路凱 陳濤 姚姝 梁文化 魏曉東 張亞東 王才林

鹽脅迫下四個(gè)水稻類受體蛋白激酶的功能分析

路凱 陳濤 姚姝 梁文化 魏曉東 張亞東*王才林*

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 糧食作物研究所/江蘇省優(yōu)質(zhì)水稻工程技術(shù)研究中心/國(guó)家水稻改良中心南京分中心，南京 210014;*通信聯(lián)系人，E-mail：zhangyd@jaas.ac.cn；clwang@jaas.ac.cn)

鹽脅迫是制約水稻生長(zhǎng)和產(chǎn)量主要逆境之一，研究鹽脅迫響應(yīng)基因?qū)τ诹私庵参锬望}機(jī)理和培育耐鹽水稻品種具有重要意義。類受體蛋白激酶RLK（receptor-like protein kinases）廣泛參與調(diào)控植物細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)過(guò)程。本研究的目的是分析鹽脅迫下四個(gè)RLK基因的表達(dá)模式和生物學(xué)功能。通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)4個(gè)基因在NaCl處理下的表達(dá)變化以及在不同組織器官中的表達(dá)情況，同時(shí)利用CRISPR/Cas9對(duì)4個(gè)基因分別進(jìn)行編輯。4個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄均受NaCl誘導(dǎo)或抑制，其中基因和基因主要在根中表達(dá)；基因主要在葉片中表達(dá)；基因在根、莖、葉、葉鞘中均有表達(dá)。通過(guò)測(cè)序分別篩選到4個(gè)基因的功能缺失突變體，耐鹽性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明四個(gè)基因的突變體對(duì)NaCl的敏感程度與野生型一致。鑒定的4個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄受NaCl調(diào)控且表達(dá)具有組織特異性，突變單個(gè)基因不影響水稻的耐鹽性。為進(jìn)一步揭示鹽脅迫下基因的功能和作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

類受體蛋白激酶；鹽脅迫；基因編輯；粳稻

水稻是世界上最主要的糧食作物之一，也是我國(guó)種植面積最大的農(nóng)作物，而鹽脅迫是制約其生長(zhǎng)和產(chǎn)量的主要逆境之一[1-2]。水稻栽培面積的20%受到不同程度的鹽害威脅，這些鹽堿地分布于沿海及部分內(nèi)陸地區(qū)[3-4]。鹽脅迫嚴(yán)重影響水稻的生長(zhǎng)發(fā)育和代謝，高濃度的Na+可以直接對(duì)細(xì)胞膜造成傷害，而Na+的間接作用常導(dǎo)致滲透脅迫，使植物根系吸水困難，從而造成水分和營(yíng)養(yǎng)的虧缺[5-7]。

研究表明類受體蛋白激酶RLK（receptor-like protein kinases）廣泛參與到細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和植物對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)過(guò)程[8-9]。近年來(lái)，已有報(bào)道表明RLK蛋白在植物響應(yīng)鹽脅迫過(guò)程中起著非常重要的作用[10]。水稻（）基因編碼一個(gè)典型的LRR型RLK蛋白，其表達(dá)受到NaCl、干旱和H2O2的誘導(dǎo)。高表達(dá)的轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)鹽和干旱脅迫的抗性均比對(duì)照增強(qiáng)，而基因的兩個(gè)功能缺失突變體和和RNAi株系均對(duì)鹽和干旱敏感[10]。水稻（）基因編碼凝集素樣類受體蛋白激酶LecRLK，其表達(dá)受NaCl的誘導(dǎo)。SIT1的RNAi株系對(duì)鹽脅迫的抗性明顯增強(qiáng)，而且體外和體內(nèi)磷酸化的結(jié)果表明在NaCl存在條件下SIT1可以直接磷酸化MPK3和MPK6[11]。在擬南芥中高表達(dá)基因可以使植物對(duì)鹽的敏感性增強(qiáng)[12]。以上研究結(jié)果表明，類受體蛋白激酶通過(guò)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)下游基因表達(dá)來(lái)影響植物對(duì)鹽脅迫的耐性。

