康厚祥*, 彭燁#, Kngyu Hu , 鄧雨飛 Mri Bllizzi , Dipli Rni Gupt , Nur Uin Mhmu ,Alfro S.Urshim , Snjoy Kumr Pul , Gry Ptrson , 周益林 周雪平 M Tofzzl Islm ,*,王國梁,*

a S tate Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural S ciences, Beijing 100193, China

b Department of Plant Pathology, The Ohio S tate University, Columbus, OH 43210, US A

c Institute of Biotechnology and Genetic Engineering (IBGE), Bangabandhu S heikh Mujibur Rahman Agricultural University, Dhaka 1706, Bangladesh

dCentro de Ciências Agrárias, Universidade Federal de S ?o Carlos,Araras, S P CEP 13600-000, Brazil

e Foreign Disease-Weed S cience Research Unit(FDWS RU), United S tates Department of Agriculture-Agricultural Research S ervice (US DA-ARS), Ft.Detrick, MD 21702, US A

1.引言

半活體營養(yǎng)型真菌稻瘟菌侵害許多谷物，包括兩種最重要的主要糧食作物——水稻和小麥。稻瘟病是由稻瘟菌（M.oryzae Oryza,MoO）致病型引起的，近三個世紀(jì)前在中國和日本有報道，目前已在超過85 個國家發(fā)現(xiàn)[1]。1985 年，由稻瘟菌小麥致病型（M.oryzae Triticum,MoT）引起的小麥麥瘟病在巴西巴拉那州的6 個市被首次發(fā)現(xiàn)[2]，并且20世紀(jì)90年代初其在南美洲的分布逐漸擴大到約3×106hm2[3]。2016年，這種病害首次在南美洲以外被發(fā)現(xiàn)，麥瘟病暴發(fā)于孟加拉國的8個地區(qū)，并迅速成為對小麥生產(chǎn)的嚴(yán)重威脅[4]。2017 年年初，多家報紙報道，在印度-孟加拉國邊境附近的印度麥田首次觀察到類似麥瘟病的癥狀[5]。2016—2019 年間，該病害蔓延至孟加拉國的20 個區(qū)，并繼續(xù)對孟加拉國的糧食營養(yǎng)安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅[6]。根據(jù)2016 年在孟加拉國首次發(fā)現(xiàn)麥瘟病的地區(qū)的農(nóng)業(yè)氣候條件，最近的一項研究報告稱，印度、巴基斯坦和孟加拉國多達7×106hm2的麥田容易受到MoT感染[7]。保守估計產(chǎn)量損失5%~10%，每年潛在經(jīng)濟損失可能為1.32 億~2.64 億美元。因此，迫切需要一種綜合的方法來控制孟加拉國麥瘟病發(fā)生，并防止這種病害傳播到世界其他地區(qū)。

MoT 如何感染小麥植株，其宿主的替換，以及那些有利于麥瘟病流行的氣候因素目前還不清楚。雖然MoT既可以侵染小麥植株的葉片，也可以侵染小麥植株的穗部，但穗部感染會造成更大的經(jīng)濟影響。葉軸或花梗的感染會阻礙光合作用產(chǎn)物的運輸，殺死穗狀花序的上部。在對病原菌有利的條件下，該病可造成高達100%的產(chǎn)量損失[8]。然而，由于穗部麥瘟病是在沒有葉瘟病視覺癥狀的田野中發(fā)生的，兩者之間的相關(guān)性尚不明確。因此，通過使用殺菌劑來控制麥瘟病穗部發(fā)生可能是困難的，因為農(nóng)民不能在抽穗期之前根據(jù)觀察葉片病斑來使用殺菌劑。此外，麥瘟病也是一種通過種子傳播的病害[9]。對種子進行篩選并對其進行MOT 鑒定將降低病害進一步傳播到其他國家的風(fēng)險。因此，開發(fā)一種快速、靈敏、低成本的方法檢測田間小麥幼苗、鄰近麥田的其他寄主、商業(yè)運輸中的小麥種子中的MoT，對控制南美洲和孟加拉國的小麥麥瘟病至關(guān)重要。

