廖壯文 梁采宇 陳燦偉 楊進順 黃帥

廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院骨科（廣州510260）

前列腺癌（PCa）是上皮性惡性腫瘤的一種，是男性常見的惡性腫瘤［1］。前列腺癌之所以危害患者生命，主要是由于腫瘤轉(zhuǎn)移導致的一系列病理性破壞［2］。其中骨轉(zhuǎn)移是晚期前列腺癌發(fā)病率最高的并發(fā)癥，且一旦癌細胞擴散到骨骼，它們會顯著破壞正常的骨重建，導致骨折、神經(jīng)壓迫、疼痛和高鈣血癥［3］。晚期前列腺癌因淋巴結(jié)及遠處器官轉(zhuǎn)移等各種因素，導致治療效果差［4-5］。目前，在臨床治療上，能有效治療前列腺癌的方案很少，尤其是發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的患者預后很差［6-7］。但對于還沒發(fā)生轉(zhuǎn)移的前列腺癌，采取雄激素去除治療可獲得較好的療效［8-9］。所以，要治療前列腺癌、提高患者生存時間以及改善預后最關鍵的一步在于如何阻止或延遲患者前列腺癌遠處轉(zhuǎn)移的發(fā)生。

既往研究表明，前列腺癌為上皮性腫瘤的一種，其發(fā)生惡性腫瘤轉(zhuǎn)移主要是通過上皮細胞轉(zhuǎn)化為間質(zhì)性細胞［10］，使細胞極性喪失，失去細胞間的緊密連接，從而增強腫瘤細胞的遷移及侵襲能力，這個過程醫(yī)學上稱為上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）［11-12］。臨床上大部分前列腺癌患者經(jīng)過常規(guī)技術療法后［13］，可發(fā)現(xiàn)殘余的前列細胞癌細胞呈現(xiàn)顯著的EMT 表現(xiàn)［14］。因此，猜測EMT 對前列腺癌的轉(zhuǎn)移可能起著重要作用，抑制EMT 過程將大大增加前列腺癌的治療效果。

白鮮堿（Dictamnine）是一種天然生物堿，可從白鮮根中提取提純出來［15］。根據(jù)現(xiàn)有的研究實驗表明，白鮮堿對某些腫瘤細胞有著抑制細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的作用。但白鮮堿能否抑制前列腺癌細胞轉(zhuǎn)移和抑制EMT 及機制還不清楚。因此本次研究探究白鮮堿對前列腺癌細胞是否有著同樣的作用。

本次研究中，通過使用白鮮堿以及聯(lián)合使用Wnt 通道激活劑（LiCl）分別作用于前列腺癌細胞，分析前列腺癌細胞的增殖、遷移、侵襲能力的改變，從而探究出白鮮堿能否抑制前列腺癌EMT過程及其機制，為治療前列腺癌提供新的治療方向。

1 材料與方法

1.1 材料人前列腺癌PC-3 細胞購于ATCC（美國典型培養(yǎng)物保藏中心，美國），培養(yǎng)基采用型號RPMI-1640（加入1 × 105U/L 青霉素、100 mg/mL 鏈霉素和10%胎牛血清）。培養(yǎng)箱環(huán)境設置為37 ℃，5%CO2。將PC-3 細胞接種于培養(yǎng)基置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每兩天進行一次換液。取對數(shù)生長期細胞進行試驗。

1.2 MTS 檢測細胞增殖使用0.25%胰蛋白酶消化PC-3 細胞，重懸后接種于培養(yǎng)板（96 孔，每孔100 μL，細胞濃度3×104個/mL）。待細胞貼壁后，分別加入不同濃度的白鮮堿作為實驗組（0、50、100、200、400、800 μmol/L），并建立DMSO 對照組，每一組設定8 個復孔，培養(yǎng)48 h 后，測定各組細胞增殖情況。并得出白鮮堿對PC-3 細胞的半抑制濃度（IC50）。然后通過MTS 檢測半抑制濃度白鮮堿處理PC-3 細胞的增殖率，分別在培養(yǎng)0、1、2、3 d時，于每孔加入10 μL 的MTS 試劑，在37 ℃恒溫箱中孵育3 h，使用多功能酶標儀檢測各孔的吸光值A（490 nm），觀察白鮮堿在不同的處理時間對PC-3細胞增殖的影響。

1.3 白鮮堿對PC-3 細胞形態(tài)變化影響取PC-3細胞對數(shù)生長期細胞進行試驗。同時加入不同濃度的白鮮堿，實驗組（100、200 μmol/L）與對照組（0 μmol/L），繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后取出，分別于顯微鏡下觀察各組PC-3 細胞形態(tài)。

