韋雪露 盧柏亦 黃福鋼 李發(fā)活 劉芳 邱永福

白背飛虱取食后水稻幼苗內(nèi)源激素變化研究

韋雪露#盧柏亦#黃福鋼 李發(fā)活 劉芳 邱永福*

(廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院,南寧 530004; #共同第一作者;*通信聯(lián)系人, E-mail: yfqiu@126.com)

【】研究白背飛虱取食后苗期水稻內(nèi)源激素含量變化規(guī)律及其合成途經(jīng)相關(guān)基因的差異表達(dá)，為進(jìn)一步解析內(nèi)源激素調(diào)控水稻白背飛虱抗性機(jī)理提供參考。利用UPLC-MS方法測(cè)定了白背飛虱敏感材料9311與抗性近等基因系（NIL）在白背飛虱取食0、24和48 h后植株水楊酸（SA）、脫落酸（ABA）、茉莉酸（JA）和生長(zhǎng)素（IAA）4種激素含量的變化；qRT-PCR分析5個(gè)與激素合成途徑相關(guān)基因在抗、感植株中表達(dá)水平的差異。激素含量測(cè)定結(jié)果表明，白背飛虱取食的48 h內(nèi)，NIL中SA含量先升后降，而在9311中先降后升；ABA的含量在NIL中波動(dòng)較小，而在9311中先升后降；IAA和JA在抗、感植株中均持續(xù)上升。激素合成途徑相關(guān)基因、、和在接蟲后24 h的表達(dá)量差異在抗、感植株中均達(dá)到顯著或極顯著水平，而在0 h和48 h差異不顯著。則在接蟲后48 h的表達(dá)量差異在抗、感植株達(dá)到顯著水平，而接蟲0和24 h后差異不顯著。在接蟲或者對(duì)照處理中，JA和ABA含量在抗性植株中均高于感蟲植株，可能與抗性基因有較大關(guān)系；而SA含量和基因表達(dá)水平均表明抗性植株對(duì)白背飛虱的取食響應(yīng)更迅速，在抗蟲過程中能夠起到明顯的調(diào)控作用。

水稻；白背飛虱；內(nèi)源激素；qRT-PCR

白背飛虱[(Horváth)]是威脅水稻生產(chǎn)的重要害蟲之一，能影響水稻生理代謝過程，導(dǎo)致植株生長(zhǎng)緩慢，分蘗延遲，癟粒增加，植株黃化、矮縮，甚至枯死，進(jìn)而嚴(yán)重影響水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)[1, 2]。

植物內(nèi)源激素指植物自身合成的，微小劑量即可對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育、抗逆性以及衰老等過程進(jìn)行調(diào)控的生物活性物質(zhì)[3]。研究表明，水楊酸（SA）、茉莉酸（JA）、脫落酸（ABA）等植物激素在植物與害蟲互作體系中發(fā)揮重要作用[4-5]。煙粉虱取食能顯著誘導(dǎo)擬南芥或番茄植株內(nèi)源SA含量增加[6]；而當(dāng)它取食不同抗性的辣椒后JA含量均呈現(xiàn)先降后升的趨勢(shì)，JA合成相關(guān)基因和的表達(dá)上調(diào)[7]。另外，蚜蟲的取食均能提高不同鉀水平處理的小麥植株中JA含量[8]。巢豆油壺菌的侵害能明顯提高蠶豆病變部位的IAA含量[9]。植物內(nèi)源激素含量的變化，能進(jìn)一步介導(dǎo)植物的防御反應(yīng)。例如，昆蟲唾液效應(yīng)因子通過激活植物水楊酸信號(hào)途徑促進(jìn)昆蟲存活和繁殖[10]。損傷累積的JA能夠誘導(dǎo)相關(guān)防御基因的表達(dá)，并誘導(dǎo)植物產(chǎn)生具有揮發(fā)性的茉莉酸甲酯，實(shí)現(xiàn)植物間的遠(yuǎn)距離防御信號(hào)傳播[11]。內(nèi)源激素間互作調(diào)控植物抗性的研究也有報(bào)道，如SA與JA之間協(xié)同作用和拮抗作用受其自身的相對(duì)濃度調(diào)控[12-13]；而JA與ABA之間能協(xié)同參與抗蟲[14-15]?？梢姡谥参锱c昆蟲的互作過程中，不同類型的植物內(nèi)源激素起著非常重要的作用。