Pieck等[10]鑒定了MoT菌株獨有的DNA標(biāo)記。其中一個標(biāo)記MoT3對來自多個國家的11個寄主物種的284株稻瘟菌株的DNA進行檢測時顯示出特異性。其在MoT株系中擴增出一條360 個堿基對（bp）的MoT3標(biāo)記片段，而在MoO 株系中未擴增出。然而，該片段位于編碼視黃醇脫氫酶的單拷貝基因內(nèi)，該基因存在于MoT、MoO 和MoL（稻瘟菌黑麥草致病型）菌株中。最近的一項研究分析了81個先前組裝的Magnaporthe基因組的多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)MOT3序列并不存在于所有的MoT 菌株[11]中。另一種DNA 標(biāo)記C17，是新的具有高靈敏度的小麥系特異性的標(biāo)記[11]。在實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）中，該方法成功擴增了30 個小麥攜帶菌株100%的DNA。然而，目前還不清楚在受感染的小麥植株中，MOT3和C17是否都適用于快速檢測MoT。

近年來，已經(jīng)開發(fā)了幾種新技術(shù)以在實驗室和田間條件下快速檢測植物病害。例如，環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（LAMP）[12? 13]和重組酶聚合酶擴增（RPA）[14]正被廣泛用于植物病害檢測。值得一提的是，最近開發(fā)了一種革命性的人類疾病檢測方法，它將Cas蛋白（如Cas12a和Cas13a）可識別的編碼核苷酸靶標(biāo)與核酸快速側(cè)向流動免疫分析（NALFIA）方法相結(jié)合[15? 17]。這種方法是一種準(zhǔn)確、快速、特異和經(jīng)濟有效的替代方法，可以很簡易地用于植物病害檢測。

本研究旨在利用RPA、CAS12a 和NALFIA 建立一種新的田間快速準(zhǔn)確檢測MoT 的方法。首先，我們利用下一代測序（NGS）策略對巴西兩個小麥麥瘟菌株系的基因組進行了重測序；其次，我們使用BLAT軟件[18]對MoO和MoT 基因組進行了成對的基因序列比對分析，從而鑒定出兩個MoT 特異片段：MoT-6098和MoT-6099；然后，根據(jù)MoT-6098和MoT-6099序列設(shè)計了幾組引物，并通過PCR 和LAMP 驗證了引物的敏感性；最后，我們將基于Cas12a 的檢測方法與RPA 和NALFIA 技術(shù)相結(jié)合，開發(fā)了一種靈敏、低成本的田間受侵染小麥植株中MoT 的檢測方法。本研究為小麥毀滅性病害麥瘟病提供了一種新的檢測方法。

2.材料和方法

2.1.真菌材料

本研究所用的MoO 菌株（RB22、R01-1、P131、Guy11、N60、N63 和N71）在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所培養(yǎng)。所有MoT 菌株的DNA 樣本均由邦格班杜（Bangabandhu）·謝赫·穆吉布·拉赫曼農(nóng)業(yè)大學(xué)、位于美國德特里克堡（Ft.Detrick）的美國農(nóng)業(yè)部外來病害和雜草研究所、位于巴西圣卡洛斯的聯(lián)邦大學(xué)農(nóng)業(yè)研究中心準(zhǔn)備。

2.2.本研究使用的引物

表1列出了本研究中使用的所有引物。

表1 本研究中使用的引物和sgRNA序列列表

2.3.基因組測序與比較基因組分析

本研究利用Illumina 測序平臺（Hisep X_ten, Bio Marker Co., China）對MoT 菌株P(guān)R01-37.V.1 和PR01-37.V.3 的基因組DNA 進行了測序。簡言之，PR01-37.V.1 和PR01-37.V.3的DNA被隨機剪切成約500 bp的片段，并克隆到測序載體上構(gòu)建文庫，然后用Illumina系統(tǒng)對文庫進行測序。對序列質(zhì)量控制（QC）后獲取準(zhǔn)確無誤的序列讀取數(shù)據(jù)。使用SPADS-3.13.0 軟件（俄羅斯圣彼得堡州立大學(xué)）對兩個基因組進行從頭組裝。使用Augus‐tus.2.5.5 軟件（德國哥廷根大學(xué)）對MoO 和MoT 基因組進行基因預(yù)測。然后開發(fā)了一種以BLAT[18]為核心比對工具的成對基因比對通道。通過對兩株MoT菌株（PR01-37.V.1 和PR01-37.V.3）和三株MoO 菌株進行基因序列比對分析，確定了潛在的MoT 特異性基因。然后將潛在的特定基因與額外的MoO和MoT基因組進行比對[4,19]。具體地說，采用兩步法來鑒定MoT 特異性基因。首先，我們將378個候選基因與NCBI-nr數(shù)據(jù)庫進行比對，以移除MoO 基因。其次，我們將100 個候選MoT 基因與序列更高的MoT和MoO基因組進行比對，以測試它們是否存在于所有MoT 基因組中，而不存在于所有MoO 基因組中。最后，在分析中鑒定出兩個MoT 特異性基因。詳細(xì)的生物信息學(xué)分析過程如圖1所示。

