(1 青島大學附屬醫(yī)院麻醉科，山東 青島 266003; 2 青島大學附屬青島婦女兒童醫(yī)院麻醉科)

嗎啡在緩解中重度疼痛中占有重要地位，但長期應用可導致患者嗎啡耐受和(或)痛覺過敏，影響了其在臨床上的應用[1-2]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，小膠質(zhì)細胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的巨噬細胞，其不同的活化狀態(tài)(M1/M2型)在嗎啡耐受和痛覺過敏中發(fā)揮著重要作用[3-6]。嗎啡能夠?qū)е滦∧z質(zhì)細胞激活，使白細胞介素1(IL-1)等炎癥因子產(chǎn)生增多，進而產(chǎn)生嗎啡耐受，小膠質(zhì)細胞活化為M1型時可使IL-1β等促炎因子表達明顯增多[7]。當小膠質(zhì)細胞活化為M2型時，細胞中的抗炎細胞因子腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)等表達增多[6]，BDNF能與酪氨酸激酶B(TrkB)受體結(jié)合使增強神經(jīng)元興奮性增高進而導致患者痛覺過敏[8]。但關(guān)于小膠質(zhì)細胞極化狀態(tài)在嗎啡耐受和痛覺過敏中的具體作用機制尚不清楚。本研究擬通過不同濃度嗎啡對小膠質(zhì)細胞極化狀態(tài)影響的研究，探討嗎啡耐受和痛覺過敏的產(chǎn)生及調(diào)節(jié)機制,以便指導臨床實踐。

1 材料與方法

1.1 材料來源

大鼠小膠質(zhì)細胞HAPI株購自賽齊(上海)生物工程有限公司。

1.2 藥品與試劑

Arg-1、iNOS、CD86、CD206和β-actin兔抗大鼠一抗購自美國Abcam公司；羊抗兔二抗購自中國Elabscience公司；胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司；DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；L-多聚賴氨酸、青霉素與鏈霉素混合液、2.5 g/L胰蛋白酶液以及PBS磷酸鹽緩沖液均購自北京索萊寶公司。

1.3 小膠質(zhì)細胞的培養(yǎng)

大鼠小膠質(zhì)細胞HAPI株復蘇后，置于含10×104U/L青霉素與0.1 g/L 鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，于37 ℃、含體積分數(shù)0.05 CO2的恒溫箱中進行培養(yǎng)，待細胞融合度約達70%時，胰蛋白酶消化并吹打成單細胞懸液，按照1∶3傳代。

1.4 分組及處理

取對數(shù)生長期的小膠質(zhì)細胞，以5×105/孔接種于6孔板之中，37 ℃下置于含體積分數(shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞融合度約達70%時，采用隨機數(shù)字表法將細胞分為空白對照組(C組)、10-7mol/L嗎啡組(L組)和10-4mol/L嗎啡組(H組)3組。C組不作任何處理，L組和H組分別加入終濃度為10-7mol/L和10-4mol/L的嗎啡培養(yǎng)液孵育24 h。

1.5 Western Blotting方法檢測各組小膠質(zhì)細胞中CD11b、iNOS和Arg-1蛋白表達

將6孔板中孵育后的各組小膠質(zhì)細胞以PBS清洗后，按照1 mL RIPA裂解液加入10 μL PMSF(100 mmol/L)加10 μL磷酸酶抑制劑的比例每孔加入120 μL裂解液，搖勻置于冰上離心后收集上清液，以BCA法進行蛋白定量，以30 μg蛋白量計算每組的上樣體積，加入上樣緩沖液，煮沸變性。用微量注射器上樣，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)移至轉(zhuǎn)膜液中進行恒流濕轉(zhuǎn)。轉(zhuǎn)膜成功后，用50 g/L的脫脂奶封閉PVDF膜2 h,隨后分別加入CD11b(1∶1 000)、Arg-1(1∶1 000)、CD206(1∶1 200)、CD86(1∶1 500)、iNOS(1∶1 000)以及β-actin(1∶2 000)一抗，4 ℃搖床過夜。以TBST液洗膜3次，每次10 min，完成后加入二抗(1∶5 000)孵育1.5 h。以TBST液洗膜3次后，用鑷子夾出膜帶，加入顯色劑，以BIORAD系統(tǒng)測定各組條帶灰度值，計算目的蛋白的表達水平，每組實驗重復3次，實驗結(jié)果取均值。

