金偉，劉丹丹，韓海明

（濰坊市益都中心醫(yī)院 消化內(nèi)科一病區(qū)，山東 濰坊 262500）

0 引言

結(jié)腸癌是目前常見的消化系統(tǒng)疾病之一，近年來發(fā)病率日益上升，目前該病發(fā)病率在全球居第四，這一疾病嚴(yán)重威脅著人類色生命健康及其安全，手術(shù)切除是該疾病的最好的手段，而相應(yīng)的手術(shù)后的疾病的轉(zhuǎn)移及相應(yīng)的輔助治療也是十分麻煩。而腫瘤的耐藥性及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，這也是引起相應(yīng)患者死亡十分重要的原因之一。因此，如何更加完善的進(jìn)行治療，這儼然已經(jīng)當(dāng)前許多工作者研究的重點(diǎn)任務(wù)之一。順鉑為臨床一線抗癌化療藥物，但由于患者自身體內(nèi)的抗體藥物的毒副作用，其療效欠佳。研究發(fā)現(xiàn)化療藥物能激活腫瘤細(xì)胞的NF-κB，進(jìn)而降低其療效，提示NF-κB的激活可能參與腫瘤細(xì)胞耐藥[1]，抑制化療藥物對NF-κB的激活能增強(qiáng)其療效。

槲皮素一種化學(xué)有機(jī)化合物，屬于黃酮類化合物，這一藥物廣泛的存在于相應(yīng)的植物體內(nèi)，易于提取、分離及檢測。槲皮素有許多優(yōu)良的性質(zhì)，如：抗炎、抗腫瘤、抗血小板 凝集和心血管等在內(nèi)的許多作用，特別是能夠抑制許多相應(yīng)細(xì)胞數(shù)量的增值，需要重點(diǎn)研究的是逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞及其所對應(yīng)的抗藥性，藥耐藥性及增強(qiáng)其他抗腫瘤藥物作用的敏感性[2]，并可通過抑制NF-κB激活發(fā)揮抗腫瘤作用。我們應(yīng)該以結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞株對應(yīng)的靶細(xì)胞，探討槲皮素聯(lián)合順鉑對人結(jié)腸癌的相應(yīng)的效果，并很好的進(jìn)行相應(yīng)的檢測分析，結(jié)果是檢測NF-κB的表達(dá)探討其分子生物學(xué)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料。結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞來自人結(jié)腸癌細(xì)胞系，購自上海信裕生物科技有限公司；槲皮素（quercetin，Qu），該商品買自美國Sigma公司，純度為99.5%；順鉑購自Sigma公司，小牛血清的采購來自于杭州四季青生物工程材料對應(yīng)的研究機(jī)構(gòu)；RPMI1640培養(yǎng)基采買于Gibco公司；MTT采買于Sigma公司；兔抗NF-κBp65亞單位等相應(yīng)的抗體等產(chǎn)品等采買于Santa Cruz公司；免疫細(xì)胞結(jié)構(gòu)及其化學(xué)SP試劑，結(jié)合相應(yīng)的DAB顯液采買于福州邁新生物技術(shù)公司，未具體提到的其他試劑均為相應(yīng)的分析類的試劑樣品。

1.2 方法。細(xì)胞培養(yǎng)的常規(guī)路徑是將其處于RPMI1640中，該培養(yǎng)基中包含有相應(yīng)的小牛血清含量為10 mL/L，青霉素含量為100 kU/L，鏈霉素含量為100 mg/L，置37℃，50 mL/LCO2孵箱中長期進(jìn)行培養(yǎng)。取對數(shù)不同生長周期的細(xì)胞將其置于對應(yīng)的實(shí)驗(yàn)條件之下，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)后的細(xì)胞用于后續(xù)大的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)生產(chǎn)。將槲皮素和順鉑以不同的研究內(nèi)容及研究形式進(jìn)行分類，得到的相應(yīng)的細(xì)胞種類進(jìn)行不同程度的分類，主要可以分為：槲皮素組，順鉑組，槲皮素與順鉑聯(lián)合組。實(shí)驗(yàn)時(shí)將溶解于培養(yǎng)液中的藥物（槲皮素以DMSO預(yù)溶）加入培養(yǎng)細(xì)胞的新鮮培養(yǎng)液中，使藥物濃度達(dá)到：槲皮素組12.5，25，50μmol/L，（其中培養(yǎng)基中的DMSO含量不會(huì)超過5 g/L）；順鉑組，0.1，1，10 mg/L；聯(lián)合組，槲皮素為50μmol/L和順鉑為10 mg/L。

