熊輝, 張愛華, 郭雅靜, 周小航, 孫暉, 楊樂, 方衡, 閆廣利, 王喜軍,b,c,*

a National Chinmedomics Research Center&National TCM Key Laboratory of S erum Pharmacochemistry, Department of Pharmaceutical Analysis, Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China

b S tate Key Laboratory of Quality Research in Chinese Medicine, Macau University of S cience and Technology, Macau 999078, China

c National Engineering Laboratory for the Development of S outhwestern Endangered Medicinal Materials, Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plant, Nanning 530023, China

1.引言

由于中藥和人類疾病的復(fù)雜性，目前還沒有有效的研究策略來揭示中藥方劑化學(xué)成分與藥效之間的關(guān)系。與傳統(tǒng)的藥效追蹤分離相比，中藥血清藥物化學(xué)是揭示中藥方劑活性成分的有效工具，因?yàn)橹挥袕难逯邪l(fā)現(xiàn)的成分才有可能成為潛在的藥效物質(zhì)[1]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)被認(rèn)為是深度挖掘中藥方劑整體性和系統(tǒng)性本質(zhì)的有效技術(shù)，其核心思想是闡明活性成分、分子靶標(biāo)與疾病特征之間的生物學(xué)語言。與組學(xué)技術(shù)相結(jié)合，可以更有效地提高未知和已知靶點(diǎn)鑒定的準(zhǔn)確性[2]。代謝組學(xué)作為系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分，主要用于探索整個生物系統(tǒng)中受干擾的生物標(biāo)志物及其代謝通路的變化規(guī)律，特別適用于揭示生物體的臨床表型。因而代謝組學(xué)在新藥開發(fā)方面具有巨大潛力[3]。血清藥物化學(xué)、代謝組學(xué)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的整合分析可以將活性化合物和靶標(biāo)與內(nèi)源性代謝物相關(guān)聯(lián)，有利于挖掘出活性化合物的功能靶標(biāo)[4]。

膽汁淤積性黃疸是由于肝內(nèi)外膽管梗阻或肝細(xì)胞受損導(dǎo)致膽汁酸異常積聚而引起的臨床病癥，主要表現(xiàn)為黃疸[5]。茵陳蒿湯首載于東漢張仲景《傷寒論》，是治療膽汁淤積性黃疸的經(jīng)典方劑，全方由大黃（DH）、茵陳（YC）、梔子（ZZ）三味藥組成[6]。大量臨床和動物研究表明，茵陳蒿湯在利膽去黃、抗肝損傷、抗肝纖維化、抗炎、胰腺保護(hù)和抗腫瘤等方面療效顯著[6-7]。雖然茵陳蒿湯在治療膽汁淤積性黃疸的相關(guān)動物模型和臨床研究中的療效已得到廣泛證實(shí)，且無明顯毒副作用，但中藥復(fù)雜性和多樣性的問題嚴(yán)重阻礙了對其活性成分和保肝機(jī)制的研究，這極大地制約了對其先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)。

本研究開發(fā)了基于中藥血清藥物化學(xué)、代謝組學(xué)技術(shù)、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證于一體的破譯中藥方劑活性成分和核心靶標(biāo)的新策略，研究設(shè)計的思路如圖1 所示。首先招募了226名受試者和60只小鼠，從臨床和動物兩個方面通過非靶標(biāo)代謝組學(xué)技術(shù)揭示疾病生物標(biāo)志物并評價方劑療效。其次通過中藥血清藥物化學(xué)方法發(fā)現(xiàn)茵陳蒿湯的體內(nèi)活性成分，并借助包括數(shù)據(jù)庫挖掘、Metabo‐Analyst 3.0軟件Pathway Analysis模塊（MetPA）和獨(dú)創(chuàng)通路分析軟件（IPA）組學(xué)平臺的綜合網(wǎng)絡(luò)分析方法確定了潛在作用靶點(diǎn)。鑒于小鼠和人類生物過程之間的高度相似性，進(jìn)一步整合臨床和動物數(shù)據(jù)揭示茵陳蒿湯的活性化合物、作用靶標(biāo)和疾病核心生物標(biāo)志物。最后，對關(guān)鍵靶標(biāo)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，證明該研究策略的可行性。這種方法有助于挖掘中藥生物活性化合物，并發(fā)現(xiàn)其治療疾病的新靶點(diǎn)。

2.實(shí)驗(yàn)方法

2.1.藥物和試劑

所有藥材均購自哈爾濱同仁堂藥店。包括：α-奈異硫氰酸酯（美國Sigma-Aldrich）；乙醇和橄欖油（國藥化學(xué)試劑北京有限公司）；多藥耐藥相關(guān)蛋白2（ABCC2）、法尼醇X 受體（FXR）、膽固醇7α-羥化酶（CYP7A1）、多藥耐藥相關(guān)蛋白3（ABCC3）和尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶1A1（UGT1A1）試劑盒（江蘇晶美生物科技有限公司）；直接膽紅素（DBIL）、堿性磷酸酶（ALP）、總膽紅素（TBIL）、丙二醛（MDA）、總超氧化物歧化酶（TSOD）和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）試劑盒（中生北控生物科技股份有限公司）；總膽汁酸（TBA）、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γ-GT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）（江蘇南京建成生物工程研究所）。

圖1.整合血清藥物化學(xué)、代謝組學(xué)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究策略。ROC：受試者工作特征曲線；IPA：基于云計算的一體化生物通路分析軟件；UGT1A1：尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶1A1；CYP7A1：膽固醇7α-羥化酶；FXR：法尼醇X受體；ABCC：多藥耐藥相關(guān)蛋白；TCMSP：中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺；有數(shù)據(jù)支持的疾病基因數(shù)據(jù)庫（DigSee）、人類基因數(shù)據(jù)庫（GeneCards）和藥物靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫（TTD）均是疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫。