2.4.環(huán)介導(dǎo)等溫擴增法

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增法（LAMP）反應(yīng)混合物的最終體積為20 μL，包含1 μL模板DNA（20 μmol?L?1）、2.0 μmol?L?1的正向和反向內(nèi)引物（FIP和BIP）、0.5 μmol?L?1的F3和B3 引物（表1）、1 mmol?L?1的dNTP、8 U 的Bst DNA 聚合酶（美國新英格蘭生物實驗室）和1×ThermoPol反應(yīng)緩沖液[20 mmol?L?1Tris-HCl、10 mmol?L?1KCl、2 mmol?L?1MgSO4、10 mmol?L?1(NH4)2SO4、0.1% Triton X-100, pH 8.8]。將混合物在65 ℃保持1 h，然后將混合物移至85 ℃下保持5 min后終止反應(yīng)。

2.5.LAMP反應(yīng)產(chǎn)物的檢測

在LAMP 擴增產(chǎn)物中加入2 μL 體積的1∶10 稀釋的SYBR Green I（10 000×，美國Invitrogen）。變成綠色的反應(yīng)被記錄為陽性，而那些保持棕色的反應(yīng)被記錄為陰性。擴增的LAMP反應(yīng)也在由溴化乙錠染色2%瓊脂糖凝膠上進行分析。該凝膠使用Gel Doc XR 成像儀系統(tǒng)（美國Bio-Rad）在紫外線下拍攝。

2.6.重組酶聚合酶擴增

按Piepenburg 等[14]先前所述，RPA 使用了中國安普未來生物科技有限公司（AMP-Future Biothech Co.Ltd.）的試劑盒（#WLN8203KIT）進行。對于第一個RPA，設(shè)計了MoT-6098/MoT-6099特異性引物對，并添加了四氫呋喃（THF）探針作為Nfo酶識別位點。擴增子應(yīng)至少包含一個用于識別Cas12a 保護間隔相鄰基序（PAM）位點（四個堿基“TTTA”）。對于第二個RPA，設(shè)計了ssDNA特異性引物對，并在5'端用FAM標(biāo)記，在3'端用生物素標(biāo)記。RPA 擴增按照RPA 試劑盒中的說明進行操作。簡而言之，將引物與含有重組酶、聚合酶和緩沖液的RPA 溶液混合，然后加入2 μL的樣品DNA（或Cas12a消化的溶液），然后將制劑（總體積為30 μL）在37~39 ℃保持8~12 min。

圖1.識別兩個MoT特定序列的途徑。圖左上角的省略號表示不同的麥瘟病菌基因組和基因1,2,3,4,…。N代表測序基因組中的所有預(yù)測基因。兩個基因組中兩個基因之間的箭頭表示雙向成對的基因序列比對，菌株之間的拱形箭頭表示兩個基因組中單個基因的序列比對。nr：非冗余蛋白序列。

2.7.ssDNA設(shè)計

ssDNA 設(shè)計有兩個要求：①ssDNA 應(yīng)較短（便于快速PCR檢測）；②ssDNA與目標(biāo)基因組序列之間不存在完全相同的序列。為了滿足這些要求，我們使用計算機程序隨機設(shè)計了10 000 個120 bp 的DNA 序列。然后使用BLAST軟件將這些120 bp的序列與小麥、MoT和MoO基因組進行比對[20]，并丟棄E值≤e?10或與靶序列相同≥10 bp的序列。以下是從與小麥、MoT和MoO序列無明顯相似性的序列中隨機選擇：“ACGTCGTCACATAGGGTATATCTTTTCACAACAGTAACCTACACTCGACTCACC GCAGTTCCCCAGACGCAGTATCGTAGCCGCGGATAGT TAGTGCTTCTAAGACCGCGAATGACAACA”。