RLK家族是植物最大的膜受體家族，它在擬南芥成員數(shù)達(dá)610多個(gè)，水稻中達(dá)1100多個(gè)[8-9]。典型的類受體蛋白激酶由胞外結(jié)構(gòu)域(extracellular domain)、單次跨膜結(jié)構(gòu)域(transmembrane domain)和胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域(cytoplasmic kinase domain) 三部分組成。其中，胞外結(jié)構(gòu)域主要用來(lái)感受信號(hào)或外界的刺激；胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域比較保守，通過(guò)磷酸化下游底物來(lái)傳遞信號(hào)[13-14]。RLK的胞質(zhì)激酶結(jié)構(gòu)域有一個(gè)非常保守的賴氨酸，當(dāng)把賴氨酸突變成谷氨酸后，RLK的激酶活性喪失，從而不能磷酸化下游底物和傳遞信號(hào)[23-24]。根據(jù)胞外結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)以及胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域氨基酸序列的差異，RLK蛋白可以分為不同的亞家族：富含半胱氨酸的類受體蛋白激酶CRK（cysteine-rich repeat RLKs）、凝集素樣類受體蛋白激酶LecRLK（lectin receptor kinase）、富含亮氨酸的類受體蛋白激酶LRR-RLK（leucine-rich repeat RLKs）、S結(jié)構(gòu)域的類受體蛋白激酶（S-domain RLKs）等[14, 17]。

本研究以優(yōu)良食味水稻品種南粳9108作為野生型植株，利用CRISPR/Cas9技術(shù)分別敲除四個(gè)新的響應(yīng)鹽脅迫的類受體蛋白激酶編碼基因（、、、），并分析了四個(gè)基因的表達(dá)模式，以期對(duì)這些基因在水稻遭受鹽脅迫時(shí)的生物學(xué)功能進(jìn)行闡釋。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以南粳9108為野生型（wild-type, WT）對(duì)照并將其作為轉(zhuǎn)化受體材料，基因編輯相關(guān)載體(pYLCRISPR/Cas9PUbi-H和pYLsgRNA-OsU6a/U3)由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)劉耀光院士饋贈(zèng)[18]。實(shí)驗(yàn)所用引物序列見表1，引物合成以及DNA測(cè)序工作在南京擎科生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 基因表達(dá)模式分析

將野生型南粳9108種子置于1/4 MS培養(yǎng)液中培養(yǎng)10 d，然后將幼苗分別置于含有0 mmol/L NaCl、200 mmol/L NaCl、100 μmol/L ABA和200 mmol/L甘露醇（D-Mannitol）的1/4 MS培養(yǎng)液中培養(yǎng)6 h。收材料提取總RNA并且反轉(zhuǎn)錄cDNA。以作為內(nèi)參，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果一致。提取幼苗以及灌漿期水稻的根、莖、葉、葉鞘的RNA。收材料提取總RNA并且反轉(zhuǎn)錄cDNA。熒光定量PCR檢測(cè)各組織中基因的表達(dá)。

1.3 基因編輯靶位點(diǎn)選擇

登錄NCBI（National Center for Biotechnology Information）網(wǎng)站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/），根據(jù)4個(gè)基因登錄號(hào)（、、、）搜索其序列。參考CRISPR-P2.0（http://crispr.hzau. edu.cn/ CRISPR2/）網(wǎng)站推薦的靶位點(diǎn)，在靠近基因編碼蛋白的N端，挑選兩個(gè)特異性較高的位點(diǎn)（PAM序列前19/20 bp）序列作為sgRNA結(jié)合的靶位點(diǎn)。