2.2.實(shí)驗(yàn)動物與給藥方案

無特定病原體（SPF）雄性Balb/c小鼠[體重為（20±2）g]購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司。將60 只動物分為兩類數(shù)據(jù)集。其中數(shù)據(jù)集1包括對照組和黃疸組，數(shù)據(jù)集2包括對照組、黃疸組和茵陳蒿湯組。每組12只小鼠。對于黃疸組合茵陳蒿湯組，每只小鼠按每10 g 體重給藥0.1 mL灌胃，連續(xù)14天每天早上給予0.013 g·mL?1的干姜溶液和下午給予12.5%（體積分?jǐn)?shù)）的乙醇溶液，第15天給予1.5 mg·mL?1的ANIT 橄 欖 油 溶 液，第16 天 給 予1.0 mg·mL?1的ANIT橄欖油溶液。空白組按每10 g體重給藥0.1 mL灌胃，連續(xù)14天給予生理鹽水，第15、16天給予橄欖油。茵陳蒿湯組從第17 天開始按照每千克體重給藥10 mg 灌胃，連續(xù)7 天給予茵陳蒿湯溶液（5 g·mL?1），而對照組按每10 g體重給藥0.1 mL灌胃，給予蒸餾水[8]。所有實(shí)驗(yàn)操作經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)，并按照《赫爾辛基宣言》原則進(jìn)行。

2.3.臨床受試者與給藥方案

2016—2018 年在黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院共納入黃疸患者106 例，健康受試者120 例。納入病例標(biāo)準(zhǔn)：血清TBIL 水平約為171 μmol·L?1，同時血清ALP、γ-GT和DBIL水平也升高，臨床可以明顯觀察到皮膚組織黃染。排除病例標(biāo)準(zhǔn)：妊娠及哺乳期婦女、參加其他藥物試驗(yàn)或資料不全等影響療效性和安全性判斷者、腎或造血系統(tǒng)等嚴(yán)重原發(fā)性疾病者、精神病者。茵陳蒿湯由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院熬制包裝。黃疸患者連續(xù)15 天口服茵陳蒿湯治療，每天兩次，每次100 mL。受試對象分為兩類數(shù)據(jù)集：數(shù)據(jù)集1包含120例健康受試者和72例黃疸患者；數(shù)據(jù)集2包含120例健康受試者、72例黃疸患者和34例接受茵陳蒿湯治療的患者。

2.4.樣品制備

小鼠摘眼球取血，臨床受試者靜脈取血，新鮮血液樣品靜置30 min 后離心（4 ℃，3000 r·min?1，15 min），取上清液?80 ℃貯存[9]。樣品分析前室溫解凍，取小鼠200 μL血清加600 μL 甲醇，渦旋30 s，靜置30 min，于4 ℃、13 000 r·min?1離心5 min，移取上清液2 μL用于血液代謝分析。

臨床血清樣本2 mL，加入40 μL磷酸溶液，渦旋30 s混勻，上樣到預(yù)先活化和平衡好的固相萃取柱上，用1 mL 水淋洗，棄去淋洗液，再以2 mL 甲醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫液并于45 ℃氮?dú)庀麓蹈?，?50 μL甲醇復(fù)溶殘渣，離心15 min（13 000 r·min?1，4 ℃），上清液過0.22 μm 濾膜后，進(jìn)樣5μL 供血中移行成分分析。小鼠血清樣本處理方式與臨床血清樣本一致。

2.5.臨床生化指標(biāo)和組織病理學(xué)評價

按試劑盒說明檢測ALP、ALT、AST、DBIL、TBIL、γ -GT、 TBA、 GSH-Px、 MDA、 T-SOD、 UGT1A1、CYP7A1、FXR、ABCC3、ABCC2 的值。小鼠采血后肝組織用蘇木精-伊紅染色，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。

2.6.代謝組學(xué)分析

檢測系統(tǒng)為Waters AcquityTMUPLC液相色譜儀（Wa‐ters 集團(tuán)公司，美國）和SynaptTMG2Si-HDMS 質(zhì)譜儀（Waters集團(tuán)公司，美國）。小鼠和臨床受試者血清樣品分別在ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）（Waters 集團(tuán)公司，美國）和ACQUITY UPLC HSS C18 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8μm）（Waters 集團(tuán)公司，美國）上分離。代謝組學(xué)分析參數(shù)（見附錄A中表S1至表S3），包括色譜條件（柱溫、流速、梯度洗脫程序、進(jìn)樣量）以及質(zhì)譜條件（離子源溫度、脫溶劑溫度、樣品錐孔電壓、毛細(xì)管電壓），確保結(jié)果的穩(wěn)定、準(zhǔn)確和可重復(fù)。小鼠和臨床受試者血液代謝分析的柱溫分別設(shè)定為40 ℃和45 ℃，進(jìn)樣量均為2 μL。

2.7.代謝物及代謝通路分析

代謝物鑒定方法與先前研究[9]報道的一致。通過多元統(tǒng)計方法結(jié)合精確的分子量、分子式[接近于零的i-FIT值，小于百萬分之五（5 ppm）偏差]、二級碎片以及人類代謝組數(shù)據(jù)庫（HMDB）、ChemSpider、京都基因和基因組百科全書（KEGG）和Metlin 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行代謝物表征。為了挖掘黃疸相關(guān)的核心代謝通路，利用MetaboAnalyst 3.0軟件Pathway Analysis模塊對回調(diào)血液標(biāo)記物涉及的代謝通路進(jìn)行富集分析，將其可視化并功能注釋。