2.8.基于CAS12a的檢測

對于帶有Cas12a 的RPA，該研究使用了之前描述的方法[16]。Cas12a 蛋白購自新英格蘭生物實驗室（NEB#M0653S，美國）。簡而言之，將Cas12a 和sgRNA（等摩爾體積）與反應(yīng)緩沖液混合，并在室溫下孵育約10 min。然后將RPA擴增的靶DNA溶液在37 ℃的Cas12a混合物中孵育約10 min，以激活Cas12a ssDNA 的酶切活性。最后，將設(shè)計的ssDNA 與活化的Cas12a 蛋白結(jié)合，進行ssDNA酶切。

2.9.用PCRD試紙進行NALFIA檢測

使用Abingdon Health PCRD 測試盒（#FD51673，美國）用于DNA檢測可視化。簡而言之，將5 μL的RPA反應(yīng)擴增產(chǎn)物與70 μL的PCRD提取緩沖液混合，并將總體積（75 μL）加入PCRD試紙條的樣品孔中。3~5 min后評定結(jié)果。

3.結(jié)論

3.1.用比較基因組學(xué)方法鑒定MoT特異性序列

為了研究MoT和MoO的基因組差異，我們從巴西小麥病株上提取了兩個MoT 菌株：PR01-37.V.1 和PR01-37.V.3 的DNA。然后，我們使用Illumina 測序平臺（美國）對這兩個菌株進行了重測序，基因組覆蓋率約為150。基因組拼接后，獲得了PR01-37.V.1 約38.5 Mb 的基因組序列和PR01-37.V.3 約40.0 Mb 的基因組序列。我們還從GenBank[21]下載了三株MoO菌株：Guy11、P131和Y34的基因組序列。通過成對的基因序列比對，我們鑒定了378個在三株MoO菌株中缺失的MoT基因。將這378個基因與GenBank 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（nr）進行比對，鑒定出289個基因與數(shù)據(jù)庫中的基因高度同源。其中189 個為含有MoO 基因，其余100 個為MoT 特異的候選基因（見附錄A 中的表S1）。除了少數(shù)與細(xì)菌基因高度同源的基因外，大多數(shù)基因都是真菌基因，其中一半以上（100個基因中的57個）屬于6個真菌物種（見附錄A中的表S2）。將這57個基因與其他20個測序的MoT和MoO基因組進行比對時[4,19]，我們發(fā)現(xiàn)了兩個MoT特異的基因：MoT-6098和MoT-6099。MOT-6098編碼一個假定的酸性海藻糖酶蛋白，而MoT-6099編碼一個DUF341 家族蛋白。因為MoT-6098和MoT-6099存在于所有測序的MoT基因組中，而不存在于任何測序的MoO 基因組中，所以我們選擇這兩個MoT特異性基因來開發(fā)MoT特異性標(biāo)記。

3.2.區(qū)分MoT 和MoO 的MoT-6098 和MoT-6099 引物對的靈敏度

為了確定MoT 和MoO 菌株中MoT-6098和MoT-6099序列的特異性，我們設(shè)計了一組引物（MoT-6098F 和MoT-6098R，MoT-6099F和MoT-6099R，見表1），并用它們對53個不同的稻瘟菌菌株的DNA進行了PCR反應(yīng)。這53 個菌株來自9 個國家的14 種禾本科植物（表2、表3），包括15個來自水稻的菌株，19個來自小麥的菌株，19個來自可能的其他寄主菌株，如大麥、燕麥、狗尾草、臂尾草、黑麥草、雀麥、穇、畫眉草、羊茅、狗尾草和狹葉狗尾草（表2、表3）。我們在Urashima 教授和Islam 教授實驗室分別對從巴西和孟加拉國收集的25 個菌株進行了PCR 檢測（表2）。其中包含兩個在Urashima 教授實驗室分離出的引起小麥赤霉病的禾谷鐮刀菌的DNA，以檢測真菌種間的引物特異性。此外，我們還收集了Wang實驗室提供的4 個侵染水稻病原菌和侵染黑麥草的病原菌的DNA 樣本作為對照。PCR 分析表明，這兩個基因存在于所有8 個MoT 菌株、1 個大麥菌株和1 個美國黑麥草菌株中，但不存在于水稻、狗尾草、臂形草、燕麥和兩個禾谷鐮刀菌中（圖2和表2）。隨后，我們測試了美國農(nóng)業(yè)部外來病害和雜草研究所保存的24 株稻瘟菌菌株（表3）。除兩株來自臂形草的菌株外，其余菌株均含有這兩個基因。在22株MoT陽性菌株中，11株從小麥中分離而得，其余的分離于從巴西、玻利維亞、巴拉圭、日本和美國等地采集的MoT 其他宿主，包括黑麥草、穇、雀麥、畫眉草、偏序鈍葉草和羊茅（見附錄A中的S1和表3）。

