結(jié)果與分析

2.1 實驗結(jié)果

2.1.1 營養(yǎng)物對大鼠紅細胞指數(shù)影響

比較對照組、跑臺運動組、跑臺運動+營養(yǎng)組的紅細胞指標指數(shù)見表1所示.可以看出，其中跑臺運動組的紅細胞、血紅蛋白、紅細胞比積均明顯低于對照組、跑臺運動+營養(yǎng)組，且對照組三相指標與跑臺運動組、跑臺運動+營養(yǎng)組表現(xiàn)出非常顯著性意義（P<0.01）；跑臺運動+營養(yǎng)組血紅蛋白含量顯著高于運動組（P<0.05），其中的血紅蛋白含量、紅細胞比積含量均非常顯著性高于運動組（P<0.01）.

表1 不同組別大鼠的紅細胞指數(shù)特征

2.1.2 營養(yǎng)物對大鼠血清、鐵蛋白影響

相較于對照組，經(jīng)過長時間跑臺訓練后的運動組大鼠血清鐵含量顯著低于對照組（P<0.05），跑臺運動+營養(yǎng)組大鼠血清蛋顯著高于運動組（P<0.05），而加入了功能食品的跑臺運動+營養(yǎng)組的血清鐵與對照組血清鐵并無顯著差異.長時間跑臺運動導致運動組大鼠血清轉(zhuǎn)鐵蛋白濃度顯著高于對照組與跑臺運動+營養(yǎng)組，跑臺運動+營養(yǎng)組的血清轉(zhuǎn)鐵蛋白含量稍有上升，但并不顯著.可以看出，跑臺運動+營養(yǎng)組的血清蛋白顯著高于跑臺運動組，而血清轉(zhuǎn)鐵蛋白顯著低于跑臺運動組（如表2）.

表2 營養(yǎng)物對大鼠血清、鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白含量的影響

對不同組別大鼠的血清鐵、血清鐵蛋白與轉(zhuǎn)鐵蛋白進行相關性統(tǒng)計，見表3.其中血清蛋白與血清鐵表現(xiàn)出顯著的正相關性（R=0.533；P=0.002），血清鐵蛋白與血清轉(zhuǎn)鐵蛋白攻讀表現(xiàn)出顯著的負相關性（R=-0.862；P=0.000），血清鐵與血清轉(zhuǎn)鐵蛋白表現(xiàn)負相關性（R=-0.435；P=0.018），分析各組大鼠指標間的相關性，其中血清蛋白與轉(zhuǎn)鐵蛋白表現(xiàn)出最大的負相關性（R=-0.856；P=0.000）.

表3 大鼠各血液指標相關性結(jié)果

2.2 實驗分析

2.2.1 營養(yǎng)干預對紅細胞指數(shù)影響

分析結(jié)果表明，經(jīng)過跑臺運動的大鼠紅細胞發(fā)生顯著變化，紅細胞、血紅蛋白、紅細胞比積指標水平顯著性低于對照組.各指標的顯著性下降，表明長期的跑臺運動導致大鼠處于運動性貧血狀態(tài).機體紅細胞數(shù)量通常是紅細胞的合成和破碎速率的動態(tài)平衡決定的，當機體紅骨髓內(nèi)紅細胞合成速率大于破碎速率，則紅細胞水量和血紅蛋白濃度上升，反之則下降［11］.骨髓紅細胞的合成和破碎受到運動訓練強度、持續(xù)時間、含氧量和身體機能狀況的影響作用.運動訓練中使紅細胞膜脂質(zhì)過氧化，溶血因子釋放，紅細胞破碎增強［12］.訓練易造成紅細胞機械性破碎，肝、脾等對紅細胞破碎增加［13］.研究結(jié)果表明，經(jīng)過長期跑臺訓練大鼠血紅蛋白顯著低于對照組，表明紅細胞破碎速度高于生成速度，產(chǎn)生運動性貧血.

通過營養(yǎng)干預運動臺大鼠可以發(fā)現(xiàn)，跑臺運動+營養(yǎng)組的各項紅細胞指標均顯著高于對照組.長期跑臺運動訓練引起鐵代謝紊亂，是造成運動性貧血的一個重要原因［14］.通過含鐵營養(yǎng)物來補充改善大負荷運動下運動員鐵代謝紊亂，緩解鐵代謝的不利影響.本文中制備的功能食品有效提升了大鼠自身造血機能水平，維持鐵代謝穩(wěn)定，降低紅細胞的破壞，通過協(xié)調(diào)效應達到防止運動性貧血的目的.