2.8.茵陳蒿湯血中移行成分分析

血樣在ACQUITY UPLC HSS C18 色譜柱上分離，流速0.4 mL·min?1，柱溫45 ℃。其他色譜和質(zhì)譜參數(shù)見附錄A 中表S4 和表S5 [9]。借助Progenesis QI 軟件結(jié)合MassLynx 4.1軟件中元素組成模塊及二級碎片對血中移行成分進(jìn)行表征。

2.9.小分子整合分析

首先利用中醫(yī)藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫分析平臺（TC‐MSP）、SwissTargetPrediction和SuperPred數(shù)據(jù)庫搜索入血成分靶點(diǎn)信息，并利用人類基因數(shù)據(jù)庫（GeneCards）、藥物靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫（TTD）、人類孟德爾遺傳病的數(shù)據(jù)庫（OMIM）[10-11]搜索與膽汁淤積性黃疸疾病相關(guān)靶點(diǎn)，將作用靶點(diǎn)名稱進(jìn)行規(guī)范，合并去重。把藥物成分與疾病的交集基因通過Cytoscape 3.0 軟件繪制成“活性成分-靶點(diǎn)-疾病”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖。為了便于合理解釋生物過程、分子功能和細(xì)胞成分中所涉及的功能靶標(biāo)，借助基因間功能關(guān)聯(lián)關(guān)系的數(shù)據(jù)庫（STRING）進(jìn)行基因本體論（GO）富集分析和KEGG通路富集分析，預(yù)測其作用機(jī)制。進(jìn)一步整合MetaboAnalyst 3.0和IPA代謝組學(xué)分析平臺，挖掘已鑒定生物標(biāo)志物涉及的代謝通路，分析包括基因、蛋白質(zhì)、生物標(biāo)志物在內(nèi)的各種小分子互作網(wǎng)絡(luò)。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和血清藥物化學(xué)相結(jié)合方式捕捉入血成分富集的代謝靶標(biāo)和代謝通路，整合代謝組學(xué)數(shù)據(jù)分析平臺的分析結(jié)果，最終構(gòu)建茵陳蒿湯活性成分-靶點(diǎn)-代謝物相關(guān)聯(lián)的核心機(jī)制網(wǎng)絡(luò)圖。

2.10.數(shù)據(jù)分析

結(jié)果用統(tǒng)計產(chǎn)品與服務(wù)解決方案軟件（SPSS）處理，以±SD表示，多組間比較使用單因素方差處理，兩組之間的比較用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，P<0.05時為差異顯著。

3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1.臨床化學(xué)及組織病理學(xué)

與健康對照組比較，黃疸組年齡、性別和體重指數(shù)、肝功能檢查的各項(xiàng)指標(biāo)[包括前白蛋白原（PA）、球蛋白（GLB）、白蛋白（ALB）和總蛋白（TP）]均無顯著差異，而ALP、ALT、AST、TBIL、DBIL、間接膽紅素（IBIL）、CHE、γ-GT 存在極顯著差異（P<0.01），說明臨床所采集的黃疸病例均滿足診斷標(biāo)準(zhǔn)，可用于本實(shí)驗(yàn)研究。數(shù)據(jù)集2包含120例健康受試者、72名黃疸患者和34名接受茵陳蒿湯治療的黃疸患者。經(jīng)茵陳蒿湯治療后，患者ALT、AST、TBIL、DBIL、IBIL 表達(dá)水平呈明顯下降趨勢（P<0.01或P<0.05），皮膚黃染有所緩解。進(jìn)一步建立黃疸相關(guān)模型組小鼠，可以觀察到，與對照組比較，模型組小鼠血清AST、DBIL、TBIL、ALP、ALT、γ-GT、TBA含量明顯升高（P<0.01或P<0.05），而T-SOD含量明顯下調(diào)（P<0.05）；肝組織中MDA 含量上調(diào)不明顯，GSH-Px 含量明顯下調(diào)[P< 0.01；見附錄A 中圖S1（b）和表S7]。組織病理學(xué)結(jié)果顯示，模型組小鼠肝細(xì)胞出現(xiàn)大面積水腫現(xiàn)象，肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞已高度水腫至氣球樣病變，局部伴有炎細(xì)胞浸潤現(xiàn)象[見附錄A 中的圖S1（c）]。與模型組相比，茵陳蒿湯組小鼠壞死面積明顯減小，水腫程度減少，肝臟各組織結(jié)構(gòu)（小葉、肝板、血竇、小葉中央靜脈、葉間靜脈、動脈、膽管）清晰，未見明顯異常，偶見少量炎細(xì)胞分布其中[見圖S1（c）]。這些結(jié)果說明茵陳蒿湯治療黃疸療效顯著。

3.2.代謝軌跡和輪廓分析

EZinfo軟件通常用于對數(shù)據(jù)進(jìn)行非監(jiān)督型主成分分析（PCA），以便獲得不同組代謝軌跡的直觀聚類信息。如圖2所示，從小鼠和人的二維PCA和三維PCA得分圖中觀察到黃疸組和對照組之間的代謝輪廓明顯分離，這從血清基峰色譜圖中得到進(jìn)一步證實(shí)（見附錄A中的圖S1）。為了進(jìn)一步評價茵陳蒿湯的療效，本研究發(fā)現(xiàn)，無論臨床黃疸患者還是黃疸模型小鼠給予茵陳蒿湯治療后均出現(xiàn)了出現(xiàn)明顯的回調(diào)趨勢，表明茵陳蒿湯可以有效恢復(fù)黃疸病的病理進(jìn)程（見附錄A中的圖S3）。

