張廣智，武作龍，賀學崗，高一誠，郭旭東，王以典，劉明強，朱大學，康學文*

(1.蘭州大學第二醫(yī)院骨科，中國甘肅蘭州730030；2.甘肅省骨關節(jié)疾病研究重點實驗室，中國甘肅蘭州730030)

椎間盤退變(intervertebral disc degeneration，IDD)是一種常見的肌肉骨骼系統(tǒng)退行性疾病，也是導致慢性腰背部疼痛的主要原因，嚴重影響患者的生活質(zhì)量，給家庭和社會造成極大的經(jīng)濟負擔[1]。據(jù)估計，約20%的青少年有輕度的IDD，并且80%的人在一生中出現(xiàn)過背部疼痛癥狀[2]。IDD的具體發(fā)病機制目前仍不完全清楚，現(xiàn)有的研究認為，IDD是一種細胞介導的復雜過程，最終導致椎間盤功能和結構的改變[3]。其中，細胞衰老被認為是導致IDD的主要原因之一，而炎癥反應、氧化應激、線粒體功能障礙、端?？s短和DNA損傷、營養(yǎng)剝奪、機械負荷異常和表觀遺傳學改變參與了椎間盤細胞的衰老進程，最終導致IDD的發(fā)生發(fā)展[4]。目前，關于細胞衰老與IDD的研究多集中在椎間盤髓核(nucleus pulposus，NP)細胞、纖維環(huán)(anulus fibrosus，AF)細胞和軟骨終板(cartilage endplate，CEP)細胞。本文就這方面研究進展作一綜述，為后續(xù)相關研究提供參考。

1 椎間盤結構和功能概述

作為連接椎體的關節(jié)，椎間盤是脊柱承載系統(tǒng)中最為關鍵的部分，其主要作用是傳遞和吸收作用在脊柱軸向的壓縮應力并保持脊柱的多軸靈活性，因此，是人體中較早發(fā)生退行性改變的組織[5]。健康的椎間盤由中央凝膠狀的NP、外周包繞髓核的AF及連接上下椎體的CEP共同構成[6]。NP主要由富含Ⅱ型膠原蛋白、彈性蛋白和蛋白聚糖的細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)組成，在脊柱受力過程中主要起抵消和傳遞軸向壓力載荷作用。AF的ECM主要由相互交替的Ⅰ型膠原纖維組成，主要功能是在脊柱彎曲或扭曲過程中防止髓核在壓力作用下突出。CEP是厚度均勻的透明軟骨組織，其ECM主要由蛋白聚糖和膠原纖維組成。由于椎間盤是無血管無神經(jīng)的組織，CEP在椎間盤的營養(yǎng)供應中起重要作用，椎間盤通過CEP以擴散的方式交換營養(yǎng)物質(zhì)和代謝廢物，從而維持其正常的結構和功能[7]。此外，在正常椎間盤中，許多生長因子和細胞因子使ECM的合成和分解保持動態(tài)平衡[8]。因此，各種原因導致的椎間盤功能和結構的異常終將導致IDD。

2 細胞衰老的特征

早在1961年，Hayflick等[9]就發(fā)現(xiàn)正常人成纖維細胞在連續(xù)傳代后出現(xiàn)增殖能力受到限制，并首次提出“細胞衰老”這一概念。細胞衰老是指細胞處于不可逆性的增殖停滯狀態(tài)，細胞周期永久性停滯在G0/G1期，形態(tài)上表現(xiàn)為形狀變大、胞質(zhì)內(nèi)色素堆積和空泡形成，線粒體數(shù)量減少，胞核增大、核膜內(nèi)陷和染色質(zhì)固縮等，最終導致細胞死亡[10～11]。衰老細胞的另一個重要特征就是分泌多種炎癥因子、趨化因子、生長因子和組織重建蛋白酶等，組成衰老相關分泌表型(senescence-associated secretory phenotype，SASP)。這些因子廣泛參與炎癥反應、細胞增殖和遷移等多種生物學過程，其作用十分廣泛。細胞衰老主要分為兩種類型，即細胞復制性衰老和細胞過早性衰老。細胞在連續(xù)復制過程中導致端?？s短引起的衰老稱為復制性衰老，而由炎癥反應、氧化應激、DNA損傷和線粒體功能障礙等外源性壓力誘導的細胞衰老稱為細胞過早性衰老。當細胞出現(xiàn)衰老后，衰老相關 β-半乳糖苷酶(senescence-associated β-galactosidase，SA-β-gal)特異性表達升高，且 p53、p21、p16等細胞周期抑制蛋白表達上調(diào)，它們是鑒定細胞衰老的主要標志物[12]。