表2 用于PCR檢測MoT-6098和MoT-6099片段的孟加拉國和巴西稻瘟菌分離菌株

表3 用于PCR檢測MoT-6098和MoT-6099片段的來自USDA-ARS的稻瘟菌分離菌株

然后我們進行了靈敏度試驗來檢測這兩對引物的敏感性。將MoT菌株BO12TA301培養(yǎng)物中5個濃度（0.01 ng·μL?1、0.1 ng·μL?1、1 ng·μL?1、10 ng·μL?1和50 ng·μL?1）的DNA 與MoT-6098F/R 和MoT-6099F/R 引物對進行PCR 反應(yīng)。以Pot2R/F引物對為對照。PCR結(jié)果顯示，0.1 ng·μL?1的DNA 能用MoT-6099F/R 擴增出條帶，10 ng·μL?1的DNA能用MoT-6098f/R擴增出條帶[圖3（a）]。我們還用與上述常規(guī)PCR相同的DNA稀釋度，使用實時熒光定量PCR檢測引物的敏感性。兩對引物在僅含0.01 ng·μL?1模板DNA的反應(yīng)中產(chǎn)生了正常的循環(huán)閾值（Ct），表明這些引物對目標(biāo)序列的擴增非常敏感[圖3（b）~（d）]。

3.3.感染植物中MoT的檢測

為了確定MoT-6098F/R和MoT-6099F/R引物對是否可以用于檢測感染小麥中的MoT，我們在邦格班杜·謝赫·穆吉布爾·拉赫曼農(nóng)業(yè)大學(xué)的生長室中，從感染MoT菌株BTJP4-5的小麥植株葉片和穗中提取了DNA。為了控制變量，我們還從自然侵染的水稻穗、MoT分離物BTJP4-5和MoO 分離物RB-13b 的菌絲中提取了DNA。PCR 結(jié)果表明，MoT-6098 和MoT-6099 擴增帶在被MoT 感染的小麥葉片、穗部和MoT菌絲的DNA中均有擴增，而被MoO侵染的水稻葉片或MoO 菌絲中分離的DNA 沒有擴增（圖4）。這些結(jié)果表明，MoT-6098和MoT-6099引物能有效檢測受感染小麥植株中的MoT。

3.4.使用LAMP檢測MoT

由于LAMP是一種在等溫條件下特異、快速、高效的DNA 檢測方法，我們利用LAMP 對MoT 中的MoT-6098和MoT-6099片段進行了檢測。擴增后的DNA在瓊脂糖凝膠和1000×SYBR Green 染料中均能顯示。在瓊脂糖凝膠電泳實驗中，從3 株MoT 菌株提取的DNA 均出現(xiàn)擴增條帶，而5 株從MoO 菌株中提取的未出現(xiàn)擴增條帶[圖5（a）]。與凝膠法結(jié)果一致，含3 個MoT 菌株DNA 的SYBR Green 染料溶液中顯示出綠色而含5 個MoO 菌株DNA 的溶液均未變色[圖5（b）]。結(jié)果表明，在等溫條件下，LAMP可以快速、高效地檢測MoT。