3.3.代謝物鑒定和代謝途徑分析

進(jìn)一步進(jìn)行偏最小二乘判別分析（OPLS-DA），獲得正負(fù)離子掃描模式下的得分圖、差異權(quán)重貢獻(xiàn)值（VIP）散點(diǎn)圖和S-Plot圖，篩選出在兩組間表達(dá)存在顯著性差異（P<0.05）且對分組貢獻(xiàn)度（VIP>1.0）大的內(nèi)源性離子作為候選離子。最終根據(jù)數(shù)據(jù)庫和二級碎片信息，確定小鼠12 個生物標(biāo)志物（正負(fù)離子模式分別為4 個和8 個），以及來自臨床受試者的14 個生物標(biāo)志物（正負(fù)離子模式分別為7 個和7 個）（見附錄A 中的表S9）。如圖3 和圖4所示，為了直觀地闡述茵陳蒿湯如何影響代謝變化并明確回調(diào)的核心生物標(biāo)記物，進(jìn)一步繪制了生物標(biāo)志物相對強(qiáng)度的散點(diǎn)圖和熱圖。同時為了驗(yàn)證已鑒定代謝物的分類能力，以這些代謝物為評價基礎(chǔ)，從192名受試者中隨機(jī)選擇60 個臨床樣本進(jìn)行代謝輪廓分析。結(jié)果顯示數(shù)據(jù)集被分為兩個聚類，其中32個樣本被歸為組1，28個樣本被歸為組2。通過觀察兩組中每個樣本的信息，發(fā)現(xiàn)組1和組2中的樣本分別是健康組和黃疸組受試者，本研究初步驗(yàn)證了篩選標(biāo)記物的適用性（見附錄A中的圖S4）。

為了減少用于臨床診斷和分析應(yīng)用的代謝物數(shù)量，以接收者操作特征曲線下的面積（AUC）大于0.9為篩選原則，本研究對臨床受試者14個生物標(biāo)志物和小鼠的12個

生物標(biāo)志物進(jìn)行了指標(biāo)數(shù)降低。按照AUC 值排序，在臨床受試者中排名靠前的?；悄懰帷⒛懠t素葡糖醛酸苷、膽紅素和膽綠素被認(rèn)為是核心生物標(biāo)志物[見附錄A 中的表S10和圖S5（a）]；在模型小鼠中排名靠前的是磷脂酰膽堿（16∶0/16∶0）、膽紅素、磺甘膽酸鹽（2?）、溶血磷脂膽堿[18∶1(9Z)]、膽綠素和牛磺膽酸[見附錄A 中的表S11和圖S5（b）]。巧合的是膽紅素、膽綠素和?；悄懰嵩谂R床受試者和小鼠樣本中均被發(fā)現(xiàn)。聚焦臨床核心標(biāo)記物膽紅素、膽綠素、膽紅素葡萄糖醛酸苷、?；悄懰幔柚鶰etaboAnalyst 3.0 軟件Pathway Analysis 模塊進(jìn)行通路富集分析，發(fā)現(xiàn)這些標(biāo)記物主要涉及卟啉和葉綠素代謝以及初級膽汁酸生物合成。本研究進(jìn)一步借助KEGG數(shù)據(jù)庫構(gòu)建代謝通路和生物標(biāo)志物的關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，如圖5所示。

圖2.小鼠和臨床受試者非靶標(biāo)血液代謝組學(xué)的多變量分析輪廓圖。負(fù)離子模式（a、c）和正離子模式（b、d）下小鼠二維和三維PCA得分圖；負(fù)離子模式（e、g）和正離子模式（f、h）下臨床受試者二維和三維PCA得分圖。PC：主成分。

3.4.潛在靶標(biāo)預(yù)測

為了進(jìn)一步挖掘黃疸病的潛在功能機(jī)制，本研究借助IPA組學(xué)分析平臺對黃疸模型小鼠和黃疸患者內(nèi)在功能變化及典型通路（見附錄A 表S12 和S13）進(jìn)行分析，識別出核心生物標(biāo)記物牛磺膽酸、膽酸、膽紅素葡萄糖醛酸苷、膽紅素和膽綠素參與膽汁淤積相關(guān)的膽汁酸生物合成、血紅素降解、白細(xì)胞介素-10 信號傳導(dǎo)和法尼醇X 受體/維甲酸X 受體（FXR/RXR）的激活，并構(gòu)建了生物標(biāo)志物預(yù)測網(wǎng)絡(luò)。根據(jù)典型代謝通路和關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)模塊分析結(jié)果（見附錄A 中的圖S6、S7），本研究發(fā)現(xiàn)UGT1A1、ABCC3 等下游蛋白參與血紅素降解通路，調(diào)節(jié)膽紅素的表達(dá)，下游蛋白ABCC3、FXR 以及上游蛋白CYP7A1 參與初級膽汁酸生物合成和FXR/RXR 的活化，調(diào)節(jié)?；悄懰岬谋磉_(dá)。給藥治療后，發(fā)現(xiàn)茵陳蒿湯能激活FXR、ABCC3 和UGT1A1，抑制CYP7A1 的活性，表明這三類通路在調(diào)節(jié)膽汁酸平衡中起著至關(guān)重要的作用（見附錄A中的圖S8、S9）。代謝組學(xué)結(jié)合IPA 平臺分析，可以推斷茵陳蒿湯可通過調(diào)節(jié)膽汁酸的初級生物合成、血紅素降解和FXR/RXR途徑，阻止小鼠和人類黃疸病的發(fā)生發(fā)展。