1.2.1 MTT試驗(yàn)：培養(yǎng)生長周期為HT-29細(xì)胞，將其接種到96孔培養(yǎng)板之上，每孔含有1×104個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行細(xì)胞組織液的更換，之后加入藥物，使其含量達(dá)到：槲皮素組，分別為12.5，25，50μmol/L；順鉑組，分別為0.1，1，10 mg/L；聯(lián)合組，槲皮素為50μmol/L和順鉑為10 mg/L。每組此外再額外加設(shè)4個(gè)復(fù)孔，在此基礎(chǔ)上再加設(shè)對應(yīng)的溶劑培養(yǎng)對照組，在此基礎(chǔ)上接著培養(yǎng)12，24，48 h，其每孔需要加入5 g/L的MTT20μL，接著需要在培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 h后，之后將其全部倒盡板中，在每孔之上需要更換其上的培養(yǎng)液，每孔分別加入150μLDMSO溶液，在此基礎(chǔ)上連續(xù)振蕩10 min，是培養(yǎng)皿中的對應(yīng)的結(jié)晶物在此中完全充分溶解，用酶標(biāo)儀再去測定各孔不同的參數(shù)，如；吸光度（A）值，再以各孔數(shù)值的均值作為平均值。根據(jù)所對應(yīng)的相應(yīng)的計(jì)算公式進(jìn)行計(jì)算，如計(jì)算抑制率：（1-實(shí)驗(yàn)組A/對照組A）×100%。

1.2.2 流式細(xì)胞儀分析：收集藥物處理24 h后的細(xì)胞，PBS洗后，用70 mL/L對應(yīng)的乙醇溶液進(jìn)行固定，4℃保存，染色前離心、之后需要經(jīng)過沉淀離心，之后再此基礎(chǔ)上再加入RnaseA及相應(yīng)的碘化丙啶進(jìn)行深度混合，避光30 min，之后再去檢測對應(yīng)的細(xì)胞儀，用于各種不同情況下細(xì)胞對應(yīng)的凋亡率，以及相應(yīng)的各細(xì)胞周期對應(yīng)所占的不同百分比。

1.2.3 NF-κB蛋白檢測：將預(yù)先消毒好的蓋玻片放入12孔培養(yǎng)板中，將細(xì)胞濃度調(diào)整至1×107個(gè)/L，每孔加1 mL，置CO2孵箱中培養(yǎng)24 h后，吸出舊培養(yǎng)液，在此基礎(chǔ)上分別加入順鉑10 mg/L，而后再繼續(xù)培養(yǎng)約10h之久。并在此基礎(chǔ)上建立相應(yīng)的陰性對照組，將其培養(yǎng)到預(yù)定時(shí)間之后，將相應(yīng)碎片取出，再將其培養(yǎng)至額定時(shí)間培養(yǎng)至預(yù)定時(shí)間將玻片取出，PBS洗后，4℃丙酮固定，而后將其樣品取出，對其進(jìn)行晾干固定，將其置于溫度4℃濕盒之中，連續(xù)存儲(chǔ)，以備用。采用SP染色法，DAB顯色。蘇木素復(fù)染，將其進(jìn)行脫水，在此后進(jìn)行透明化處理，并在相應(yīng)的照片中保存觀察，便于存儲(chǔ)。結(jié)果判斷：每張圖片在相應(yīng)的高倍顯微鏡下進(jìn)行隨機(jī)統(tǒng)計(jì)，總數(shù)量達(dá)2000個(gè)細(xì)胞，并在此基礎(chǔ)上計(jì)算相應(yīng)的陽性細(xì)胞數(shù)目的百分率。NF-κBp65抗體染色陽性細(xì)胞是一種單細(xì)胞核生物，此中會(huì)出現(xiàn)相應(yīng)的顏色，如：棕黃色顆粒，以及相應(yīng)的細(xì)胞核顏色進(jìn)行著重處理。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)取自3次以上，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的表述用“”表示，數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS 13.0軟件深入對其相應(yīng)的單因素進(jìn)行深入的方差分析。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測結(jié)果。槲皮素組，順鉑組及槲皮素與順鉑實(shí)驗(yàn)組下對結(jié)腸癌細(xì)胞處理后，結(jié)腸癌細(xì)胞增殖被有效的得到抑制，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析，可看到聯(lián)合用藥對結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制情況高于單獨(dú)使用順鉑，而槲皮素抑制作用最弱，且三組藥物的藥性隨時(shí)間延長也越發(fā)增強(qiáng)，見表1。