3 椎間盤細胞衰老與IDD

當椎間盤NP細胞、AF細胞和CEP細胞發(fā)生衰老后局部代謝狀態(tài)發(fā)生改變，表現(xiàn)為合成代謝降低、分解代謝加強，導致ECM降解增加、NP含水量下降、AF彈性降低及CEP鈣化增加，最終導致脊柱穩(wěn)定性下降、椎間盤塌陷、椎體滑脫、骨贅形成、AF撕裂及NP組織突出等一系列病理改變[8]。相關研究表明，在IDD患者的NP和AF組織中SA-β-gal染色呈陽性的細胞數(shù)量顯著增多，且這種陽性細胞數(shù)量與椎間盤磁共振下Pfirrmann分級呈正相關，而與Ki67陽性細胞(增殖細胞)的數(shù)量呈負相關[13～15]，提示椎間盤細胞衰老水平與IDD嚴重程度正相關。最近研究表明，炎癥反應、氧化應激、線粒體功能障礙、端?？s短和DNA損傷、營養(yǎng)剝奪及機械負荷異常等因素介導了細胞衰老相關的IDD發(fā)展。

3.1 炎癥反應

炎癥反應通常被認為是機體應對感染或組織損傷后的一種病理過程，越來越多的證據(jù)表明炎癥是IDD進程中的關鍵因素[16～17]。隨著IDD進展，退變椎間盤中各種促炎細胞因子的水平顯著增加，包括白細胞介素-1α (interleukin-1α，IL-1α)、IL-1β、IL-6、IL-17和腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-α，TNF-α)等[18～25](表 1)，這些炎癥因子在局部產(chǎn)生自身免疫炎癥反應并使椎間盤ECM的分解代謝增強，從而導致椎間盤功能紊亂和結構改變。相關研究表明，在變性椎間盤中IL-1β的水平增加，且隨著IDD的嚴重程度而增加；IL-1β不僅能直接抑制ECM合成，而且還形成一個正反饋回路，刺激其他炎癥介質(zhì)的釋放和基質(zhì)金屬蛋白酶的合成，進而導致椎間盤局部分解代謝增強[16]。體外實驗證實，用IL-1β刺激人NP和AF細胞后，IL-6、IL-8和IL-17的水平均顯著增加?？梢?，IL-1β可通過促進IL-6、IL-8和IL-17的釋放而充當炎癥級聯(lián)事件的關鍵引發(fā)劑[18]。Chen等[19]用酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)方法檢測了腰椎間盤突出癥患者的血清IL-21濃度，發(fā)現(xiàn)其較椎間盤未突出患者明顯增加。Gorth等[20]通過研究IL-1在年齡相關IDD中的作用發(fā)現(xiàn)，給予小鼠IL-1α/β雙基因敲除(IL-1KO)后，血液中炎癥因子γ干擾素(interferon-γ，IFN-γ)、IL-5和IL-15的濃度顯著降低。重要的是，這些炎癥介質(zhì)參與椎間盤細胞衰老進程。Markova等[21]研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α增加了體外培養(yǎng)牛椎間盤細胞中SA-β-gal染色陽性細胞的數(shù)量，并導致ECM從合成代謝轉變?yōu)榉纸獯x。同樣，在用TNF-α和IL-1β處理大鼠NP細胞后，SA-β-gal陽性細胞數(shù)量也顯著增加[22]。此外，一些炎癥因子如IL-1β、IL-6、TNF-α等對長入椎間盤的竇椎神經(jīng)末梢產(chǎn)生炎性刺激，進而引發(fā)神經(jīng)根性疼痛的臨床癥狀[4]。以上研究表明，炎癥因子是強大的促細胞衰老因子，是導致IDD的關鍵因素之一，也是導致慢性腰背痛的重要原因。