3.5.茵陳蒿湯血中移行成分分析

數(shù)據(jù)導(dǎo)入Progenesis QI軟件進(jìn)行預(yù)處理，通過主成分分析和有監(jiān)督的OPLS-DA篩選變量（圖6）。一般模型組中不存在但給藥組中存在的變量被視為潛在的入血成分。結(jié)合先前茵陳蒿湯體外成分分析結(jié)果，在臨床受試者中共表征了26 種原型成分和三種代謝物，在模型小鼠中共表征了33種原型成分和三種代謝物（見附錄A中的表S14、S15）。

圖3.臨床受試者數(shù)據(jù)集2各組血液代謝物含量的變化圖。（a）健康受試者、黃疸患者和茵陳蒿湯治療患者三組之間生物標(biāo)志物相對強(qiáng)度散點(diǎn)圖；（b）健康受試者、黃疸患者和茵陳蒿湯治療患者三組之間生物標(biāo)志物相對強(qiáng)度熱圖。結(jié)果用xˉ±SD表示。*P<0.05和**P<0.01與健康受試者相比；#P<0.05和##P<0.01與黃疸患者相比。S1P：鞘氨醇-1-磷酸酯；PC：磷脂酰膽堿；TG：甘油三酯。

圖4.小鼠數(shù)據(jù)集2各組血液代謝物含量的變化圖。（a）對照組、模型組和茵陳蒿湯組三組之間生物標(biāo)志物相對強(qiáng)度散點(diǎn)圖；（b）對照組、模型組和茵陳蒿湯組三組之間生物標(biāo)志物相對強(qiáng)度熱圖。結(jié)果用xˉ±SD表示。*P<0.05和**P<0.01與對照相比；#P<0.05和##P<0.01與模型組相比。

3.6.網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)靶標(biāo)分析

本部分整合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和血清藥物化學(xué)的方法，首先通過數(shù)據(jù)庫搜索入血成分作用靶標(biāo)以及黃疸疾病相關(guān)靶標(biāo)，兩者取交集，在小鼠和人類中鑒定出79個共同靶標(biāo)。為了闡明茵陳蒿湯的潛在功能機(jī)制，構(gòu)建了方劑-單味藥-化合物-靶點(diǎn)-黃疸病網(wǎng)絡(luò)，如圖7所示，詳細(xì)信息見附錄A 中的表S16、S17。進(jìn)一步提取共同靶標(biāo)用于GO 和KEGG富集分析，按照?lgP的降序排序以區(qū)分差異。使用在線繪圖網(wǎng)站Omishare 工具可以看到排名靠前的位置（見附錄A 中圖S10）。小鼠和臨床受試者GO 富集分析的結(jié)果顯示，主要定位在生物過程中，如對化學(xué)物質(zhì)的反應(yīng)、對化學(xué)刺激的細(xì)胞反應(yīng)和對脂質(zhì)的反應(yīng)；細(xì)胞成分中細(xì)胞部分和細(xì)胞外區(qū)部分的?lgP評分和基因數(shù)量最高；分子功能分析中酶結(jié)合和蛋白質(zhì)結(jié)合突出。根據(jù)KEGG途徑富集分析的氣泡圖，本研究發(fā)現(xiàn)排名靠前的主要代謝通路包括膽汁分泌、卟啉和葉綠素代謝以及初級膽汁酸生物合成。動物和臨床試驗(yàn)結(jié)果可相互驗(yàn)證。

3.7.整合分析

通過對基于血清藥物化學(xué)的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和血液代謝組學(xué)數(shù)據(jù)之間的交叉分析，推測卟啉和葉綠素代謝、膽汁分泌和初級膽汁酸生物合成可能是膽汁淤積性黃疸病的發(fā)病機(jī)制及茵陳蒿湯的作用機(jī)制。從人體和動物兩個維度，聚焦生物標(biāo)志物和上游靶點(diǎn)，進(jìn)而提取了兩類受試對象共同的核心靶點(diǎn)，包括ABCC2、ABCC3、UGT1A1、FXR 和CYP7A1。與核心靶標(biāo)相關(guān)的活性成分包括京尼平苷、濱蒿內(nèi)酯、異鼠李素、槲皮素、柚皮素、大黃酸、綠原酸和山奈酚。與上述相關(guān)的膽紅素、膽綠素、膽紅素葡萄糖醛酸苷和?；悄懰岽x物可作為膽汁淤積性黃疸病核心生物標(biāo)志物，由此構(gòu)建了茵陳蒿湯的功能機(jī)制圖，如圖8 所示。以膽紅素、膽綠素、膽紅素葡萄糖醛酸苷和牛磺膽酸在內(nèi)的4種臨床關(guān)鍵代謝物為基礎(chǔ)模型進(jìn)行內(nèi)部驗(yàn)證，從226 名受試者中隨機(jī)抽取60 名受試者進(jìn)行PCA 分析。結(jié)果表明構(gòu)建的模型可以有效區(qū)分健康受試者和黃疸患者整體代謝輪廓[見附錄A中的圖S11（a）]。此外，ROC分析顯示AUC值等于0.996，表明所選代謝物的模型可用作診斷黃疸病方法的有效補(bǔ)充[見附錄A中的圖S11（b）]。