1.6 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)方法檢測各組小膠質(zhì)細胞中BDNF、IL-1β mRNA的表達

將6孔板中孵育后的各組小膠質(zhì)細胞用PBS清洗后，以Trizol法提取細胞總RNA，檢測RNA的濃度和純度，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板進行PCR反應。按照試劑盒說明書的要求配制成20 μL PCR反應體系,并應用Prism?7300型熒光定量PCR儀進行擴增，擴增條件設置為:94 ℃預變性30 s;94 ℃變性20 s，60 ℃退火延伸30 s，循環(huán)45次。每個樣品設置3個復孔，得到各組樣品CT值后，以2-ΔΔCT方法計算各組mRNA的相對表達量，實驗重復3次，取均值。β-actin引物序列：正義鏈5′-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3′，反義鏈5′-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3′；BDNF引物序列：正義鏈5′-AGCCTCCTCTGCTC-TTTCTGCT-3′，反義鏈5′-TGCCTTTTGTCTAT-GCCCCTG-3′；IL-1β引物序列：正義鏈5′-GGTT-TCCCTTTCTGGCGTCCTG-3′，反義鏈5′-TCCC-TCCCTCCCTCCCTTTCC-3′。

1.7 免疫熒光法檢測各組小膠質(zhì)細胞中CD86和CD206蛋白表達

將處于對數(shù)生長期的小膠質(zhì)細胞接種到各組預先放置有處理過的蓋玻片的培養(yǎng)皿中，待細胞接近長成單層后取出蓋玻片，以PBS浸洗后,以40 g/L的多聚甲醛固定爬片15 min,以體積分數(shù)為0.005的Triton X-100(PBS配制)室溫通透20 min。在玻片上滴加正常山羊血清，室溫封閉30 min。吸水紙吸掉封閉液，不清洗，每張玻片分別滴加足夠量的稀釋好的一抗(CD11b抗體、CD86抗體、CD206抗體)并放入濕盒，4 ℃孵育過夜。加熒光二抗,用吸水紙吸干爬片上的液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察同時采集圖像，采用Image-J軟件測定各組熒光圖片的熒光強度，以此表示CD86和CD206蛋白的表達量。每組實驗重復3次，取均值。

1.8 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 各組小膠質(zhì)細胞中CD11b的表達

C、L、H組小膠質(zhì)細胞中CD11b蛋白表達量比較差異有顯著性(F=85.634，P<0.05)；L、H組與C組比較，差異均有顯著性(t=12.639、13.220，P<0.05)。見圖1、表1。

2.2 不同濃度嗎啡對小膠質(zhì)細胞M1/M2型極化狀態(tài)的影響

C、L、H組小膠質(zhì)細胞中CD86、CD206、iNOS及Arg-1蛋白的表達量比較，差異具有顯著統(tǒng)計意義(F=30.660～85.968，P<0.05)；L組小膠質(zhì)細胞中CD206、Arg-1蛋白的表達量與C組比較，差異有顯著性(t=9.740、10.574，P<0.05)；H組小膠質(zhì)細胞中CD86、iNOS蛋白的表達量與C組比較，差異均有顯著性(t=6.043、11.582，P<0.05)；L組小膠質(zhì)細胞中CD86、CD206、iNOS、Arg-1蛋白的表達量與H組比較，差異均具有顯著意義(t=3.992～8.278，P<0.05)。見圖1、2及表1。

圖1 不同濃度嗎啡對小膠質(zhì)細胞各標記物表達的影響

圖2 不同濃度嗎啡對小膠質(zhì)細胞M1、M2標記物表達的影響

表1 不同濃度嗎啡對小膠質(zhì)細胞各標記物表達的影響

2.3 嗎啡對小膠質(zhì)細胞IL-1β以及BDNF mRNA表達的影響

C、L、H組小膠質(zhì)細胞中BDNFmRNA的表達水平分別為1.000±0.001、3.327±0.210、1.656±0.104，IL-1β mRNA的表達水平分別為1.000±0.001、1.381±0.177、1.838±0.099，三組比較差異有顯著性(F=236.808、13.986，P<0.05)；L、H組與C組比較，差異有顯著性(t=3.732～19.223，P<0.05)；L組與H組相比較，差異具有顯著意義(t=11.843、3.901，P<0.05)。