1.4 Transwell 檢測細胞遷移取對數(shù)生長期的PC-3 細胞進行遷移試驗。在Transwell 上室加入200 μL 含2 × 104個細胞的培養(yǎng)液（含0.2% FBS），下室分別加入600 μL 培養(yǎng)基（含10% FBS），其中分別加入終濃度為0、100 和200 μmol/L 的白鮮堿。配置PBS 溶液并進行預冷用以洗滌。待細胞培養(yǎng)24 h 后取出Transwell 小室，因小室上室存在殘余未穿過細胞，需使用PBS 洗滌3 次并用棉簽小心謹慎地去除。4%多聚甲醛固定細胞后，使用結(jié)晶紫染色20 min。染色后再次PBS 洗滌，置于顯微鏡觀察并計數(shù)穿過膜的細胞數(shù)，計算各組的平均值。

1.5 Transwell 檢測細胞侵襲提前使用Matrigel基底膠包被Transwell 上室后進行細胞侵襲實驗，后續(xù)步驟同上。

1.6 PCRPCR 技術檢測目標蛋白轉(zhuǎn)錄mRNA水平，首先提取總mRNA（使用RNA 分離試劑盒（Qiagen，USA），通過逆轉(zhuǎn)錄從總mRNA 中提取信使RNA（mRNA）和miRNA，該過程使用cDNA 合成試劑盒（RFS，美國）進行逆轉(zhuǎn)錄。使用iQ SYBR Green（BIO-RAD，USA）在CFX96 系統(tǒng)上擴增和定量互補DNA（cDNA）。Real-time PCR 按照標準方法進行。利用RiboBio（中國廣州）合成并純化U6、E-cadherin、vimentin、Snail、β-catenin 的引物。內(nèi)源性對照為U6 或甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）。最后計算基因相對表達水平（使用2-△△Ct法）。

1.7 蛋白質(zhì)免疫印跡（Western blot）實驗取對數(shù)生長期的PC-3 細胞，分成實驗組及對照組，其中實驗組按白鮮堿劑量分成不同的劑量組（100、200 μmol/L 的白鮮堿）。培養(yǎng)24 h 后，加入細胞裂解液裂解。刮取細胞、超聲裂解、低溫高速離心后收集上清液。根據(jù)說明書提取細胞核蛋白，測蛋白濃度。配置分離膠，分離膠凝固后于上層加入濃縮膠，同時插入梳子制作膠孔。待膠凝固后于膠孔中加入蛋白樣品，進行電泳。電泳完成后轉(zhuǎn)膜。加入50 g/L 脫脂奶粉進行搖床封閉90 min。分別加入一抗vimentin（1∶1 000）、E-cadherin（1∶1 000）、β-catenin（1∶1 000）、Snail（1∶1 000）和β-actin 抗體（1∶3 000）置于4 ℃冰箱過夜后，使用TBST 進行洗膜，加入HRP 標記的山羊抗兔抗體（1∶3 000），在室溫下避光孵育2 h。洗膜、熒光顯影。使用Quantity One 軟件掃描并做灰度分析。

1.8 LiCl 和白鮮堿聯(lián)合處理細胞采用Wnt 通路激活劑LiCl（5 μmol/L）處理細胞3 h 后，使用上述PCR 技術檢測相關mRNA 水平。隨后取出部分細胞樣本，再加入200 μmol/L 白鮮堿作用細胞24 h。剩余樣本作為對照組同時進行培養(yǎng)24 h。最后利用上述PCR 技術檢測相關mRNA 水平，利用Western blot 檢測相關蛋白的表達水平。

1.9 統(tǒng)計學方法采用SPSS 18.0 軟件分析數(shù)據(jù)。正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差的形式表示，通過獨立樣本的t檢驗兩兩比較，使用方差分析的方法分析多組間數(shù)據(jù)的比較。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的白鮮堿對PC-3 細胞增殖的影響將不同濃度的白鮮堿處理PC-3 細胞48 h 后，隨著白鮮堿濃度的升高，細胞增殖受到抑制的程度越來越顯著，且呈劑量依賴性，其中，PC-3 細胞增殖的半抑制濃度IC50約為200 μmol/L，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖1。

圖1 不同濃度白鮮堿對PC-3 細胞增殖的影響Fig.1 Effect of Dic at different concentrations on the proliferation of PC-3 cells

2.2 白鮮堿不同時間處理對PC-3 細胞增殖的影響以特定濃度（200 μmol/L）的白鮮堿處理前列腺癌PC-3 細胞，同時設立空白對照組（無白鮮堿）。培養(yǎng)24、48、72 h 分別檢測PC-3 細胞增殖率。通過結(jié)果分析，在相同的培養(yǎng)時間里，白鮮堿組的PC-3 細胞增殖比對照組的明顯減少，隨著時間的推移（48、72 h），兩組間的差異越大，白鮮堿組的PC-3 細胞增殖受抑制更明顯，且差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖2。