1.4 CRISPR/Cas9敲除載體的構(gòu)建

CRISPR/Cas9敲除載體的構(gòu)建參考劉耀光院士發(fā)表論文所用方法，即先將靶位點(diǎn)構(gòu)建到入門載體pYLsgRNA-OsU6a/U3，然后利用Golden Gate連接方法將兩個(gè)sgRNA表達(dá)盒片段進(jìn)行高效組裝[18]。首先，構(gòu)建OsU6a/U3-Target1-sgRNA和OsU6a/U3-Target2-sgRNA兩個(gè)入門載體。兩個(gè)靶點(diǎn)接頭的正反向引物（Target-1F+Target-1R，Target-2F+Target-2R）退火形成雙鏈DNA片段Target-1和Target-2，采用邊切邊連的方法構(gòu)建入門載體。反應(yīng)體系（10 μL）包括1 μL pYLsgRNA-OsU6a/U3（約10 ng），1 μL接頭，1 μL 10× T4 DNA 連接酶緩沖液，0.2 μL T4 DNA 連接酶，0.5 μLⅠ，1 μL CutSmart緩沖液，5.3 μL dd H2O。然后，經(jīng)過(guò)兩輪巢式PCR擴(kuò)增sgRNA表達(dá)盒，瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物。最后，利用Golden Gate連接方法將兩個(gè)sgRNA表達(dá)盒構(gòu)建到表達(dá)載體pYLCRISPR/Cas9PUbi-H。反應(yīng)體系(10 μL)包括1 μL Target1-sgRNA(約20 ng)，1 μL Target2-sgRNA（約20 ng），1 μL pYLCRISPR/Cas9PUbi-H(約50 ng)，1 μL 10×T4 DNA連接酶緩沖液，0.2 μL T4 DNA 連接酶，0.5 μLⅠ，1 μL CutSmart緩沖液，4.3 μL dd H2O。將連接后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，對(duì)陽(yáng)性菌落利用引物對(duì)(Target-1F+Target-2R)進(jìn)行PCR鑒定排除假陽(yáng)性。陽(yáng)性克隆送公司進(jìn)行測(cè)序鑒定，確保CRISPR/Cas9敲除載體構(gòu)建成功。構(gòu)建pYLCRISPR /Cas9PUbi-RLKs-sgRNA載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105，對(duì)陽(yáng)性克隆經(jīng)PCR鑒定正確后備用。

表1 本研究所用引物序列

1.5 轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性苗的獲得

利用含有pYLCRISPR/Cas9PUbi-RLKs-sgRNA載體的農(nóng)桿菌對(duì)南粳9108愈傷組織進(jìn)行轉(zhuǎn)化，用潮霉素對(duì)轉(zhuǎn)化后的愈傷組織進(jìn)行兩次抗性篩選。誘導(dǎo)陽(yáng)性愈傷分化成苗，最后誘導(dǎo)生根。將生長(zhǎng)至合適大小的植株轉(zhuǎn)移至土壤中繼續(xù)生長(zhǎng)，取葉片提取DNA，并利用引物對(duì)（Cas9-F和Cas9-R）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，進(jìn)一步對(duì)陽(yáng)性苗進(jìn)行鑒定。

1.6 靶位點(diǎn)突變檢測(cè)

以1.5中檢測(cè)呈陽(yáng)性的葉片DNA為模板，在兩個(gè)靶位點(diǎn)的上游和下游設(shè)計(jì)一對(duì)引物（RLKs-T1T2-F+RLKs-T1T2-R，或者RLKs-T1-F+ RLKs-T1-R，RLKs-T2-F+RLKs-T2-R）對(duì)靶位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增。利用上游擴(kuò)增引物對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析。此外，以野生型南粳9108的基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序，通過(guò)比較野生型和突變體的測(cè)序峰圖判斷靶位點(diǎn)的突變類型。

1.7 鹽脅迫下的表型分析

突變體和野生型種子在37℃黑暗條件下萌發(fā)2 d，選擇長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗在1/2MS培養(yǎng)液中培養(yǎng)10 d，培養(yǎng)條件為溫度30℃、16 h光照/8 h黑暗。然后將其轉(zhuǎn)移至含有120 mmol/L NaCl的1/2MS培養(yǎng)液中培養(yǎng)8 d，拍照記錄幼苗長(zhǎng)勢(shì)。繼續(xù)在不含NaCl的1/2 MS培養(yǎng)液中恢復(fù)培養(yǎng)一周，拍照記錄幼苗長(zhǎng)勢(shì)并統(tǒng)計(jì)存活率。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫下四個(gè)類受體蛋白激酶的表達(dá)模式分析

