馬瑞 馬瑜徽 張新月 耿印 陳嵐芬 張學(xué)寧 王曉莉

（濰坊醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)影像學(xué)院，山東濰坊 261053）

缺氧缺血性腦?。╤ypoxic-ischemic encephalopathy, HIE）是新生兒圍生期窒息引起的缺氧缺血性腦損傷（hypoxic-ischemic brain damage,HIBD），?？蓪?dǎo)致腦白質(zhì)損傷（white matter damage,WMD）[1]。由于腦完整性破壞，腦信息處理速度減慢[2]，往往出現(xiàn)學(xué)習(xí)能力差、記憶力減退等認(rèn)知障礙的臨床癥狀，是HIBD的重要臨床表現(xiàn)。因此，WMD修復(fù)程度是評(píng)價(jià)HIBD療效的重要指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)褪黑素（melatonin, Mel）具有抗炎、抗氧化的作用[3]，且可促進(jìn)未成熟腦白質(zhì)的修復(fù)[4]，從而減輕WMD，但不同Mel治療方案對(duì)受損腦白質(zhì)保護(hù)作用的差別尚有待于進(jìn)一步研究[5]。本項(xiàng)目組前期研究發(fā)現(xiàn)Mel可促進(jìn)HIBD新生大鼠腦內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖[6]，7日連續(xù)治療（7-day continuous treatment, 7DCT）方案優(yōu)于單次即刻治療（singledose immediate treatment, SDIT），但增殖的神經(jīng)干細(xì)胞能否修復(fù)WMD，以及不同Mel治療方案對(duì)WMD的作用差別均尚不清楚。因此，本研究采用免疫熒光染色結(jié)合行為學(xué)實(shí)驗(yàn)法檢測(cè)SDIT與7DCT兩種不同Mel治療方案對(duì)HIBD大鼠WMD的影響，以期為Mel治療方案的選擇提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

SPF級(jí)7日齡Sprague-Dawley新生大鼠32只[SCXK（魯）20190003，山東省濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司]，雌雄不限，平均體重（11.8±1.5）g，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、HIBD組、SDIT組及7DCT組（n=8）。HIBD后21 d，各組大鼠行Morris水迷宮測(cè)試，HIBD后70 d，分別采用神經(jīng)元核抗原（NeuN）免疫熒光染色法鑒定HIBD模型，并觀察Mel治療對(duì)新生大鼠遠(yuǎn)期腦損傷的影響，堿性髓鞘蛋白（MBP）/神經(jīng)絲蛋白重鏈（NF200）免疫熒光雙標(biāo)法觀察Mel治療對(duì)大鼠遠(yuǎn)期WMD的影響。

1.2 HIBD模型的建立及各組處理

HIBD組、SDIT組及7DCT組大鼠據(jù)經(jīng)典的Rice-Vannucci法制作HIBD模型[7]。吸入乙醚麻醉，剪開(kāi)頸部正中皮膚，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈，電凝筆（RS-300，Roboz公司，美國(guó)）電凝，消毒并縫合皮膚，置于低氧艙（DYC-Ⅰ，武漢七0一研究所）內(nèi)連續(xù)缺氧（氧艙濃度8%±0.01%）2 h后，放回母鼠籠中喂養(yǎng)。假手術(shù)組大鼠僅分離右側(cè)頸總動(dòng)脈，不予電凝及缺氧處理。SDIT組于造模后30 min內(nèi)腹腔注射1次Mel，5 mg/kg（美國(guó)Sigma公司）；7DCT組于造模后30 min內(nèi)腹腔注射Mel，注射7 d，每次5 mg/kg，每天1次。HIBD組與假手術(shù)組于造模后30 min內(nèi)，腹腔注射等量生理鹽水。

1.3 Morris水迷宮測(cè)試

HIBD后21 d，選用水迷宮大鼠通用型圓桶（深圳市瑞沃德生命科技有限公司），水池直徑100 cm，高40 cm。適應(yīng)階段，將大鼠置于無(wú)平臺(tái)的裝置中，使其自由運(yùn)動(dòng)1 min。測(cè)試階段于第三象限正中放置直徑8 cm，高23 cm的平臺(tái)，沒(méi)入水下2 cm。將大鼠面朝固定位置的桶壁放入平臺(tái)對(duì)側(cè)的象限中，大鼠找到并爬上平臺(tái)后實(shí)驗(yàn)結(jié)束，檢測(cè)時(shí)間為60 s。若在規(guī)定60 s內(nèi)大鼠未找到平臺(tái)，則將大鼠引導(dǎo)到平臺(tái)上并停留15 s，同時(shí)記錄該大鼠的逃避潛伏期為60 s。每天每只大鼠測(cè)試4次，每次間隔時(shí)間1 min，記錄大鼠逃避潛伏期時(shí)間，連續(xù)測(cè)試5 d。