2.3 白鮮堿抑制PC-3 細胞的遷移能力行Transwell 小室遷移實驗后，切片染色后置于顯微鏡下可發(fā)現(xiàn)白鮮堿組的目標細胞數(shù)明顯比對照組的少，且高劑量組比低劑量組的遷移細胞數(shù)更少（P＜0.01）。證明白鮮堿可抑制PC-3 細胞的遷移能力（圖3）。

圖2 白鮮堿不同時間處理對PC-3 細胞增殖的影響Fig.2 Effect of Dic at different times on the proliferation of PC-3 cells

圖3 白鮮堿對PC-3 細胞遷移能力的影響Fig.3 Effect of Dic on the migration in PC-3 cells

2.4 白鮮堿抑制PC-3 細胞的侵襲能力根據(jù)Transwell 小室實驗結(jié)果，染色后置于顯微鏡下可發(fā)現(xiàn)白鮮堿組的目標細胞數(shù)明顯比對照組的少，且高劑量組（200 μmol/L）比低劑量組（100 μmol/L）的侵襲細胞數(shù)更少（P＜0.01）。證明白鮮堿可抑制PC-3 細胞的侵襲能力（圖4）。

2.5 白鮮堿對PC-3 細胞形態(tài)影響白鮮堿處理PC-3 細胞后，PC-3 細胞從棒狀或長紡錘形的間充質(zhì)群體變化成短紡錘形或圓形的扁平上皮細胞形態(tài)（圖5）。

2.6 白鮮堿抑制PC-3細胞EMT的作用為探究白鮮堿抑制PC-3 細胞EMT 作用，選擇觀察E-cadherin和vimentin 這兩種EMT 標志物的表達。PCR 及Western blot 法檢測結(jié)果表明，100、200 μmol/L 白鮮堿組的E-cadherin mRNA 及蛋白表達水平均比對照組水平高，且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。而高劑量組（200 μmol/L）的vimentin 的mRNA 及蛋白表達明顯受抑制，與對照組的差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，圖6）?？蓳?jù)此推測，白鮮堿具有逆轉(zhuǎn)前列腺癌細胞EMT 作用。

圖4 白鮮堿對PC-3 細胞侵襲能力的影響Fig.4 Effect of Dic on the invasion in PC-3 cells

圖5 白鮮堿對PC-3 細胞形態(tài)影響Fig.5 Influence of Dic on the morphology of PC-3 cells

2.7 白鮮堿抑制Wnt/β-catenin 信號途徑與對照組比較，100、200 μmol/L 白鮮堿組β-catenin 和Snail 的mRNA及蛋白表達降低（P＜0.05，圖6）。與對照組比較，Wnt激活劑LiCl組β-catenin和Snail 的mRNA 及蛋白表達增強（P＜0.05，圖7）。

與200 μmol/L 白鮮堿組比較，Wnt 激活劑LiCl與白鮮堿聯(lián)合應用會促進Snail 的mRNA 水平及蛋白的表達，抑制E-cadherin 的mRNA 及蛋白的表達（P＜0.01，圖8）。

3 討論

腫瘤轉(zhuǎn)移被認為是引起大多數(shù)腫瘤患者死亡的原因之一。腫瘤細胞的遷移、侵襲、抗凋亡和降解的能力有賴于EMT 過程［16-17］。EMT 是上皮細胞惡性腫瘤獲得遷移和侵襲能力的重要生物學過程，細胞骨架會轉(zhuǎn)化為以波形蛋白（vimentin）為主，在此過程中細胞黏附分子（如E-鈣黏蛋白）會明顯減少［18］。E-cadherin 可以阻止細胞侵襲和轉(zhuǎn)移擴散，其表達的下降是EMT 發(fā)生的關鍵因素［19］。

圖6 白鮮堿對PC-3 細胞vimentin、E-cadherin、Snail 和β-catenin mRNA 及蛋白表達的影響Fig.6 Effects of Dic on the mRNA and protein expression of vimentin，E-cadherin，snail and β-Catenin in PC-3 cells

圖7 100、200 μmol/L 白鮮堿組對PC-3 細胞Snail 和β-catenin mRNA 及蛋白表達的影響Fig.7 The effects of 100 and 200 μmol/L Dic groups on the mRNA and protein expression of snail and β-Catenin in PC-3 cells

圖8 白鮮堿與LiCl 聯(lián)合作用對PC-3 細胞Snail 和E-cadherin mRNA 及蛋白表達的影響Fig.8 The combined effects of Dic and LiCl on the mRNA and protein expression of snail and E-cadherin in PC-3 cells

