吳澤鈺，林 靜，趙 今，薛 瑞

復(fù)發(fā)性阿弗他口腔潰瘍(recurrent aphthous ulcer, RAU)是最常見的口腔黏膜潰瘍類疾病，調(diào)查發(fā)現(xiàn)10%～25%人患有該病，女性高于男性，好發(fā)于10～30歲[1]。RAU病因復(fù)雜多樣，尚沒有對其治療的特效方法。目前治療主要是針對其臨床癥狀、持續(xù)時間、嚴(yán)重程度和患者體質(zhì)反應(yīng)而定。中藥治療RAU表現(xiàn)出整體調(diào)節(jié)、多層次、多靶點作用，具有祛風(fēng)除濕、消腫止痛、清熱解毒等功效，還能緩解和對抗西藥的不良反應(yīng)[2]。

衛(wèi)矛科植物雷公藤(TripterygiumwilfordiiHook. f.)的根、葉及花，味苦、辛，有大毒，性寒；歸肝、腎經(jīng)；具有止痛，消腫，解毒，活血通絡(luò)等作用[3]。其主要成分為生物堿類，如雷公藤堿、雷公藤次堿等；尚含二蔽類、三萜類及脂肪油等成分，具有免疫抑制、抗炎、抗腫瘤等作用[4]。由于雷公藤含有多種活性成分，其治療RAU作用靶點及機制也尚不完全明確，不同成分發(fā)揮活性和毒理的作用也不清楚，都限制其的臨床應(yīng)用，若按傳統(tǒng)的成分分離、活性測定、毒理分析，時間長、難度大。

英國藥理學(xué)家Hopkins[5]在2007年提出網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)概念，基于系統(tǒng)生物學(xué)理論，運用生物信息學(xué)方法進行高通量篩選、網(wǎng)絡(luò)分析等揭示“藥物成分-作用靶點-疾病”之間的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，突破了傳統(tǒng)的“一藥、一靶、一病”的觀念，具有中醫(yī)整體觀和辨證治療的特點，對預(yù)測中藥多成分、多靶點、多途徑的作用機制具有重要意義。本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法從整體性的角度探討雷公藤治療RAU的作用，并對作用靶點及分子機制進行研究，為后續(xù)從雷公藤中開發(fā)活性高、毒性低的治療RAU的藥物提供實驗和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 雷公藤化學(xué)成分及對應(yīng)作用靶點的篩選

在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫及分析平臺(TCMSP)[6]、中藥綜合數(shù)據(jù)庫(TCMID)中檢索“雷公藤”，得到雷公藤的成分及作用靶點。利用PubChem和ChemBL確定成分的三維結(jié)構(gòu)，建立雷公藤成分?jǐn)?shù)據(jù)庫。

1.2 活性化合物的閾值篩選

本研究選擇化合物口服生物利用度(oral bioavailability, OB)≥30%，化合物類藥性(drug likeness, DL)≥0.18，作為篩選條件[7]。

1.3 RAU的靶點基因的篩選

通過在Gene Cards、DisGeNET、DrugBank和OMIM中輸入recurrent aphthous stomatitis等關(guān)鍵詞搜索相關(guān)基因，得到的疾病靶點與雷公藤治療靶點篩選出共同靶點，作為雷公藤的治療RAU的治療靶點。

1.4 成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將雷公藤化學(xué)成分、治療靶點導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建“藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)，刪除重復(fù)和孤立邊，Network Analyzer分析拓?fù)鋵傩?，?jié)點反映網(wǎng)絡(luò)中連接“度”的大小，以此為參考，篩選網(wǎng)絡(luò)拓?fù)渲械年P(guān)鍵靶蛋白。計算節(jié)點的中介中心度(betweenness centrality, BC)、接近中心性(closeness centrality, CC) 和拓?fù)湎禂?shù)(topological coefficient, TC)的相關(guān)信息[8-9]。確定關(guān)鍵節(jié)點，分析主要靶點及其作用機制。