3.8.靶標(biāo)驗(yàn)證

為了對預(yù)測靶標(biāo)進(jìn)行驗(yàn)證，本研究采用了酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒對靶蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測。與健康對照組相比，黃疸患者血清中ABCC2、ABCC3、UGT1A1 和FXR 表達(dá)水平顯著降低，CYP7A1 表達(dá)水平顯著升高（P<0.01 或P<0.05）。給藥治療能回調(diào)相應(yīng)靶蛋白的表達(dá)。因此可以推斷茵陳蒿湯可通過調(diào)節(jié)CYP7A1、ABCC2、ABCC3、UGT1A1 和FXR 的活性來促進(jìn)膽汁分泌和抑制膽汁酸生物合成，達(dá)到治療黃疸病的效果。

圖5.臨床黃疸患者和黃疸模型小鼠相關(guān)代謝通路網(wǎng)絡(luò)圖。藍(lán)色框內(nèi)代表的是黃疸小鼠主要代謝通路，包括脂質(zhì)代謝（a）和膽汁酸代謝（b）。橙色框內(nèi)代表黃疸患者主要代謝通路，包括脂質(zhì)代謝（c）和膽汁酸代謝（d）。利用MetaboAnalyst 3.0軟件Pathway Analysis分析了存在于黃疸小鼠（e）和臨床黃疸患者（f）體內(nèi)的代謝通路概況。方框內(nèi)ID號代表本項(xiàng)研究中檢測到的代謝標(biāo)志物的KEGG號，其中，紅框中的ID號代表差異表達(dá)的代謝物，其他框內(nèi)的ID號代表在本項(xiàng)研究中未被檢測到的代謝物。箭頭上的符號代表KEGG提供的關(guān)鍵酶；紅色方框旁邊的箱型圖呈現(xiàn)了對照組（紅色）和黃疸組（綠色）之間的相對差異強(qiáng)度。LacCer：乳糖酶基（神經(jīng)）鞘氨醇；CoA：輔酶A。

圖6.基于血清藥物化學(xué)方法建立的UPLC-MS色譜圖及其多變量分析輪廓圖。（a）小鼠茵陳蒿湯組和黃疸組的色譜圖；（b）小鼠茵陳蒿湯組和黃疸組之間的S-plot圖；（c）小鼠中已鑒定化合物15.55_283.0253在茵陳蒿湯組和黃疸組之間相對含量的趨勢圖；（d）小鼠茵陳蒿湯組和黃疸組之間的PCA得分圖；（e）臨床茵陳蒿湯組和黃疸組的色譜圖；（f）臨床茵陳蒿湯組和黃疸組之間的S-plot圖；（g）臨床樣本已鑒定化合物15.55_283.0253在茵陳蒿湯組和黃疸組之間相對含量的趨勢圖；（h）臨床茵陳蒿湯組和黃疸組之間PCA得分圖。P[1]：S-plot圖中的第一主成分；P(corr)[1]：S-plot圖中第一主成分的偏相關(guān)系數(shù)。

4.討論

膽汁淤積性黃疸患者肝細(xì)胞內(nèi)的膽汁流阻滯，導(dǎo)致有毒膽汁酸積聚，從而加重黃疸癥狀。研究發(fā)現(xiàn)通過抑制膽汁生成、刺激膽汁分泌可改善肝細(xì)胞功能，減輕機(jī)體膽汁酸代謝紊亂[12-15]。基于此，茵陳蒿湯可通過調(diào)節(jié)膽汁酸的生成和分泌來發(fā)揮治療作用。大量研究發(fā)現(xiàn)，茵陳蒿湯能明顯改善黃疸癥狀，相關(guān)黃疸生物標(biāo)志物也有所回調(diào)。本課題組前期通過IPA軟件和PCMS代謝組學(xué)分析平臺挖掘出了茵陳蒿湯的潛在靶點(diǎn)和活性成分。然而，茵陳蒿湯治療膽汁淤積性黃疸的潛在機(jī)制尚未清楚闡明[16-17]，這些結(jié)果只是在相關(guān)動物模型中探究出來的，需要進(jìn)一步結(jié)合臨床加以驗(yàn)證。為此本文從臨床和動物兩個角度建立整合中藥血清藥物化學(xué)、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和代謝組學(xué)的研究策略對其進(jìn)行探究。疾病的表型是機(jī)體內(nèi)源性異常紊亂整體作用的結(jié)果，因而疾病表型的研究需要從系統(tǒng)水平上進(jìn)行全面的多角度分析，進(jìn)行深度數(shù)據(jù)挖掘，才能逐步被轉(zhuǎn)化為點(diǎn)對點(diǎn)的靶向驗(yàn)證。