2.2.2 營養(yǎng)干預對血清鐵等的影響

鐵作為血紅蛋白的重要組成，其與機體有氧代謝密切相關；同時，鐵作為構(gòu)成呼吸鏈的重要成分，也是能量代謝重要“催化劑”；鐵是多種酶和蛋白質(zhì)的組成成分，是催化物質(zhì)能量代謝和形成功能物質(zhì)的成分［15］.運動員在進行訓練中具有高水平能量代謝，與酶的活性、呼吸鏈能量生成速率和機體供養(yǎng)密切相關，而鐵在機體中具有該類生物學功能［16］.鐵在機體中具有雙重性，機體中含鐵量充足，鐵促進自由基生成而導致機體脂質(zhì)過氧化，鐵含量下降，影響機體紅細胞生成和能量代謝水平.

血清鐵作為機體中鐵的主要轉(zhuǎn)運形式.研究結(jié)果可以看出，高強度跑臺運動造成大鼠血清鐵呈下降趨勢，而血清鐵與骨髓造血機能密切相關［17］.跑臺運動組大鼠血紅蛋白濃度顯著低于跑臺運動+營養(yǎng)組，而經(jīng)過功能食品干預的運動組血清鐵和血紅蛋白含量都高于跑臺運動組，表明運動訓練引起血清含量低下是影響血紅蛋白合成的主要因素，高強度的跑臺運動造成大鼠發(fā)生運動性貧血.

血清鐵蛋白是體內(nèi)鐵儲備的主要形式，血清蛋白濃度反應機體鐵狀態(tài)變化［18］.機體鐵儲備上升時，血清鐵蛋白濃度下降.當運動引起鐵丟失增加，血清鐵蛋白濃度、血清鐵濃度、轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度下降［19］.血清轉(zhuǎn)鐵蛋白是機體中轉(zhuǎn)運鐵的重要方式，當機體鐵代謝紊亂，鐵缺乏時，機體轉(zhuǎn)運鐵機制啟動，提高攝取鐵的能力，使機體轉(zhuǎn)鐵蛋白增加［20］.

實驗結(jié)果表明經(jīng)過長期的跑臺運動訓練導致跑臺運動組血清蛋白較對照組下降了28.2%，血清轉(zhuǎn)鐵蛋白提高了24.6%.運動訓練造成血清鐵下降，血清鐵蛋白耗損增加，激活了機體轉(zhuǎn)鐵機制，提高了機體內(nèi)轉(zhuǎn)鐵蛋白的適應性［21］.經(jīng)過干預的跑臺運動+營養(yǎng)組相較于跑臺運動組的血清蛋白上升了22.5%，轉(zhuǎn)鐵蛋白下降了18.2%，表明抗貧血營養(yǎng)劑能有效維持鐵代謝機制.加入的含鐵功能食品通過提升大鼠血清鐵和鐵蛋白濃度，降低轉(zhuǎn)鐵蛋白實現(xiàn)對鐵代謝調(diào)節(jié).通過對指標相關性分析發(fā)現(xiàn)：血清鐵蛋白和血清鐵相關性指標R=0.533，表現(xiàn)出顯著的正相關.血清轉(zhuǎn)鐵蛋白與血清鐵相關指標R=-0.435，表現(xiàn)出顯著的負相關性.血清鐵蛋白與轉(zhuǎn)鐵蛋白的相關性指標R=-0.862，表現(xiàn)出高度負相關性.鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白與紅細胞的相關性指標分別為R=-0.696和R=-0.732，表明血清鐵和轉(zhuǎn)鐵蛋白能夠較準確反應機體鐵代謝水平，且血清轉(zhuǎn)鐵蛋白的對機體鐵代謝的靈敏度更高.

3 結(jié)論與展望

以飼養(yǎng)的蚯蚓為原料，采用聚乙醇-硫酸銨雙水相萃取的分離純化工藝取得提取液血紅蛋白，并經(jīng)過透析、離心獲得高品質(zhì)生物肽含鐵蛋白產(chǎn)品.將開發(fā)的含鐵蛋白產(chǎn)品應用于運動性大鼠中，對該含鐵蛋白食品在預防運動性貧血作用進行分析，研究結(jié)果表明：

（1）高負荷跑臺運動造成大鼠處于運動性貧血狀態(tài)，大鼠血清鐵、血清鐵蛋白下降，轉(zhuǎn)鐵蛋白上升，血清鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白與血清鐵變化呈現(xiàn)高度相關性，可通過轉(zhuǎn)鐵代表與血清鐵蛋白表征機體代謝情況.

（2）貧血營養(yǎng)劑可明顯提高運動性貧血大鼠的血清鐵、血清鐵蛋白含量，降低血清轉(zhuǎn)鐵蛋白含量，含鐵功能食品通過改善機體鐵代謝指標提高大鼠鐵儲備能力和鐵代謝穩(wěn)定性，對缺鐵性貧血具有良好作用.

研究結(jié)果證實，開發(fā)的生物含鐵蛋白食品在對運動性貧血方面具有良好的抗貧血功能，對于后期運動功能食品的研發(fā)層，對人類健康和體育產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有實際應用價值.