3.5.將Cas12a 蛋白與RPA 和NALFIA 技術(shù)相結(jié)合，用于田間MoT的快速檢測

LAMP 技術(shù)由于需要高溫條件（60~65 ℃），限制了其在田間的應(yīng)用。Cas12a 是最新發(fā)現(xiàn)的一種核酸酶，能在sgRNA介導(dǎo)的DNA結(jié)合靶向序列后非特異性地消化單鏈DNA 或單鏈RNA（ssRNA）[12]?；贑as12a 的序列識別特異性和ssDNA 核酸酶活性，我們將該蛋白質(zhì)與RPA 和NALFIA 技術(shù)相結(jié)合用于MoT 的快速檢測[圖6（a）、（b）]。該過程首先利用RPA 技術(shù)擴增MoT 的特異性序列，然后將擴增產(chǎn)物與靶向MoT-6098和MoT-6099序列的sgRNA以及Cas12a蛋白共同孵育。如果MoT的DNA樣品包含靶序列，Cas12a的核酸酶活性將被激活，Cas12a蛋白將非特異性地消化反應(yīng)中隨機生成的ssDNA 探針。第二個RPA 將生物素標(biāo)記的引物（左引物）和FAM 標(biāo)記的引物（右引物）用于ssDNA 片段的檢測，擴增產(chǎn)物裝在試紙條（測流免疫分析；英國Abingdon Health 公司）上用于ssDNA 片段的檢測。如果MoT 樣品中含有sgRNA靶序列，激活的Cas12a 將消化ssDNA，因此，生物素和FAM 標(biāo)記的ssDNA 片段不會出現(xiàn)在PCRD 側(cè)流條上[圖6（a）]。反之，ssDNA 將在第二個RPA 中擴增，PCRD 條上將出現(xiàn)生物素和FAM標(biāo)記的ssDNA的擴增[圖6（b）]。我們選取4 株MoT 和4 株MoO 菌株進行RPA 和NALFIA檢測，其中還包含一個隨機生成120 個堿基對的DNA 片段（見附錄A 中的實驗步驟）用于Cas12a 的消化。瓊脂糖凝膠分析證實MoT-6098和MoT-6099片段在4個MoT樣品的第一次RPA 反應(yīng)中擴增，而在4 個MoO 樣品中未擴增[圖6（c）]。第二次RPA后，將反應(yīng)液放入到PCRD條上進行NALFIA檢測。結(jié)果顯示，ssDNA條帶（自上而下的第二個條帶）在4個MoO樣品和陽性對照中有明顯帶，而在4個MoT樣品或陰性對照中則沒有[圖6（d）]。

此外，當(dāng)對MoT感染的麥葉中分離的DNA進行檢測時，NALFIA測定在人工接種的葉子和自然感染的麥穗中都檢測到了MoT [圖6（e）]。為了進一步檢驗基于Cas12a的NALFIA方法的靈敏度，我們將其與使用不同濃度真菌菌絲DNA的常規(guī)PCR方法進行比較（圖7）。如圖7（a）和（c）所示。當(dāng)真菌DNA 濃度為0.01 μg?μL?1時出現(xiàn)了一條弱帶。相比之下，基于Cas12a 的NALFIA 方法能在真菌DNA濃度僅0.001 μg?μL?1內(nèi)清晰檢測到靶序列。葉片接種后4 天，PCR 就能從其分離的DNA 中檢測到靶序列[圖7（b）]。然而，基于Cas12a的NALFIA方法早在接種后兩天就檢測到了靶序列[圖7（d）]。這些結(jié)果表明，新的檢測方法能夠快速、準(zhǔn)確、高效地識別麥田中的MoT，從而為南美洲和南亞國家的破壞性小麥瘟病檢測提供了一個簡單、經(jīng)濟的平臺。

4.討論

隨著NGS 技術(shù)的發(fā)展，研究人員現(xiàn)在可以快速、經(jīng)濟地對單個基因組進行測序。盡管NGS 技術(shù)使研究人員能夠識別緊密相關(guān)生物之間的基因組差異，但識別特定物種或致病類型特有的序列仍是個挑戰(zhàn)。為了鑒定MoT 中存在而MoO 中不存在的序列，我們對來自巴西的兩個MoT 菌株進行了重測序。采用雙序列、兩步全局比對的方法，將兩個MoT 菌株中潛在差異的基因與測序的MoO和MoT菌株進行比對，以鑒定MoT的特異性基因。在57個MoT 特異候選基因中，我們發(fā)現(xiàn)了兩個序列，它們存在于MoT 和從其他寄主中采集的稻瘟菌菌株中，但不存在于任何MoO菌株中。我們對53株稻瘟病菌的PCR分析證實了這一結(jié)果，表明在比較兩個高度相似的基因組時，將NGS 測序與兩步全局比對法相結(jié)合，能夠快速準(zhǔn)確地鑒定出唯一序列。