褐飛虱與白背飛虱同屬飛虱科昆蟲，它取食抗性水稻品種后葉片中ABA含量先升后降，而感蟲品種持續(xù)上升[16]。類似的研究也發(fā)現(xiàn)褐飛虱取食后導(dǎo)致水稻植株中SA、JA、乙烯（ETH）的含量上升，且普遍認(rèn)為SA和JA參與水稻對(duì)褐飛虱的防御反應(yīng)[17-19]。在水稻與白背飛虱的互作過程中，前期研究主要關(guān)注白背飛虱所傳播的病毒對(duì)水稻的影響。例如，無論攜帶南方水稻黑條矮縮病毒與否，白背飛虱取食后SA含量呈上升趨勢(shì)而JA含量呈下降趨勢(shì)[20]?？傊?，對(duì)水稻與白背飛虱的互作中植物內(nèi)源激素含量的變化研究偏少，有利于解析內(nèi)源激素在水稻抗白背飛虱調(diào)控中的作用，對(duì)綜合防控白背飛虱危害具有重要的參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 水稻材料

抗性近等基因系（簡(jiǎn)稱NIL）由抗蟲品系RBPH327與感蟲品系9311雜交和多代回交獲得，攜帶抗褐飛虱主效基因且兼抗白背飛虱[21]。白背飛虱蟲源從南寧市郊區(qū)水稻田收集并在感性品種“臺(tái)中本地1號(hào)”（TN1）上繁育。實(shí)驗(yàn)過程中采用2~3齡的若蟲。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

種子經(jīng)消毒、浸種催芽后播于盛有15 cm厚稻田泥的塑料桶（直徑26 cm，高18 cm），每個(gè)桶平均分成兩半，各播種約50?？埂⒏胁牧系姆N子。待幼苗長(zhǎng)至2葉齡，按每株平均接入8~10頭2~3齡白背飛虱若蟲。當(dāng)>90%的9311植株死亡時(shí)，評(píng)價(jià)抗、感材料的抗性級(jí)別。評(píng)價(jià)方法參照國際水稻所和Yang等[21]，根據(jù)植株生長(zhǎng)狀況分別評(píng)定為0、1、3、5、7、9 級(jí)別，每個(gè)材料所有單株的平均值為抗蟲級(jí)別。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

用于苗期激素含量測(cè)定和基因定量表達(dá)分析的材料播種于塑料杯（直徑10 cm，高16 cm）中，每杯播8粒。待幼苗長(zhǎng)至4葉齡，去除弱苗，每杯僅保留5株健壯幼苗，按每株接入10頭2~3齡的白背飛虱若蟲。按取食時(shí)間0、24、48 h設(shè)置，每個(gè)材料的每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)4個(gè)生物學(xué)重復(fù)，并在處理后48 h統(tǒng)一取樣。剪去水稻葉片，用錫箔紙包裹葉鞘后液氮速凍，于?80℃冰箱中保存。

1.3 水稻內(nèi)源激素含量測(cè)定

配置甲醇∶水∶甲酸的體積比為75∶20∶5的Mod-Bielesk溶液，每10 mL Mod-Bielesk加入0.1 g的交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮得到提取液。樣品加液氮研磨，稱取0.1 g加入0.5 mL提取液中，在冰水混合條件下超聲30 min，4℃條件下靜置16 h；接著加入1 mL二氯甲烷，超聲1 h，4℃條件下離心15 min，取下清液，氮吹至干；最后加入500 μL 50%色譜級(jí)甲醇水溶液（0.1%甲酸）復(fù)溶，溶液過孔徑為0.2 μm的NYLON66有機(jī)濾膜，得到植物激素待測(cè)液。