1.5 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction, PPI)全局網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

STRING 11.0[10](https://string-db.org)是一個儲存已知的和預(yù)測的蛋白質(zhì)相互作用的數(shù)據(jù)庫，包含蛋白質(zhì)間直接的和間接的相互作用，其對每個蛋白質(zhì)相互作用信息都進行打分，分值越高說明蛋白質(zhì)的相互作用置信度越高。輸入靶點，得到分值>0.4的高置信度蛋白相作數(shù)據(jù)，得到蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)。構(gòu)建PPI，利用Network Analyzer分析拓?fù)鋵傩浴?/p>

1.6 基因本體( gene ontology, GO) 和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路富集分析

生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫(DAVID, https://david.ncifcrf.gov)為大規(guī)模基因或蛋白列表提供系統(tǒng)綜合的生物功能注釋信息，找出顯著富集的生物學(xué)注釋[11]。使用DAVID 6.8對靶點進行GO[12]、KEGG[13]富集分析，篩選生物途徑和分子功能篩選錯誤率(false discovery rate, FDR)<0.01，P<0.01，結(jié)果利用R 3.6.1可視化。

2 結(jié) 果

2.1 雷公藤化學(xué)成分的篩選

TCMSP、TCMID數(shù)據(jù)庫獲得雷公藤化學(xué)成分144個,根據(jù)篩選條件共篩選出化學(xué)成分51個，詳見表1。

表1 雷公藤主要化學(xué)成分及參數(shù)Tab.1 Chemical components of Tripterygium wilfordii for network pharmacology analysis

2.2 雷公藤作用于RAU相關(guān)靶點

雷公藤的51個化學(xué)成分在TCMSP、TCMID數(shù)據(jù)庫中獲得靶點484個, 去重后150個。上述數(shù)據(jù)庫得到4 631個RAU靶點, 去重后2 562個?；蚺c靶點韋恩分析, 得到106個雷公藤治療RAU的潛在靶點, 詳見表2，圖1。

圖1 Venn圖Fig.1 Venn diagram

表2 雷公藤治療RA的成分作用靶標(biāo)信息Tab.2 Targets related to the prevention of RAU

2.3 化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

運用Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建雷公藤化學(xué)成分-靶點網(wǎng)絡(luò)，如圖2所示。圖中共137個節(jié)點(51個化學(xué)成分，106個靶點)和428條邊。網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)分析顯示，化合物的平均度數(shù)為11.103，說明雷公藤治療RAU有多靶點屬性，其拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)見表3。

表3 雷公藤化學(xué)成分的拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)分析Tab.3 Topological parameter analysis of Tripterygium wilfordii chemical components

圖2 雷公藤化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)Fig.2 Tripterygium wilfordii chemical components-targets network diagram

同時，可以看出雷公藤中發(fā)揮主要作用的成分山奈酚、雷公藤甲素、川陳皮素。許多靶點與多種成分相關(guān)，這表明雷公藤發(fā)揮藥效過程中不同成分之間存在協(xié)同作用。

2.4 蛋白-蛋白網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

STRING獲取106個靶點的PPI關(guān)系。選擇組合得分>0.4，PPI關(guān)系網(wǎng)絡(luò)有106個節(jié)點和1 298個邊緣，網(wǎng)絡(luò)的平均度值為24.5。節(jié)點反映網(wǎng)絡(luò)中連接“度”的大小，按照度值降序排序篩選出核心靶蛋白10個：AKT1、TNF、VEGFA、TP53、CXCL8、STAT3、JUN、PTGS2、CASP3、MMP9，見表4、圖3。

A: PPI網(wǎng)絡(luò); B: PPI 網(wǎng)絡(luò)中的基因邊緣數(shù)排序圖3 雷公藤化學(xué)成分治療RAU靶蛋白-蛋白相互作用Fig.3 Tripterygium wilfordii chemical components treatment of RAU targets protein-protein interaction