1.4 標(biāo)本的收集

HIBD后70 d，10%水合氯醛麻醉，常規(guī)心臟灌注后取腦組織，4%多聚甲醛固定24 h，梯度乙醇脫水、二甲苯透明，浸蠟、石蠟包埋，分別取側(cè)腦室至海馬層面腦組織行冠狀位連續(xù)切片，厚度為4 μm，每4～5張腦片取1張，分別行NeuN免疫熒光及MBP/NF200免疫熒光雙標(biāo)染色。

1.5 NeuN免疫熒光染色

各組每只大鼠分別取腦組織石蠟切片5～6張，梯度乙醇進(jìn)行脫蠟至水，采用水浴熱修復(fù)法進(jìn)行抗原修復(fù)，血清封閉后，棄掉封閉液，加入小鼠抗大鼠NeuN一抗（1 : 100，Chemicon，美國(guó)）混合液，4℃冰箱孵育過(guò)夜。次日，充分洗滌后，加入Alexa Fluor 594標(biāo)記的山羊抗小鼠熒光二抗（1 : 100，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），37℃避光孵育1 h后，0.01 mol/L PBS沖洗，含6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的熒光封片劑（F6057，Sigma，美國(guó)）封片。每張切片隨機(jī)取5個(gè)視野，正置熒光顯微鏡下觀察、拍照，并計(jì)數(shù)大腦皮質(zhì)及海馬CA1區(qū)NeuN+細(xì)胞數(shù)。

1.6 MBP/NF200免疫熒光雙標(biāo)染色

各組每只大鼠分別取腦組織石蠟切片5～6張，同1.5方法處理切片，水浴熱修復(fù)法修復(fù)抗原，37℃血清封閉后，加入小鼠抗大鼠NF200（1 : 500，Cell Signaling Technology，美國(guó)）與兔抗大鼠MBP（1 : 75，武漢博士德）一抗混合液，4℃冰箱孵育過(guò)夜。次日，充分洗滌后，滴加Alexa Fluor 488標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1 : 100）和山羊抗小鼠IgG（1 : 100）熒光二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）混合液，37℃避光孵育1 h后沖洗，含DAPI熒光封片劑封片。每張切片隨機(jī)取5個(gè)視野，正置熒光顯微鏡下拍照，并采用Image J軟件分析腦組織紋狀體區(qū)、胼胝體區(qū)熒光強(qiáng)度（fluorescense intensity, FI），即FIMBP、FINF200。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組新生大鼠Morris水迷宮測(cè)試結(jié)果

HIBD后21 d，Morris水迷宮測(cè)試結(jié)果顯示各組大鼠逃避潛伏期比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=97.29，P＜0.001，n=8）。HIBD組大鼠逃避潛伏期[（43.2±3.5）s]較假手術(shù)組[（21.3±2.1）s]顯著延長(zhǎng)（P＜0.05）。SDIT組[（31.4±2.8）s]和7DCT組[（25.3±2.4）s]大鼠逃避潛伏期均較HIBD組顯著縮短（P＜0.05），但仍長(zhǎng)于假手術(shù)組（P＜0.05）；且7DCT組逃避潛伏期短于SDIT組（P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 不同褪黑素治療方案對(duì)HIBD新生大鼠Morris水迷宮測(cè)試的影響 假手術(shù)組大鼠水中活動(dòng)路徑最短最簡(jiǎn)單，HIBD組大鼠水中活動(dòng)路徑最長(zhǎng)最復(fù)雜，SDIT組大鼠水中活動(dòng)路徑較長(zhǎng)較復(fù)雜，7DCT組大鼠水中活動(dòng)路徑較短較簡(jiǎn)單。

2.2 各組新生大鼠大腦皮質(zhì)及海馬CA1區(qū)神經(jīng)元個(gè)數(shù)變化

NeuN是成熟神經(jīng)元的標(biāo)記物，新生大鼠HIBD后，大腦皮質(zhì)與海馬CA1區(qū)是神經(jīng)元易受損傷的腦區(qū)。本研究分別觀察HIBD后，各組大鼠大腦皮質(zhì)及海馬CA1區(qū)NeuN+細(xì)胞數(shù)的變化。HIBD后70 d（生后77 d），假手術(shù)組大鼠大腦皮質(zhì)及海馬CA1區(qū)均可見(jiàn)大量NeuN+細(xì)胞，細(xì)胞分布均勻，排列整齊；HIBD組新生大鼠NeuN+細(xì)胞數(shù)較假手術(shù)組顯著減少（P＜0.05），細(xì)胞排列不整齊；SDIT組與7DCT組均可見(jiàn)NeuN+細(xì)胞多于HIBD組，但仍少于假手術(shù)組（P＜0.05）；且7DCT組NeuN+細(xì)胞數(shù)顯著多于SDIT組（P＜0.05）。見(jiàn)圖2、表1。