利用超高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用儀UPLC I-CLASS-XEVOG2-XSQTOF測(cè)定植物激素濃度， UPLC-MS方法所用條件如下：色譜柱（CNW Athena C18-WP），柱溫40℃，流動(dòng)相A為0.1%的甲酸，B為甲醇，進(jìn)樣量 10 μL，流速0.4 mL/min。離子源為電噴霧離子源（ESI），正、負(fù)離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM），毛細(xì)管電壓為4.8 kV，錐孔電壓為45 V，擋板電壓為700 V，離子源溫度為105℃，錐孔氣體流量為72 L/h ，脫溶劑氣體溫度為450℃，脫溶劑氣體流速為300 L/h。

1.4 總RNA提取與qRT-PCR檢測(cè)

采用Up Plus RNA Kit方法提取總RNA，HiScript Ⅲ RT SuperMix反轉(zhuǎn)錄試劑盒將樣品RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，水稻為內(nèi)參基因，采用TransGen Biotech公司的PerfectStartTMGreen qPCR SuperMix試劑盒及ABI-7500 熒光定量PCR儀進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。qRT-PCR所用引物序列見表1，其中基因和參與植物體內(nèi)SA合成調(diào)控[22, 23]?；?、和分別是JA、ABA和IAA合成途徑相關(guān)基因[24-26]。

表1 本研究所用引物序列

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用STST軟件對(duì)表達(dá)量進(jìn)行測(cè)驗(yàn)分析，<0.05和<0.01分別為顯著和極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗蟲鑒定結(jié)果

如圖1所示，在接蟲15 d后，絕大多數(shù)NIL植株表現(xiàn)正常的綠色，少部分植株的第一葉變黃，而9311基本枯萎，僅剩極少數(shù)單株存活；它們對(duì)白背飛虱的平均抗性值分別為3.5和8.4。可見，NIL高抗白背飛虱，而9311表現(xiàn)高感蟲性。

2.2 內(nèi)源激素含量的變化

接蟲48 h內(nèi)，NIL植株內(nèi)SA含量先升后降，而9311中先降后升。接蟲48 h時(shí)，9311的SA含量高于NIL。與0 h相比，NIL接蟲24 h時(shí)SA含量上升7.4%，48 h時(shí)下降5.4%；而9311在接蟲24 h時(shí)SA含量下降13.3%，48 h時(shí)上升7.3%（圖2-A）。

接蟲48 h內(nèi)，NIL和9311的JA含量均呈現(xiàn)上升，24~48 h增幅明顯，且NIL的JA含量均高于9311。在接蟲處理48 h，NIL和9311的JA含量分別是0 h時(shí)的4倍和8倍。表明JA在NIL、9311中對(duì)白背飛虱取食的應(yīng)答迅速（圖2-B）。

NIL接蟲后48 h內(nèi)ABA的含量均高于9311，且兩者在接蟲和對(duì)照處理間變化較小。其中，NIL中ABA含量為8~10 ng/g，而9311中ABA的含量為5~7 ng/g（圖2-C）。

A－苗期抗蟲鑒定；B－抗性值。**表示差異極顯著（P < 0.01）。

圖2 白背飛虱取食后抗、感植株內(nèi)源激素含量的變化

與0 h比較，9311植株中IAA含量在接蟲處理24 h顯著上升，增加24.3%，然后保持較穩(wěn)定的激素含量。NIL植株中IAA含量在接蟲24 h與0 h相似，而在接蟲48 h含量顯著增加，比未接蟲處理增加了10.9%。可見，在白背飛虱處理過程中，抗、感材料中IAA含量的變化規(guī)律不同（圖2-D）。