基于臨床和動物的多層次分析，本研究建立了一個茵陳蒿湯潛在功能機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)圖（圖8）。有趣的是，通過對兩類研究對象的富集分析，推斷ABCC2、ABCC3、CYP7A1、UGT1A1 和FXR 可能是茵陳蒿湯的作用靶點(diǎn)，其生物活性成分可調(diào)節(jié)多條信號通路，從而在黃疸病的治療中表現(xiàn)出協(xié)同增效的作用。這些發(fā)現(xiàn)闡明了茵陳蒿湯治療膽汁淤積性黃疸的新的分子機(jī)制。此外，從代謝組學(xué)角度，對這兩類受試對象進(jìn)行多步實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了系統(tǒng)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)膽紅素、膽綠素和?；悄懰峥勺鳛樵\斷膽汁淤積性黃疸病理變化的新型潛在生物標(biāo)志物。?；悄懰崾悄懼置诘闹匾盘柗肿樱徽J(rèn)為是膽汁淤積性黃疸期間膽汁酸排泄異常的臨床診斷指標(biāo)，同時具有免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用[18]。在這些鑒定的生物標(biāo)志物中膽紅素和膽綠素也在臨床黃疸診斷中發(fā)揮重要作用[19]。膽紅素是膽綠素通過膽綠素還原酶合成的代謝產(chǎn)物，在膽汁淤積性黃疸期間，膽汁酸的積累導(dǎo)致線粒體功能障礙和膽紅素葡萄糖醛酸化阻滯，會刺激膽綠素轉(zhuǎn)化為膽紅素，以發(fā)揮抗氧化和細(xì)胞保護(hù)作用[20]。幾項(xiàng)研究表明，與黃疸疾病相關(guān)的代謝物，包括犬尿烯酸和D-葡萄糖醛酸在動物血清和尿液中均被檢測到異常表達(dá)[14,21]。當(dāng)前研究明確了膽紅素、?；悄懰?、膽紅素葡萄糖醛酸苷和膽綠素在預(yù)測和診斷臨床黃疸疾病的作用。當(dāng)然其他相關(guān)代謝物包括L-同型半胱氨酸、膽酸、溶血磷脂酰膽堿[18∶1(9Z)]和溶血磷脂酰膽堿[16∶1(9Z)]在人和小鼠之間存在差異，這可能歸因于物種之間的內(nèi)在差異。

圖7.茵陳蒿湯入血成分和黃疸病共同作用靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)圖。（a）小鼠黃疸病和入血成分的特有和共同靶標(biāo)。網(wǎng)絡(luò)圖呈現(xiàn)36個茵陳蒿湯入血成分（橘色），以及與茵陳蒿湯（紅色）關(guān)聯(lián)的三種單味藥（淺藍(lán)色）和與膽汁淤積性黃疸（紅色）相關(guān)的323個特有靶標(biāo)（藍(lán)色），兩者有79個共同靶標(biāo)（綠色）。（b）臨床黃疸病和入血成分的特有和共同靶標(biāo)。網(wǎng)絡(luò)圖呈現(xiàn)29個茵陳蒿湯入血成分（橘色），以及與茵陳蒿湯（紅色）關(guān)聯(lián)的三種單味藥（淺藍(lán)色）和與膽汁淤積性黃疸（紅色）相關(guān)的323個特有靶標(biāo)（藍(lán)色），兩者有79個共同靶標(biāo)（綠色）。

圖8.整合代謝組學(xué)、血清藥物化學(xué)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究策略，發(fā)現(xiàn)茵陳蒿湯潛在靶標(biāo)和活性化合物。（a）茵陳蒿湯治療黃疸病的功能機(jī)制圖；（b）新穎的靶標(biāo)和潛在活性化合物之間的靶向關(guān)系。

整合中藥血清藥物化學(xué)、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和代謝組學(xué)研究，不僅進(jìn)一步驗(yàn)證了茵陳蒿湯的療效，而且有助于更好地挖掘其功能機(jī)制。基于此，本研究通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了一種新的代謝機(jī)制參與茵陳蒿湯的治療。臨床黃疸受試者和黃疸小鼠鑒定的代謝物均顯示膽汁酸和脂質(zhì)代謝紊亂，這與膽汁酸生物合成和膽汁分泌失調(diào)有關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示黃疸患者或黃疸小鼠膽汁酸水平高于對照組，說明膽汁酸生物合成和膽汁分泌異常與膽汁淤積性黃疸密切相關(guān)。大量研究表明，抑制膽汁酸合成，促進(jìn)膽汁分泌有利于改善膽汁淤積性黃疸病的癥狀[22]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)進(jìn)一步證明，茵陳蒿湯參與調(diào)節(jié)膽汁酸的分泌和合成，涉及的作用靶標(biāo)包括ABCC2、ABCC3和CYP7A1。多藥耐藥相關(guān)蛋白（MRP）家族，屬于三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體（ABC）的一類有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體超家族，包括ABCC2、ABCC3等，負(fù)責(zé)葡萄糖醛酸苷的轉(zhuǎn)運(yùn)[23-24]。ABCC2 又稱多藥耐藥相關(guān)蛋白2（MRP2），參與肝細(xì)胞內(nèi)膽紅素、膽汁酸硫酸鹽等多種兩親性陰離子的分泌，以維持膽汁酸穩(wěn)態(tài)，在膽汁分泌中起著舉足輕重的作用[25]。CYP7A1 是膽汁酸生物合成經(jīng)典途徑中的限速酶，具有調(diào)節(jié)膽固醇穩(wěn)態(tài)和膽汁酸合成的功能。與大量黃疸模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，與對照組相比，黃疸組ABCC2 的表達(dá)水平顯著降低，CYP7A1 的表達(dá)水平顯著升高，茵陳蒿湯治療后有所回調(diào)，這一結(jié)果在本實(shí)驗(yàn)的動物和臨床數(shù)據(jù)中得到進(jìn)一步支持[26]。由于ABCC2 的激活，二價膽鹽在膽管側(cè)膜細(xì)胞的分泌能力增強(qiáng)，這可以解釋為什么茵陳蒿湯組血清膽汁酸水平下調(diào)。ABCC3 通常不在正常肝細(xì)胞膜中表達(dá)，一旦發(fā)生膽汁淤積，肝細(xì)胞基底膜中ABCC3的表達(dá)水平明顯升高。此外，由于ABCC3轉(zhuǎn)運(yùn)底物與ABCC2轉(zhuǎn)運(yùn)底物具有廣泛的同源性，一般認(rèn)為ABCC3的高表達(dá)水平可補(bǔ)償ABCC2，以減輕膽汁淤積性黃疸期間膽堿誘導(dǎo)的肝毒性損傷[27]。這進(jìn)一步說明了ABCC3在保護(hù)膽汁淤積性黃疸中的重要作用，正如本研究從不同組間ABCC3 蛋白表達(dá)水平的比較中所證實(shí)的那樣。