表4 雷公藤治療RAU核心蛋白互作的拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)分析Tab.4 Topological parameter analysis of protein-protein interaction

2.5 GO和KEGG富集分析

對上述106個蛋白進行GO富集分析，根據(jù)FDR<0.1確定了80個GO條目，并做相應(yīng)的條形圖及氣泡圖，見表5、圖4。由表4 可見，生物過程(biological process, BP)相關(guān)條目56個，涉及對藥物的反應(yīng)、細(xì)胞對脂多糖的反應(yīng)、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控等方面;分子功能(molecular function,MF)相關(guān)條目16個，涉及酶結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子活性、類固醇激素受體等方面; 細(xì)胞成分(cellular component, CC)相關(guān)條目8個，涉及膜筏、細(xì)胞外空間、細(xì)胞質(zhì)等方面。KEGG分析得到117條信號通路，根據(jù)P篩選出81條通路，繪制氣泡圖，見表6、圖5。其中，信號通路包括TNF信號通路、Toll樣受體通路、癌癥通路等通路；疾病通路有乙肝、弓形蟲病、美洲錐蟲病等通路；生物系統(tǒng)相關(guān)通路有細(xì)胞凋亡等通路。

表5 雷公藤治療RAU的潛在靶點GO富集分析結(jié)果(各前5條)Tab.5 The results of GO enrichment analysis of potential targets for Tripterygium wilfordii treatment of RAU

表6 雷公藤治療RAU的潛在靶點KEGG富集分析(前10條)Tab.6 The results of KEGG enrichment analysis of potential targets for Tripterygium wilfordii treatment of RAU

圖4 雷公藤治療RAU的潛在靶點的GO富集分析Fig.4 The results of GO enrichment analysis of potential targets for Tripterygium wilfordii treatment of RAU

圖5 雷公藤治療RAU的潛在靶點的KEGG富集分析Fig.5 The results of KEGG enrichment analysis of potential target for Tripterygium wilfordii treatment of RAU

3 討 論

RAU是發(fā)生于口腔黏膜的一類原因不明、反復(fù)發(fā)作但又有自限性的、圓形或橢圓形的潰瘍。目前，RAU的病因及致病機制仍然不明。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為是免疫、遺傳、系統(tǒng)性疾病、感染等多種因素綜合作用的結(jié)果。其中免疫機制起重要的作用。免疫學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)有些RAU患者血循環(huán)中免疫球蛋白、免疫復(fù)合物等均高于正常人，并有多種抗體，因而認(rèn)為RAU可能是自身免疫性疾?。灰灿腥苏J(rèn)為RAU發(fā)生可能與纖維蛋白溶解系統(tǒng)功能下降、微循環(huán)障礙有關(guān)[14-15]。

雷公藤具有類皮質(zhì)激素作用，是治療RAU的首選中藥材，明朝醫(yī)家蘭茂在《滇南本草》中首次說明了雷公藤的功效，其可入十二經(jīng)絡(luò)，有活血化瘀、消腫散結(jié)、清熱解毒的作用，現(xiàn)代藥理研究證實[16]，雷公藤含有80種以上有效成分，其中雷公藤甲素是最主要的免疫抑制與抗炎成分。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法篩選出雷公藤中包括雷公藤甲素、雷酚萜醇、雷酚酮內(nèi)酯等51個成分及150個靶點，在4個數(shù)據(jù)庫中得到RAU相關(guān)靶點2 562個，與雷公藤的藥物靶點取交集得到雷公藤治療RAU靶點106個。構(gòu)建了“雷公藤-成分-靶標(biāo)-RAU”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，調(diào)控網(wǎng)絡(luò)顯示山奈酚、雷公藤甲素、川陳皮素等匹配多靶點，是雷公藤治療RAU的關(guān)鍵成分。靶點中AKT1、TNF、VEGFA、TP53、CXCL8等處于網(wǎng)絡(luò)中心位置，是雷公藤治療RAU調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的潛在調(diào)節(jié)因子。