2.3 SA和JA合成途徑相關(guān)基因qRT-PCR分析

接蟲48 h內(nèi)NIL中的表達(dá)量先升后降，而其在9311中的表達(dá)量變化較小；在未接蟲（0 h）和接蟲處理24 h時(shí)抗、感植株間表達(dá)量呈現(xiàn)顯著差異（圖3-A）。在抗、感材料中表達(dá)量的變化規(guī)律與相似，表達(dá)量的顯著差異出現(xiàn)在接蟲48 h（圖3-B），表明和可能協(xié)同參與白背飛虱取食的響應(yīng)過程。

接蟲48 h內(nèi)基因在NIL中的表達(dá)量先上升后下降，但變幅較??；而在9311中的表達(dá)量持續(xù)上升，且在接蟲24 h與NIL相比存在顯著差異。另外，該基因在未接蟲處理（0 h）時(shí)，抗、感植株間的表達(dá)量也存在顯著差異（圖3-C）。

2.4 ABA和IAA合成途徑相關(guān)基因qRT-PCR

接蟲48 h內(nèi)，基因在NIL中的表達(dá)量先升后降，而在9311中先降后升，且在NIL中的表達(dá)量均高于9311，并在接蟲24 h達(dá)到顯著差異(圖4-A)。表明NIL可能通過提高ABA含量來抑制白背飛虱的取食。隨著白背飛虱取食時(shí)間延長(zhǎng)，在NIL中基因的表達(dá)先升后降，而在9311中持續(xù)降低。該基因在NIL中的表達(dá)水平均高于9311，在24 h時(shí)抗、感材料間達(dá)到極顯著差異(圖4-B)。

3 討論

植物的生長(zhǎng)發(fā)育和應(yīng)對(duì)外部環(huán)境的生物脅迫與非生物脅迫涉及多種內(nèi)源信號(hào)分子，其中植物激素作為基礎(chǔ)調(diào)控因子參與到植物抵御昆蟲取食的調(diào)控過程，如SA作為一種重要的細(xì)胞信號(hào)分子在植物誘導(dǎo)抗蟲反應(yīng)中也發(fā)揮著重要作用[6, 15, 19]。在本研究中，接蟲處理后，SA含量變化在抗、感材料中表現(xiàn)相反的規(guī)律，例如在抗性材料中，接蟲處理的0~24 h內(nèi)，SA開始累積合成，而感性材料在蟲處理24 h后，SA含量才增加，這表明抗性基因可能在SA調(diào)控水稻抗白背飛虱過程中的啟動(dòng)更加迅速。這與SA合成調(diào)控基因表達(dá)量檢測(cè)結(jié)果一致（圖2和圖3）。9311和NIL中JA含量在白背飛虱取食后都出現(xiàn)激增，基因的表達(dá)量在0~24 h也呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)，但近等基因系NIL在48 h出現(xiàn)下調(diào)，下調(diào)現(xiàn)象是否與NIL中抗性基因的調(diào)控有關(guān)有待進(jìn)一步研究。基因表達(dá)和SA合成相關(guān)基因、均出現(xiàn)“同升同降”的現(xiàn)象，可能是這兩種激素間存在一種相互制約平衡的機(jī)制，這與褐飛虱取食中的研究結(jié)果一致[17]。