為鑒定水稻中響應(yīng)鹽脅迫的類受體蛋白激酶，我們前期通過(guò)RNA-seq的方法篩選了水稻中受NaCl誘導(dǎo)或者抑制的基因。然后再進(jìn)一步利用熒光定量PCR的對(duì)RNA-seq的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，篩選到4個(gè)轉(zhuǎn)錄水平受NaCl調(diào)節(jié)的，其中1個(gè)基因()轉(zhuǎn)錄受誘導(dǎo)、3個(gè)基因(、、)轉(zhuǎn)錄受抑制(圖1)。此外，還檢測(cè)了ABA和甘露醇對(duì)表達(dá)水平的影響。結(jié)果表明基因受甘露醇誘導(dǎo)，基因轉(zhuǎn)錄受ABA和甘露醇抑制，基因轉(zhuǎn)錄受ABA抑制，基因轉(zhuǎn)錄受ABA誘導(dǎo)(圖1)。這些結(jié)果反映了這4個(gè)基因有可能參與到植物對(duì)鹽和非生物脅迫的響應(yīng)過(guò)程。

熒光定量檢測(cè)RLK基因的相對(duì)表達(dá)水平。**代表處理間差異達(dá)顯著水平（P<0.01）。

qPCR檢測(cè)RLK基因在灌漿期水稻的根、莖、葉、劍葉、葉鞘中的相對(duì)表達(dá)水平。

2.2 四個(gè)RLK基因在不同組織器官中表達(dá)分析

為了分析4個(gè)基因在不同組織器官中的表達(dá)情況，我們利用熒光定量PCR檢測(cè)了抽穗期這4個(gè)基因在水稻的根、莖、葉、劍葉和葉鞘中的相對(duì)表達(dá)水平。研究結(jié)果表明，和基因主要在根中表達(dá)，而在莖、葉、劍葉和葉鞘中的表達(dá)水平較低；基因主要在葉片中表達(dá)，而在根、莖、葉鞘中的相對(duì)表達(dá)水平較低；基因在根、莖、葉、葉鞘中均有表達(dá)，在劍葉中表達(dá)水平較高（圖2）。以上結(jié)果說(shuō)明在水稻不同組織器官中的表達(dá)情況不同，具有組織特異性。

2.3 RLK基因編輯載體的構(gòu)建

為了揭示這4個(gè)鹽脅迫響應(yīng)基因的生物學(xué)功能，利用基因編輯技術(shù)對(duì)其進(jìn)行定點(diǎn)敲除。根據(jù)CRISPR/Cas9編輯原理，參考生信預(yù)測(cè)網(wǎng)站CRISPR-P2.0（http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/）推薦的靶位點(diǎn)，在基因外顯子區(qū)設(shè)計(jì)兩個(gè)特異性較高的靶位點(diǎn)TS1（Target site 1）和TS2（Target site 2），作為sgRNA結(jié)合的靶位點(diǎn)（圖3-A）。兩靶點(diǎn)的正反向引物分別退火，形成的雙鏈DNA采用邊切邊連的方法（Ⅰ酶切，T4 DNA連接酶連接）構(gòu)建至入門載體pYLsgRNA-OsU6a/U3，形成兩個(gè)重組載體OsU6a-TS1-sgRNA和OsU6a-TS2- sgRNA。經(jīng)過(guò)兩輪巢式PCR分別擴(kuò)增兩個(gè)sgRNA表達(dá)盒，并采用邊切邊連的方法將兩個(gè)sgRNA表達(dá)盒構(gòu)建到表達(dá)載體形成pYLCRISPR/Cas9PUbi- TS1-sgRNA-TS2-sgRNA，的表達(dá)受啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)，兩個(gè)sgRNA受或啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)（圖3-B）。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化南粳9108的愈傷組織，分化出苗。

2.4 轉(zhuǎn)基因植株的鑒定及靶位點(diǎn)突變檢測(cè)