雷公藤甲素，又名雷公藤內(nèi)酯，是雷公藤的主要活性成分之一。雷公藤甲素具有抗氧化、抗類風(fēng)濕、抗老年性癡呆癥、抗癌等多種生物活性。研究發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素能夠顯著降低血清和組織內(nèi)VEGF、TNF表達，能夠抑制VEGF表達，激活CASP3、CASP8、CASP9等誘導(dǎo)外周CD4+、CD8+T細(xì)胞凋亡，使口腔黏膜血管通透性增強、炎癥細(xì)胞的趨化、前列腺素和其他炎癥遞質(zhì)的產(chǎn)生和釋放等出現(xiàn)明顯的抑制作用達到治療的目的[17]。山奈酚是黃酮類化合物，具有抗氧化、抗炎、抗癌等多種生物活性，且安全無毒，具有良好的開發(fā)和應(yīng)用前景。其具有非常明顯的抗炎作用，作用機制主要通過調(diào)節(jié)促炎酶活性和炎癥相關(guān)基因的表達，包括抑制轉(zhuǎn)錄因子、粘附分子和基質(zhì)金屬蛋白酶等[18]，也能抑制上皮細(xì)胞的STAT3的激活，從而抑制炎癥的發(fā)生與發(fā)展[19]。研究證實雷公藤多種成分都可以降低小鼠血清IL2、TNF水平,并促進T細(xì)胞凋亡，下調(diào)小鼠組織中MMP9的表達、抑制MMP9的激活[20]。

本研究對雷公藤的治療RAU的106個靶點進行了GO富集分析和KEGG信號通路分析。GO富集分析發(fā)現(xiàn)雷公藤治療RAU的靶點涉及到了對藥物的反應(yīng)、細(xì)胞對脂多糖的反應(yīng)、酶結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子活性、膜筏、細(xì)胞外空間等80個GO條目。Liu等[21]發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素能抑制脂多糖誘導(dǎo)DC產(chǎn)生趨化因子，從而減少中性粒細(xì)胞和T細(xì)胞的趨化。這些富集分析結(jié)果均與RAU發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，體現(xiàn)了雷公藤治療RAU具有多成分-多靶點-多途徑作用的特點。KEGG富集分析得到與雷公藤治療RAU相關(guān)的信號通路有117條，主要涉及TNF信號通路、Toll樣受體通路、癌癥通路、VEGF信號通路和T細(xì)胞受體信號通路等。在炎癥反應(yīng)中，TNF能夠趨化并活化中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞、增加血管通透性及誘導(dǎo)多種炎性介質(zhì)、粘附分子產(chǎn)生。雷公藤能夠緩解結(jié)腸炎小鼠的腸道炎癥，其作用機制包括抑制TLR、NF-κB、TNF、VEGF信號通路，降低IL2、STAT3、TNF、VEGF水平[22-23]。研究發(fā)現(xiàn)，雷公藤能夠抑制T細(xì)胞早期和中期的活化信號通路以及抑制T細(xì)胞中NF-κB的轉(zhuǎn)錄活化，抑制T 細(xì)胞激活后產(chǎn)生和釋放IL2等細(xì)胞因子，從而調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)[16]。雷公藤具有調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫、抑制體液免疫、抗炎和活血化瘀的作用，具有起病快、療效強、療效確切、皮質(zhì)類固醇作用而無激素樣不良反應(yīng)等特點。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究，闡述了雷公藤活性成分、潛在治療靶點及相互作用途徑，發(fā)現(xiàn)了山奈酚、雷公藤甲素和川陳皮素等主要成分通過AKT1、TNF、VEGFA、TP53、CXCL8等核心靶點發(fā)揮治療RAU的藥理作用。雷公藤治療RAU具有多成分-多靶點-多途徑的特性，為將來從雷公藤中開發(fā)出高活性、低毒性的治療RAU藥物的深入研究提供了理論依據(jù)。