白鮮堿作為一種天然生物堿，其在抗腫瘤、抗炎等方面表現(xiàn)出巨大的潛力［20］。實驗發(fā)現(xiàn)，使用白鮮堿可明顯抑制vimentin 的表達，同時促進Ecadherin 的合成。通過模擬遷移及侵襲試驗可見，使用白鮮堿的實驗組其遷移、侵襲的細胞數(shù)較對照組明顯減少。且使用白鮮堿的濃度越高，對PC-3 細胞遷移侵襲的能力抑制得更明顯?？赏茢喑觯柞r堿通過影響E-cadherin 和vimentin 的表達水平，從而抑制EMT 過程，導致人前列腺癌細胞的增殖及遷移受抑制。

本次研究中發(fā)現(xiàn)，在相同的處理時間（1、2、3 d），可發(fā)現(xiàn)各時間段的白鮮堿組與對照組相比，前列腺癌PC-3 細胞增殖明顯受抑制，且白鮮堿的濃度越大，抑制前列腺癌PC-3 細胞增殖的作用越強，而且受抑制的程度與白鮮堿濃度呈正相關性。而對于同一濃度的白鮮堿組，增加其培養(yǎng)的時間，可發(fā)現(xiàn)PC-3 細胞增殖的細胞數(shù)上升不明顯甚至下降，說明其受抑制的程度與處理時間呈正相關性。

通過觀察細胞形態(tài)，發(fā)現(xiàn)使用白鮮堿處理的PC-3 細胞發(fā)生了從棒狀或長紡錘形的間充質(zhì)群體變化成短紡錘形或圓形的扁平上皮細胞形態(tài)。隨著白鮮堿濃度的增加，其遷移能力及侵襲能力明顯下降。因白鮮堿可改變細胞形態(tài)變化，且其改變與EMT 的形態(tài)改變相反，推斷出白鮮堿可能可以抑制或逆轉(zhuǎn)EMT 過程，從而抑制前列腺癌的轉(zhuǎn)移和侵襲。

為探究在前列腺癌細胞中EMT 中信號通路的變化及分子調(diào)節(jié)，目前發(fā)現(xiàn)，最主要的信號通路為Wnt 信號通路［21-22］，Wnt 通路的發(fā)現(xiàn)為研究EMT 分子變化機制提供了新的方向［23］。對于Wnt 通路的研究表明，β-catenin 是其中最關鍵的因素之一，該蛋白可與自身免疫細胞（如T 細胞）產(chǎn)生的因子相結(jié)合，從而激活Snail 蛋白的合成。而Snail 可在E-cadherin基因上游與之結(jié)合，從而抑制啟動區(qū)域的激活，最終抑制E-cadherin 表達，促進EMT 的發(fā)生。本研究分別檢測出β-catenin 和Snail 蛋白的表達來探究白鮮堿抑制PC-3 細胞EMT 的分子機制。結(jié)果表明，對照組PC-3 細胞的β-catenin 和Snail mRNA 及蛋白表達較高，而白鮮堿組的β-catenin和Snail mRNA 及蛋白表達水平明顯下降，所以，可推斷出白鮮堿可能通過抑制β-catenin 和Snail蛋白的表達從而控制Wnt 途徑，進而抑制EMT 的發(fā)生，達到抑制前列腺癌PC-3 細胞的增殖及轉(zhuǎn)移。

為更進一步研究白鮮堿對EMT 抑制作用的機制，采取Wnt 通路激活劑LiCl，研究LiCl 對PC-3 細胞Snail 及E-cadherin 影響，以及聯(lián)合使用LiCl 與白鮮堿對PC-3 細胞Snail 及E-cadherin 影響。結(jié)果表明，通道激活劑LiCl 對Snail 蛋白的表達有著促進作用，從而可抑制E-cadherin 的表達。當使用白鮮堿與Wnt 通路激活劑LiCl 聯(lián)合處理前列腺PC-3 細胞后，發(fā)現(xiàn)LiCl 能夠拮抗白鮮堿誘導的Snail 蛋白的表達下調(diào)的能力，甚至可促進Snail 的表達，導致E-cadherin 表達下調(diào)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)白鮮堿可抑制人前列腺PC-3 細胞的增殖、遷移與侵襲。其中機制可能通過抑制前列腺癌細胞的EMT，而抑制EMT 的途徑可能是通過阻止Wnt/β-catenin/Snail 信號通路。因此，利用白鮮堿這一特性，在此基礎上進一步研究，為臨床治療前列腺癌及預防其遠處轉(zhuǎn)移開發(fā)出新的藥物或新的治療方案。