為了進(jìn)一步對(duì)轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株進(jìn)行鑒定，提取T0代植株的基因組DNA，利用基因的特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得了4個(gè)的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株（圖4）。然后對(duì)各轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株的變異位點(diǎn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增以分析其突變類型。本研究選取基因的功能缺失突變體以完成后續(xù)表型鑒定，突變體的Target 1位點(diǎn)發(fā)生雙等位突變，兩條染色體分別缺失1個(gè)堿基，Target 2位點(diǎn)為純合突變，缺失1個(gè)堿基；突變體的Target 1位點(diǎn)發(fā)生雙等位突變，兩條染色體分別插入1個(gè)堿基，Target 2位點(diǎn)為野生型；突變體的Target 1位點(diǎn)與Target 2位點(diǎn)之間發(fā)生345個(gè)堿基缺失；突變體的Target 1位點(diǎn)為純合突變，缺失4個(gè)堿基，Target 2位點(diǎn)為插入和堿基替換（圖5）。上述鑒定突變體的相應(yīng)基因位點(diǎn)均發(fā)生了移碼突變，造成基因功能缺失。

A?RLK基因靶位點(diǎn); B?pYLCRISPR/Cas9PUbi-RLKs-sgRNA載體。

2.5 突變體耐鹽性鑒定

為了測(cè)試4個(gè)基因突變對(duì)水稻耐鹽性的影響，采用水培法培養(yǎng)野生型和突變體幼苗，將生長(zhǎng)10 d（2葉1心期）的幼苗用120 mmol/L NaCl處理。結(jié)果表明，NaCl處理后幼苗生長(zhǎng)受到明顯抑制，葉片萎蔫發(fā)黃，植株大部分干枯，且突變體的生長(zhǎng)狀態(tài)與野生型沒有明顯差異（圖6-A）。存活率統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明鹽處理?xiàng)l件下突變體與野生型的存活率差異不顯著（圖6-B）。以上研究結(jié)果表明這4個(gè)基因缺失對(duì)水稻的耐鹽性沒有明顯影響。

3 討論

耐鹽水稻新品種選育的主要方式是利用耐鹽種質(zhì)與主推品種雜交和回交，然后通過(guò)多代的耐鹽表型鑒定結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇選育耐鹽且農(nóng)藝性狀優(yōu)良的水稻新品種[19]?；蚓庉嬁梢钥焖俑咝У貙?duì)單基因或多基因進(jìn)行編輯。近年來(lái)，通過(guò)該技術(shù)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了對(duì)水稻多個(gè)農(nóng)藝性狀調(diào)控基因的編輯，包括產(chǎn)量、育性、粒型等調(diào)控基因以及抗稻瘟病、抗除草劑等抗性基因[20-21]。利用基因編輯技術(shù)對(duì)水稻的耐鹽性進(jìn)行快速定向改良將是創(chuàng)制耐鹽水稻新種質(zhì)的重要方式。南粳9108是江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院選育并在江蘇省大面積推廣的優(yōu)良食味遲熟中粳品種，在0.3% NaCl脅迫條件下表現(xiàn)良好，適宜在沿海灘涂種植[19, 22]。本研究以南粳9108作為受體植株，利用CRISPR/Cas9對(duì)4個(gè)新的響應(yīng)鹽脅迫的基因進(jìn)行編輯，揭示在調(diào)控植物耐鹽性中的作用。

A－鑒定Os04g0275100基因編輯植株; B－鑒定Os07g0541900基因編輯植株; C－鑒定Os09g0353200基因編輯植株; D－鑒定Os01g0852100基因編輯植株。

A?Os04g0275100基因缺失突變體的突變類型；B?Os09g0353200基因缺失突變體的突變類型；C?Os07g0541900基因缺失突變體的突變類型；D?Os01g0852100基因缺失突變體的突變類型。