　*和**表示在抗、感材料中表達(dá)量存在顯著和極顯著差異。

　*和**表示在抗、感材料中表達(dá)量存在顯著和極顯著差異。

ABA不僅調(diào)控非生物脅迫應(yīng)答，在應(yīng)對(duì)各種生物脅迫反應(yīng)中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。在本研究中，NIL接蟲處理48 h內(nèi)ABA含量均高于9311，表明ABA正向參與水稻抗白背飛虱的調(diào)控。有研究表明，高濃度的ABA能提高胼胝質(zhì)合成酶的活性，而胼胝質(zhì)在水稻抗稻飛虱的抗性機(jī)理起到重要作用[27]。另外，本研究發(fā)現(xiàn)抗、感植株中ABA與SA的升降趨勢(shì)剛好相反，推測(cè)兩者在白背飛虱處理過程中可能存在拮抗作用。IAA不僅在植物生理代謝、器官發(fā)育中起到重要作用，也與植物干旱、低溫、鹽堿等逆境脅迫以及病原菌、昆蟲等生物脅迫密切相關(guān)。它能夠獨(dú)立地或與SA、JA等激素互作共同參與到植物免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[17]。與SA含量變化規(guī)律相反，IAA在應(yīng)答白背飛虱取食的速度上NIL要慢于9311，表現(xiàn)在白背飛虱取食24 h時(shí)NIL中IAA含量與0 h基本持平，而9311有明顯增加。另外，本研究結(jié)果表明，在白背飛虱處理后抗、感植株中IAA的含量均上升，而其合成相關(guān)基因的表達(dá)量卻下調(diào)，這表明IAA可能在水稻抗白背飛虱的過程中未發(fā)揮調(diào)控作用。可見，在水稻與白背飛虱互作過程中植物內(nèi)源激素含量的變化過程非常復(fù)雜。

綜上所述，本研究通過分析白背飛虱取食后水稻苗期內(nèi)源激素含量變化及合成途徑相關(guān)基因的差異表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在接蟲或者對(duì)照處理中，JA和ABA含量在抗性植株中均高于感性植株，可能與抗性基因有一定的關(guān)系；而SA含量及其相關(guān)基因表達(dá)水平均表明抗性植株對(duì)白背飛虱的取食響應(yīng)更迅速，在抗蟲過程中能夠起到明顯的調(diào)控作用。

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Changes in Endogenous Hormones in Rice Seedlings Infested by White-backed Planthoppers

WEI Xuelu#, LU Baiyi#, HUANG Fugang, LI Fahuo, LIU Fang, QIU Yongfu*

(College of Agriculture, Guangxi University, Nanning 530004, China;#These authors contributed equally to this work;*Corresponding author, E-mail: yfqiu@126.com)

【】It is of great importance to study the changes of endogenous hormone concentration and relative expression level of associated genes in rice seedling after infestation by white-backed planthoppers (WBPH), which would provide reference for insight into WBPH resistance mechanism regulated by endogenous hormones.【】Salicylic acid (SA), abscisic acid (ABA), jasmonic acid (JA), and auxin (IAA) in susceptible line 9311 and near isogenic line (NIL) of resistance were quantified using UPLC-MS at 0, 24, and 48 h after infestation by WBPH; and the relative expression levels of five associated genes between resistant and susceptible lines were detected by qRT-PCR.【】SA concentration in NIL increased at 24 h after WBPH infestation and decreased at 48 h after WBPH infestation as compared to the untreated line; while it was on the contrary in 9311. ABA concentration was relatively stable in NIL after WBPH infestation, but increased at 24 h and then decreased at 48 h after WBPH infestation in 9311. Both IAA and JA concentration continuously increased in resistant and susceptible lines after infestation treatment. The result of qRT-PCR indicated that the relative expression levels of hormone pathway-related genes,,, andwere significantly different at 24 h after WBPH infestation between resistant and susceptible lines, but no significant difference was observed at 0 and 48 h after WBPH infestation. However, the relative expression level ofshowed significant difference at 48 h after WBPH infestation between the resistant and susceptible lines; whereas no significant difference was detected at 0 or 24 h after WBPH infestation.【】JA and ABA concentration in the resistant plants were higher than those in the susceptible ones, which was possibly associated with the resistant genes. SA concentration and the relative expression level of its associated genesandindicated that the resistant line responded more quickly to WBPH infestation, which suggested that it might play an important role during insect infestation.

rice;(Horváth); endogenous hormones; qRT-PCR

10.16819/j.1001-7216.2021.0815

2020-08-22;

2020-09-16。

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31360325); 大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃資助項(xiàng)目(20190593296)。