為了控制農(nóng)作物的病害，人們需要快速、準(zhǔn)確地診斷出突發(fā)和再發(fā)病害。在某些情況下，能否控制病害取決于能否立即查明田間的致病病原體。20 世紀(jì)70 年代以來，以免疫學(xué)為基礎(chǔ)的檢測技術(shù)，如酶聯(lián)免疫吸附試驗（en‐zyme-linked immunosorbent assay, ELISA）被用于田間病原檢測。由于傳統(tǒng)IBD方法中使用的抗體不穩(wěn)定，該方法現(xiàn)在使用的是經(jīng)過活化的修飾膠體金或其他替代顆粒，這些粒子被激活并因此可以通過特異性抗體達到可視化。IBD方法的局限性在于無法獲得大多數(shù)植物病原物的特異性抗體。在過去的40年里，PCR和RT-PCR被廣泛用于檢測感染植物的病原DNA 或RNA 序列[22]。PCR 方法的缺點在于其需要在實驗室的儀器中進行而且獲得診斷結(jié)果所需的時間相對較長（4~8 h）。相比之下，NALFIA是一個基于試紙條的方法，可以檢測和定量復(fù)合物中的待分析物并在5~30 min內(nèi)提供結(jié)果[23]。該方法的成本低而且更易操作，所以使得NALFIA的應(yīng)用范圍在不斷擴大，包括植物病原檢測在內(nèi)的其他多個領(lǐng)域。近年來，將NALFIA與LAMP、RPA等核酸檢測方法相結(jié)合，已成為檢測植物病原菌的一種流行方法[24]。另一種診斷方法是利用Cas12a蛋白，該蛋白可以不加選擇地切割ssDNA，并在sgRNA與靶序列結(jié)合后完全降解ssDNA分子[16]。通過將Cas12a單鏈脫氧核糖核酸酶激活與等溫擴增相結(jié)合，發(fā)展了一種新的方法——DNA內(nèi)切酶靶向CRISPR反式報告基因的方法，能夠快速、特異地檢測人體樣本中的病毒[16]。

圖2.MoT-6098和MoT-6099在所有被檢測的MoT菌株中均存在，而在所有MoO株中均不存在。MoT-6098F/R引物對（a）、MoT-6099F/R引物對（b）、對照Pot2F/2R引物對（c）擴增得到的MoT和MoO樣品凝膠照片（1%）。DNA樣本信息（凝膠中的1~25泳道和a~f泳道）列于表2。

圖3.用MoT菌株BO12TA301的DNA進行常規(guī)和實時熒光定量PCR，對6098和6099引物對進行敏感性分析。（a）采用常規(guī)PCR進行敏感性分析。用引物組合MoT-6098F/R、MoT-6099F/R和Pot2F/2R對1%瓊脂糖凝膠進行成像，并對每個DNA樣品的特定稀釋物和擴增產(chǎn)物的大小進行了說明。（b）~（d）采用實時熒光定量PCR進行敏感性分析。分別采用MoT-6098F/R（b）、MoT-6099F/R（c）、Pot2F/2R（d）引物組合，通過實時熒光定量PCR技術(shù)，描繪出Ct值（樣品的熒光超過背景熒光）與DNA模板濃度對數(shù)的關(guān)系。引物列于表1。R2：決定系數(shù)；y：PCR數(shù)據(jù)的線性模型。

在本研究中，我們首先用PCR 和LAMP 方法在等溫條件下測定了引物的靈敏度。隨后，我們在第一次RPA反應(yīng)中加入Cas12a 蛋白和一個隨機DNA 片段，用MoT-6098 或MoT-6099 引物對MoT 中的靶序列在37 ℃下進行擴增，在第二次RPA 反應(yīng)中，使用生物素和FAM 標(biāo)記引物擴增了隨機DNA 片段并進行了PCRD 檢測。用從MoT菌絲組織和感染MoT小麥葉片中分離的DNA為模板，我們獲得了陽性結(jié)果。整個過程在25~40 ℃下進行，只需約半個小時，無需任何實驗室設(shè)備。使用商品化PCRD條帶時，每份樣品的檢測總費用約為6美元。如果采用非專利的方法進行大規(guī)模生產(chǎn)，每份樣品的成本可以降低到4美元以下。植物病理學(xué)家、檢疫專家和農(nóng)業(yè)推廣工作者很容易采用本研究開發(fā)的簡單方法，在受感染的植物、種子批和其他寄主中快速檢測MoT。