A?突變體和野生型的耐鹽表型分析；B?突變體和野生型的存活率比較。

類受體蛋白激酶家族在調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育、抗逆性以及激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面起著重要作用[23-24]。在水稻中，SIT1、SIK1、STRK1等類受體蛋白激酶已經(jīng)被報(bào)道參與植物對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)過(guò)程[10,11,23]。為了進(jìn)一步鑒定響應(yīng)鹽脅迫的成員，本研究對(duì)4個(gè)轉(zhuǎn)錄水平受鹽脅迫調(diào)控的基因進(jìn)行功能分析。苗期鹽脅迫處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，基因受到NaCl誘導(dǎo)，而其他3個(gè)基因受NaCl抑制，說(shuō)明它們可能參與植物對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)過(guò)程。此外，這4個(gè)基因的表達(dá)還受非生物脅迫相關(guān)激素ABA以及滲透脅迫物質(zhì)甘露醇的影響。我們對(duì)這4個(gè)基因在不同組織器官中的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，qPCR結(jié)果表明和基因在根中表達(dá)較多，基因主要在葉片中表達(dá)，基因在不同組織器官中有表達(dá)，說(shuō)明4個(gè)基因的表達(dá)具有組織特異性。

為進(jìn)一步分析這4個(gè)的功能，我們利用基因編輯技術(shù)分別對(duì)其進(jìn)行敲除，得到了相應(yīng)的功能缺失突變體。耐鹽性表型結(jié)果表明，4個(gè)突變體在鹽處理?xiàng)l件下的生長(zhǎng)狀態(tài)以及存活率均與野生型南粳9108沒有明顯差異。類受體蛋白激酶家族是植物最大的膜受體家族，成員眾多，在水稻中數(shù)目超過(guò)1100個(gè)，單獨(dú)缺失其中一個(gè)可能對(duì)植物表型并不產(chǎn)生顯著影響。本研究鑒定的4個(gè)并未表現(xiàn)出NaCl超敏或者脫敏表型，可能是由于同源基因引起的功能冗余現(xiàn)象導(dǎo)致的。通過(guò)創(chuàng)制雙突變或者多突變對(duì)進(jìn)一步研究的功能至關(guān)重要。此外，與參考基因組相比，南粳9108中4個(gè)基因序列或者啟動(dòng)子區(qū)可能存在SNP或者其他變異，導(dǎo)致RLK功能發(fā)生變化。通過(guò)高表達(dá)以及比對(duì)耐鹽程度不同的粳稻品種中這4個(gè)的基因型或表達(dá)水平可以進(jìn)一步揭示其在響應(yīng)植物鹽脅迫中的功能，進(jìn)而為耐鹽粳稻育種提供候選基因資源。

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Functional Analysis on Four Receptor-like Protein Kinases Under Salt Stress in Rice

LU Kai, CHEN Tao, YAO Shu, LIANG Wenhua, WEI Xiaodong, ZHANG Yadong*, WANG Cailin*

(Institute of Food Crops, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/Jiangsu High Quality Rice R&D Center/Nanjing Branch of China National Center for Rice Improvement, Nanjing 210014, China;*Corresponding author, E-mail: zhangyd@jaas.ac.cn; clwang@jaas.ac.cn)

Salinity stress is one of the main harsh environmental factor that greatly hinders rice growth and production, and it is meaningful to study salt-responsive genes for understanding the mechanisms behind plant response to salt stress and breeding salt tolerance variety. The receptor-like protein kinases are involved in regulation of plant cell signaling and responding to stress. In this study, we analyzed the expression pattern and function of fourunder salt stress.Quantitative real-time PCR was employed to detect the expression level of the fourunder NaCl treatment and its tissue specificity.The transcription ofwas induced by NaCl, which was expressed mainly in roots. The transcription ofwas inhibited by NaCl, which was expressed mainly in roots. The transcription ofwas inhibited by NaCl, which was expressed mainly in leaves. The transcription ofwas inhibited by NaCl, which was expressed in roots, shoots, leaves and sheath. Loss-of-function mutants of the fourwere obtained by sequencing, which exhibited the identical response to NaCl as compared with the wild-type.The expression of the fouridentified in this study were regulated by NaCl and were tissue-specified. Mutation of one of the fourhas no effects on rice salt tolerance. This study lays a basis for revealing the biological function and mechanisms of RLKs under salt stress.

receptor-like protein kinase; salt stress; CRISPR/Cas9;rice

10.16819/j.1001-7216.2021.0905

2020-09-05；

2020-09-18。

國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金資助項(xiàng)目(31700229); 江蘇省自然科學(xué)基金青年基金資助項(xiàng)目(BK20170594)。