3 討 論

嗎啡是治療中重度疼痛阿片類藥物的代表，但長期使用會導致患者耐受和(或)痛覺過敏，影響其在臨床上的應用。近年來，針對嗎啡耐受和痛覺過敏產(chǎn)生及調(diào)節(jié)機制進行了多方面的研究并取得了一些進展，但由于嗎啡耐受和痛覺過敏的機制極其復雜，很多研究尚未得到確切結(jié)論。本研究結(jié)果表明，L組小膠質(zhì)細胞中CD206、Arg-1蛋白以及BDNFmRNA表達上調(diào)，H組小膠質(zhì)細胞中CD86、iNOS蛋白和IL-1β mRNA表達上調(diào)，提示低濃度嗎啡誘導小膠質(zhì)細胞向M2型極化狀態(tài)分化，而高濃度嗎啡誘導小膠質(zhì)細胞向M1型極化狀態(tài)分化。

小膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的巨噬細胞，在健康機體中，其處于靜止狀態(tài),能夠通過調(diào)控自身的結(jié)構(gòu)功能，從而調(diào)控突觸之間的信號傳遞。當機體受到諸如神經(jīng)損傷等外界刺激時，小膠質(zhì)細胞會進一步活化，呈現(xiàn)出形態(tài)學的改變，從分支狀變成變形蟲樣，其間伴隨著小膠質(zhì)細胞標記蛋白CD11b的表達增加[9]。當存在嗎啡慢性刺激時，脊髓膠質(zhì)細胞激活，小膠質(zhì)細胞活化標記物CD11b的表達增多[10]，促炎細胞因子釋放增加，這是嗎啡耐受和痛覺過敏的主要機制[11-12]。抑制脊髓小膠質(zhì)細胞活化和(或)促炎性細胞因子釋放，均能降低嗎啡耐受和痛覺過敏的產(chǎn)生[13]。本研究顯示，L組和H組小膠質(zhì)細胞中CD11b的表達均上調(diào)，提示不論是低濃度還是高濃度嗎啡均能活化小膠質(zhì)細胞。

與外周的巨噬細胞相似，小膠質(zhì)細胞的極化狀態(tài)有M1型和M2型兩種[14]。M1型小膠質(zhì)細胞主要分泌IL-1β等促炎細胞因子[15]，其中，IL-1β通路的激活對嗎啡耐受的形成起到了重要作用[16]，其能夠增加IFN-γ、IL-6以及TNF-α等促炎因子的釋放，從而增強中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥反應[17]，這些炎癥反應最終導致了嗎啡耐受的形成[18]。另外有報道稱，一些藥物能夠通過抑制小膠質(zhì)細胞內(nèi)IL-1β通路的激活，來達到減緩嗎啡耐受的目的[19]。本研究結(jié)果顯示，H組M1型小膠質(zhì)細胞極化標記物蛋白和IL-1β mRNA表達顯著上調(diào)，提示高濃度嗎啡(10-4mol/L)刺激小膠質(zhì)細胞向M1型轉(zhuǎn)化，并增加IL-1β的合成釋放，這可能是導致嗎啡耐受的可能機制。M2型小膠質(zhì)細胞可分泌BDNF等大量生長因子[20]。BDNF可激活脊髓背角次級感覺神經(jīng)元上的TrkB受體，增加K+-Cl-共轉(zhuǎn)運體KCC2的表達，造成胞內(nèi)Cl-濃度升高和神經(jīng)元超極化，從而引起痛覺過敏[21]。反之，通過抑制BDNF的表達也能夠有效減緩痛覺過敏[22-23]。本研究結(jié)果顯示，H組M2型小膠質(zhì)細胞極化標記物蛋白和BDNFmRNA表達上調(diào)，提示低濃度嗎啡(10-7mol/L)刺激小膠質(zhì)細胞向M2型轉(zhuǎn)化，并增加了BDNF的合成與釋放，這可能是嗎啡導致的痛覺過敏產(chǎn)生的可能機制。

綜上所述，不同濃度嗎啡誘導小膠質(zhì)細胞不同極化狀態(tài)，高濃度嗎啡誘導小膠質(zhì)細胞活化為M1型，低濃度嗎啡誘導小膠質(zhì)細胞活化為M2型，這可能分別是產(chǎn)生嗎啡耐受和痛覺過敏的機制。