圖4.檢測受感染小麥植株中的MoT。（a）葉片感染的早期階段（圓圈中表示播種后14天后葉片出現(xiàn)滲水病斑）；（b）穗部感染（圓圈中表示在播種105天后穗頸上出現(xiàn)灰斑）；（c）利用瓊脂糖凝膠電泳對侵染后的幼株和成株的MoT序列進行PCR檢測。第1泳道是DNA標(biāo)記道。泳道2~6代表分離自下列樣本的DNA：MoT菌株BTJP4-5的菌絲體（泳道2）、人工接種MoT菌株BTJP4-5的小麥葉片（泳道3）、MoT侵染麥田而自然感染的小麥植株的穗頸（泳道4）、MoO菌株RB-13b的菌絲體（泳道5）和MoO侵染稻田而自然感染的水稻植株的穗頸（泳道6）。

圖5.用LAMP 檢測MoT 序列。對8 份樣本（標(biāo)記為1~8）樣品進行LAMP 檢測，其中3 份含有MoT 基因組DNA（樣本1~3），5 份含有MoO 基因組DNA（樣品4~8）。（a）LAMP擴增的基因組DNA顯示在2%的瓊脂糖凝膠上；凝膠的左側(cè)和右側(cè)分別顯示了針對MoT-6098和MoT-6099的LAMP引物的結(jié)果。（b）用SYBR Green染料直觀展示了LAMP擴增的基因組DNA。左側(cè)和右側(cè)分別表示用針對MoT-6098和MoT-6099的LAMP引物得到的結(jié)果。

Acknowledgements

This research was supported by grants from the SEEDS program of the Ohio Agricultural Research and Development Center (OARDC) and the Coordinated Research Program of the International Atomic Energy Agency (IAEA) to GLW.The financial support from the Krishi Gobeshona Foundation(KGF) of Bangladesh under project KGF TF 50-C/17 to To‐fazzal Islam of the Institute of Biotechnology and Genetic En‐gineering of BSMRAU,Bangladesh,is highly acknowledged.Assistance from Dr.Francesca Hand for the LAMP assay is appreciated.Mention of trade names or commercial productsin this publication is solely for the purpose of providing spe‐cific information and does not imply recommendation or en‐dorsement by the U.S.Department of Agriculture.USDA is an equal opportunity provider and employer.

圖6.通過將Cas12a蛋白與RPA和NALFIA技術(shù)相結(jié)合快速檢測MoT。（a）當(dāng)DNA樣品中含有MoT-6098或MoT-6099序列時的Cas12a介導(dǎo)的檢測方法；（b）DNA樣品不含有MoT-6098或MoT-6099序列時的Cas12a介導(dǎo)的檢測方法；（c）用MoT-6098引物對瓊脂糖凝膠上第一個RPA擴增的DNA進行檢測；（d）第二次RPA擴增MoO和MoT菌株條上用NALFIA技術(shù)檢測MoT-6098的序列；（e）利用從MoT菌株BTJP4-5（泳道1）菌絲體、人工接種MoT菌株BTJP4-5（泳道2）的小麥葉片和田間自然感染MoT的小麥植株穗頸分離的DNA進行MoT-6098序列的NALFIA檢測（泳道3）。

圖7.Cas12a-RPA-NALFIA介導(dǎo)法的靈敏度測試及其與常規(guī)PCR的比較。（a）利用不同濃度的模板DNA在瓊脂糖凝膠上顯示PCR擴增MoT-6098序列的靈敏度；（b）在瓊脂糖凝膠上顯示接種后葉片模板PCR 擴增Mo-6098 序列的靈敏度；（c）PCRD 條帶顯示Cas12a-RPA-NALFIA 介導(dǎo)法檢測菌絲MoT-6098序列的靈敏度；（d）PCRD條帶顯示Cas12a-RPA-NALFIA介導(dǎo)法檢測接種葉片模板擴增MoT-6098序列的靈敏度。

Compliance with ethics guidelines

Houxiang Kang, Peng Ye, Kangyu Hua, Yufei Deng,Maria Bellizzi, Dipali Rani Gupta, Nur Uddin Mahmud,Alfredo S.Urashima, Sanjoy Kumar Paul, Gary Peterson,Yilin Zhou, Md Tofazzal Islam, Xueping Zhou and Guo-Liang Wang declare that they have no conflict of interest or financial conflicts to disclose

Appendix A.Supplementary data

Supplementary data to this article can be found on‐line at https://doi.org/10.1016/j.eng.2020.07.016.