圖2 不同褪黑素治療方案對(duì)HIBD新生大鼠NeuN+細(xì)胞的影響（免疫熒光染色，×400） NeuN是成熟神經(jīng)元的標(biāo)記物，NeuN+細(xì)胞核染為紅色，DAPI+細(xì)胞核染為藍(lán)色。假手術(shù)組大腦皮質(zhì)及海馬CA1區(qū)均可見(jiàn)大量NeuN+細(xì)胞；HIBD組NeuN+細(xì)胞明顯少于假手術(shù)組；SDIT組及7DCT組NeuN+細(xì)胞均多于HIBD組，但仍少于假手術(shù)組；且7DCT組NeuN+細(xì)胞多于SDIT組。

表1 各組大鼠大腦皮質(zhì)及海馬CA1區(qū)NeuN+細(xì)胞數(shù)比較（個(gè)/mm2，n=8）

2.3 各組新生大鼠大腦紋狀體及胼胝體區(qū)FIMBP、FINF200變化

MBP包繞在NF200周?chē)鷺?gòu)成有髓神經(jīng)纖維，本研究觀察各組大鼠大腦紋狀體與胼胝體區(qū)MBP及NF200蛋白表達(dá)的變化。MBP染為綠色熒光，包繞在NF200（染為紅色熒光）的周?chē)?/p>

HIBD后70 d，假手術(shù)組大鼠大腦紋狀體區(qū)可見(jiàn)大量MBP及NF200蛋白表達(dá)；與假手術(shù)組相比，HIBD組大鼠大腦紋狀體區(qū)FIMBP、FINF200均降低（P＜0.05）；SDIT組和7DCT組大鼠大腦紋狀體區(qū)FIMBP、FINF200顯著高于HIBD組（P＜0.05），但仍低于假手術(shù)組（P＜0.05）；且7DCT組FIMBP、FINF200顯著高于SDIT組（P＜0.05）。見(jiàn)圖3、表2。

HIBD后70 d，假手術(shù)組大鼠大腦胼胝體區(qū)可見(jiàn)大量MBP及NF200蛋白表達(dá)；與假手術(shù)組相比，HIBD組和SDIT組大鼠大腦胼胝體區(qū)FIMBP、FINF200均降低（P＜0.05），但HIBD組和SDIT組大鼠大腦胼胝體區(qū)FIMBP、FINF200比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；7DCT組大鼠大腦胼胝體區(qū)FIMBP、FINF200顯著高于SDIT組和HIBD組，但仍低于假手術(shù)組（P＜0.05）。見(jiàn)圖4、表3。

表2 各組大鼠大腦紋狀體區(qū)FIMBP及FINF200比較（x±s，n=8）

表3 各組大鼠大腦胼胝體區(qū)FIMBP及FINF200比較（x±s，n=8）

圖3 不同褪黑素治療方案對(duì)HIBD新生大鼠大腦紋狀體區(qū)髓鞘及軸突損傷的影響（MBP/NF200免疫熒光雙標(biāo)染色，×400） MBP標(biāo)記髓鞘，染為綠色；NF200標(biāo)記神經(jīng)纖維絲蛋白，染為紅色；DAPI標(biāo)記細(xì)胞核，染為藍(lán)色；MBP+NF200+標(biāo)記神經(jīng)纖維束。假手術(shù)組可見(jiàn)大量髓鞘蛋白及神經(jīng)纖維絲蛋白表達(dá)，神經(jīng)纖維束完整；HIBD組僅見(jiàn)少量髓鞘蛋白及神經(jīng)纖維絲蛋白表達(dá)，神經(jīng)纖維束不完整；SDIT組和7DCT組可見(jiàn)較多髓鞘蛋白及神經(jīng)纖維絲蛋白表達(dá)，且7DCT組神經(jīng)纖維束較SDIT組更完整。

圖4 不同褪黑素治療方案對(duì)HIBD新生大鼠大腦胼胝體區(qū)髓鞘及軸突損傷的影響（MBP/NF200免疫熒光雙標(biāo)染色，×400） MBP標(biāo)記髓鞘，染為綠色；NF200標(biāo)記神經(jīng)纖維絲蛋白，染為紅色；DAPI標(biāo)記細(xì)胞核，染為藍(lán)色；MBP+NF200+標(biāo)記神經(jīng)纖維束。假手術(shù)組可見(jiàn)大量髓鞘蛋白及神經(jīng)纖維絲蛋白表達(dá)，神經(jīng)纖維束完整；HIBD組和SDIT組均可見(jiàn)少量髓鞘蛋白及神經(jīng)纖維絲蛋白表達(dá)，神經(jīng)纖維束不完整；7DCT組可見(jiàn)較多髓鞘蛋白及神經(jīng)纖維絲蛋白表達(dá)，神經(jīng)纖維束較HIBD組及SDIT組更完整。