由于膽汁生成、分泌和排泄障礙導(dǎo)致膽汁酸量積聚，形成肝內(nèi)膽汁淤積。相應(yīng)地，膽汁流不能正常輸送到十二指腸，而流回血液，增加了血液中膽汁酸的水平。膽汁酸含量過高會激活FXR，直接降低CYP7Al活性，從而抑制膽汁酸生物合成[28-29]。FXR 是激素核受體超家族的一員，通過誘導(dǎo)特殊靶基因的表達(dá)，在膽汁酸的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和分泌中發(fā)揮關(guān)鍵作用。激活FXR 能抑制膽汁酸生物合成，并促進(jìn)膽汁酸分泌到膽管，從而保護(hù)肝細(xì)胞免受膽汁酸的損傷[30-31]。當(dāng)前實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)茵陳蒿湯可通過激活FXR 來協(xié)同調(diào)節(jié)CYP7A1 活性，從而改善膽汁淤積性黃疸的癥狀并恢復(fù)膽汁酸紊亂。到目前為止，眾多的證據(jù)表明膽汁酸的改變可以激活或抑制FXR 來調(diào)節(jié)CYP7A1活性[32-33]。此外，與黃疸組相比，在茵陳蒿湯治療后的黃疸受試者中觀察到了CYP7A1 下調(diào)和FXR 上調(diào)的相反變化，說明兩者之間存在一定的關(guān)聯(lián)。

黃疸病內(nèi)源性病理機(jī)制復(fù)雜，本研究發(fā)現(xiàn)茵陳蒿湯通過調(diào)節(jié)卟啉和葉綠素代謝，可減輕小鼠和人類黃疸的嚴(yán)重程度（因?yàn)槟懼俜e性黃疸病的病理變化主要是由膽紅素功能障礙引起的）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，茵陳蒿湯同時調(diào)節(jié)卟啉和葉綠素代謝中的膽紅素、膽綠素和膽紅素葡萄糖醛酸苷表達(dá)。UGT1A1 作為卟啉和葉綠素代謝的關(guān)鍵限速酶，能促進(jìn)肝臟中膽紅素葡萄糖醛酸苷的形成以及ABCC2或ABBC3介導(dǎo)的膽汁分泌[34-35]。從這個角度來看，UGT1A1 和ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在肝臟膽紅素代謝異常的功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮核心作用。抑制UGT1A1可以阻止膽紅素和葡萄糖醛酸的結(jié)合，從而導(dǎo)致膽紅素水平升高。靶向卟啉和葉綠素代謝的藥物將阻斷它們的過表達(dá)，可作為治療黃疸病的候選藥物[36]，因此UGT1A1可能成為發(fā)現(xiàn)黃疸藥物的有效靶點(diǎn)。茵陳蒿湯治療后顯著增加UGT1A1的活性，促進(jìn)膽紅素的下調(diào)和膽紅素葡萄糖醛酸苷的上調(diào)，同時，ABCC2或ABCC3介導(dǎo)的膽紅素葡萄糖醛酸苷分泌的改善對于黃疸病癥狀的緩解也至關(guān)重要。

總之，茵陳蒿湯通過增強(qiáng)FXR、UGT1A1、ABCC2和ABCC3 的活性以及抑制CYP7A1 的活性來發(fā)揮治療膽汁淤積性黃疸的作用。當(dāng)然需要進(jìn)一步研究去評價茵陳蒿湯的活性成分，包括京尼平苷、濱蒿內(nèi)酯、異鼠李素、槲皮素、柚皮素、大黃酸、綠原酸和山奈酚在核心代謝通路上發(fā)揮的作用。其中京尼平苷和濱蒿內(nèi)酯治療黃疸相關(guān)疾病的有效性已經(jīng)得到了驗(yàn)證[37-39]。該研究對于開展中藥方劑體內(nèi)活性小分子的發(fā)現(xiàn)及其治療靶點(diǎn)的研究具有重要參考價值。

5.結(jié)論

本研究建立了一種新穎的用于發(fā)現(xiàn)茵陳蒿湯的潛在靶點(diǎn)和活性小分子的研究策略，并有效解析了人類和小鼠膽汁淤積性相關(guān)黃疸病的代謝紊亂規(guī)律。值得注意的是，本研究發(fā)現(xiàn)茵陳蒿湯8 個關(guān)鍵成分可以靶向調(diào)控核心靶標(biāo)CYP7A1、ABCC2、ABCC3、UGT1A1 和FXR，參與調(diào)節(jié)膽汁酸的初級生物合成、卟啉和葉綠素代謝以及膽汁分泌代謝途徑。該策略為有效發(fā)現(xiàn)中藥的活性化合物和治療靶點(diǎn)提供方法學(xué)支撐。

致謝

本文獲得國家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（81430093、81830110、81861168037）和黑龍江頭雁創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目資助。

Compliance with ethics guidelines

Hui Xiong, Ai-Hua Zhang, Ya-Jing Guo, Xiao-Hang Zhou, Hui Sun, Le Yang, Heng Fang, Guang-Li Yan, and Xi-Jun Wang declare that they have no conflict of interest or financial conflicts to disclose.

Appendix A.Supplementary data

Supplementary data to this article can be found online at https://doi.org/10.1016/j.eng.2020.12.016.