表1 藥物對結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞的抑制作用（，A）

表1 藥物對結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞的抑制作用（，A）

注：a P＜0.05，b P＜0.01vs對照組。

2.2 流式細(xì)胞儀結(jié)果。HT-29細(xì)胞經(jīng)過上述3組藥物進(jìn)行聯(lián)合治理之后，連續(xù)作用時(shí)間長超過24 h后，G1期前十分清晰顯著凋亡峰曲線。凋亡細(xì)胞相應(yīng)的凋亡率是最高（14.3±2.6）%，其凋亡率顯著高于順鉑組（8.5±2.0）%（P＜0.01）及槲皮素組（4.5±2.2）%（P＜0.01）。細(xì)胞周期，經(jīng)過相應(yīng)的藥物聯(lián)合處理24 h后，G2/M期細(xì)胞比率上升的比較+上升，G0/G1期細(xì)胞比率下降，表明細(xì)胞周期變化比較急促，被阻滯于G2/M期，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明聯(lián)合處理的實(shí)驗(yàn)組G2/M期細(xì)胞比率相對較為明顯，且有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果十分具有一定的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

表2 藥物對細(xì)胞凋亡生命軌跡及其細(xì)胞周期的影響（，%）

表2 藥物對細(xì)胞凋亡生命軌跡及其細(xì)胞周期的影響（，%）

注：aP＜0.05，bP＜0.01，vs槲皮素。

2.3 NF-κB表達(dá)的變化。HT-29細(xì)胞經(jīng)順鉑10 mg/L和聯(lián)合組：槲皮素為50μmol/L和順鉑為10 mg/L作用10 h，NF-κB胞核染色陽性率順鉑組（63.8±5.6）%明顯高于聯(lián)合組（23.2±2.3）%（P＜0.01），表明順鉑激發(fā)HT-29細(xì)胞NF-κB高表達(dá)，而槲皮素與順鉑聯(lián)合明顯抑制NF-κB的表達(dá)（Fig3），單用HT-29作用10h，NF-κB胞核染色陽性率(16.8±4.5)%低于對照組(22.8±5.8)%（P＜0.05）。

3 討論

誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡方法是當(dāng)前臨床使用的主要治療手段及治療方法。其中相應(yīng)的情況下的化療藥物激活對應(yīng)的NF-κB轉(zhuǎn)錄，這也是間接誘導(dǎo)其產(chǎn)生耐藥性主要原因，這一結(jié)果可以十分有效的抑制NF-κB的表達(dá)，此外還可以增強(qiáng)相應(yīng)的化療療效主要方法之一。槲皮素廣泛分布于于各種植物中，易于提取、分離及檢測，在人體內(nèi)幾乎無毒性，具有有抗炎、抗腫瘤、抗血小板凝集和心血管保護(hù)等多種藥理作用。槲皮素作為一種低毒有效的藥物，該藥物可單獨(dú)作用，并可以誘發(fā)相關(guān)腫瘤細(xì)胞凋亡[3]。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可有效抑制NF-κB的激活，在此基礎(chǔ)上進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[4]。在此階段可以有效的抑制NF-κB的表達(dá)，在此階段可以有效的增強(qiáng)相應(yīng)的化學(xué)生物藥的療效，在此基礎(chǔ)上對相應(yīng)的藥物耐藥途徑進(jìn)行分類比較及篩選。我們以人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞株相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析探索，研究表明通過免疫細(xì)胞化學(xué)的方法進(jìn)行深入數(shù)據(jù)的檢測，NF-κB在結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞株三組藥物作用后的表達(dá)，用NF-κB胞核染色陽性率反映NF-κB表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)順鉑10mg/L作用細(xì)胞10h后NF-κB表達(dá)增高，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Cipak等[5]研究現(xiàn)象進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)槲皮素對相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)對象HL60和LI210白血病細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，發(fā)現(xiàn)能增強(qiáng)相應(yīng)的順鉑對其細(xì)胞凋亡的作用，同時(shí)槲皮素，結(jié)合相應(yīng)的順鉑一起使用，其相應(yīng)的協(xié)同效果應(yīng)該與近些年的報(bào)道結(jié)果相一致.對應(yīng)的聯(lián)合組：槲皮素為50μmol/L和順鉑為10 mg/L作用10h后NF-κB表達(dá)明顯減弱，結(jié)果與王立忠等[6]對槲皮素聯(lián)合化療藥物在肺癌中的結(jié)果一致。我們證實(shí)槲皮素通過抑制激活NF-κB的表達(dá)可增強(qiáng)順鉑的療效。槲皮素具有相應(yīng)的毒副作用，其相應(yīng)的普及程度十分廣泛，普及價(jià)格也十分低廉，十分有助于當(dāng)前臨床聯(lián)合化療，局部或全身都可使用，為治療結(jié)腸癌提供更加安全、有效的手段。