3 討論

圍生期窒息可導(dǎo)致癲癇、腦癱等后遺癥，發(fā)病癥狀與WMD密切相關(guān)。鑒于新生兒具有較強(qiáng)的再生能力與神經(jīng)修復(fù)潛能，如果早期給予干預(yù)治療可減輕WMD。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)Mel的7DCT方案可更易促進(jìn)腦內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，研究還發(fā)現(xiàn)Mel可改善腦內(nèi)微環(huán)境，減輕WMD[8]，但不同治療方案對(duì)HIBD新生大鼠WMD的影響尚未見(jiàn)報(bào)道，本課題組就此科學(xué)問(wèn)題展開(kāi)研究，以期為較優(yōu)Mel治療方案的選擇提供科學(xué)依據(jù)。

NeuN是成熟神經(jīng)元的常用標(biāo)記物，本研究采用NeuN免疫熒光染色法分別觀察各組大鼠大腦皮質(zhì)與海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HIBD組神經(jīng)元數(shù)少于假手術(shù)組，提示造模成功，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致[9]。SDIT組和7DCT組新生大鼠成熟神經(jīng)元數(shù)多于HIBD組，且7DCT組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)多于SDIT組，提示本研究Mel治療HIBD有效，且7DCT治療方案的療效優(yōu)于SDIT。

行為學(xué)檢測(cè)可反映動(dòng)物運(yùn)動(dòng)機(jī)能和精神狀態(tài)，是觀察治療后WMD修復(fù)的可靠手段。Morris測(cè)試結(jié)果顯示，SDIT組和7DCT組大鼠平均逃避潛伏期時(shí)間均短于HIBD組，且7DCT組平均逃避潛伏期時(shí)間短于SDIT組，提示兩種Mel治療方案均可從行為學(xué)水平改善大鼠空間記憶能力，且7DCT組更優(yōu)，其機(jī)制可能與7DCT更易減輕HIBD后腦白質(zhì)區(qū)髓鞘和神經(jīng)纖維束損傷，有助于改善大鼠運(yùn)動(dòng)和空間記憶能力有關(guān)[10]，但7DCT如何減輕HIBD新生大鼠腦白質(zhì)區(qū)髓鞘和神經(jīng)纖維束的損傷尚不清楚，Mel減輕WMD是否與其促進(jìn)HIBD新生大鼠內(nèi)源性神經(jīng)再生有關(guān)尚不清楚，而不同Mel治療方案對(duì)HIBD新生大鼠遠(yuǎn)期行為學(xué)的影響尚有待更多行為學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

腦白質(zhì)是大腦發(fā)揮高級(jí)功能的重要部位。神經(jīng)沖動(dòng)沿有髓神經(jīng)纖維跳躍傳導(dǎo)是大腦處理外界信息的重要保障。神經(jīng)信號(hào)的傳導(dǎo)速度與神經(jīng)軸突及其周?chē)乃枨拭芮邢嚓P(guān)。HIE發(fā)生后，腦白質(zhì)脫髓鞘致使神經(jīng)傳導(dǎo)受累，損害機(jī)體行為認(rèn)知功能[11]。MBP是髓鞘的標(biāo)記物，NF200為神經(jīng)絲蛋白的標(biāo)記物，本實(shí)驗(yàn)于HIBD后70 d行MBP/NF200免疫熒光雙重染色，以觀察不同Mel治療方案對(duì)大鼠大腦紋狀體區(qū)及胼胝體區(qū)有髓神經(jīng)纖維束的保護(hù)作用。結(jié)果顯示，SDIT和7DCT組大鼠大腦紋狀體區(qū)FIMBP、FINF200高于HIBD組，且7DCT組高于SDIT組，提示SDIT與7DCT兩種Mel治療方案均可減輕大腦紋狀體區(qū)神經(jīng)纖維束損傷，7DCT方案療效較優(yōu)。7DCT組大鼠大腦胼胝體區(qū)FIMBP、FINF200高于HIBD組，而SDIT組大鼠大腦胼胝體區(qū)FIMBP、FINF200與HIBD組無(wú)差別，提示7DCT治療方案可減輕大鼠大腦胼胝體區(qū)神經(jīng)纖維束損傷，且療效優(yōu)于SDIT。

綜上，兩種Mel治療方案均可減輕新生大鼠HIBD后WMD，并改善大鼠運(yùn)動(dòng)和空間記憶能力，且7DCT治療方案療效較優(yōu)。