表1 椎間盤退變后主要促炎因子的變化Table 1 Major variations in proinflammatory factors after IDD

3.2 氧化應激

氧化應激是導致椎間盤細胞衰老的主要原因之一，隨著IDD的發(fā)展，椎間盤中活性氧(reactive oxygen species，ROS)的水平顯著增加，包括超氧陰離子(O2·－)、羥基自由基(·OH)、過氧化氫(H2O2)和一氧化氮(NO)，它們是細胞氧化代謝的副產(chǎn)物[26～27]。NP細胞是椎間盤中最重要的功能性細胞，已被證明是無厭氧的，在體內(nèi)進行有氧代謝，而ROS是其主要的代謝副產(chǎn)物[12]。過量ROS介導的氧化應激通過各種信號通路加速椎間盤的變性，包括核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)信號通路、絲裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路和 PI3K-Akt信號通路等[28～30]。Patil等[31]通過研究亞致死濃度H2O2介導的氧化應激誘導的大鼠NP細胞過早衰老的過程，發(fā)現(xiàn)當細胞長期暴露于這種亞致死性氧化應激時，它們會變成衰老細胞，失去增殖能力，但仍具有活細胞的功能，表現(xiàn)為大的細胞畸形，細胞周期停滯在G0/G1期，同時衰老相關信號通路(p53-p21-pRb 和 p16-pRb 信號通路)激活，SA-β-gal染色陽性。以上研究表明，氧化應激在NP細胞衰老中起著至關重要的作用。

AF位于椎間盤的周緣部，由內(nèi)、外層呈同心圓排列的纖維構成，內(nèi)層是纖維軟骨帶，外層主要為膠原纖維。堅固的AF包圍著內(nèi)部柔軟的NP，AF最重要的功能可能是通過液壓密封NP細胞并使施加在椎間盤上的任何壓力均勻化從而限制NP的突出，各種原因引起的AF降解都會導致其功能喪失，引起NP突出，從而引發(fā)腰背疼痛和神經(jīng)損傷等一系列臨床癥狀[32]。有研究表明，與正常的椎間盤相比，IDD患者中的AF細胞凋亡增加，而氧化應激在AF細胞凋亡中扮演重要的作用[33]。此外，AF細胞中過量ROS與TNF-α之間形成的正反饋回路也參與IDD的發(fā)展[34]。然而，在氧化應激條件下，AF細胞的衰老是否參與其凋亡過程，目前未見相關文獻報道，值得未來進一步研究。

3.3 線粒體功能障礙

線粒體是真核細胞內(nèi)具有雙層膜結構的細胞器，由線粒體內(nèi)膜包繞的線粒體基質(zhì)含有完成三羧酸循環(huán)以及氧化還原反應的重要組分，其通過氧化磷酸化過程產(chǎn)生三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)，從而保證細胞的正常功能[35]。ATP 是細胞最主要的能量來源，但在ATP產(chǎn)生的同時也會產(chǎn)生ROS來介導氧化應激[36]。隨著年齡的增長，線粒體DNA損傷加劇，導致線粒體功能障礙和異常的電子泄漏，從而增加ROS的產(chǎn)生，同時細胞氧化還原平衡能力的降低導致ROS對細胞的氧化損害增加，進而介導細胞衰老。相反，線粒體呼吸鏈解偶聯(lián)可減少H2O2的產(chǎn)生，從而延遲細胞的復制性衰老[12]。

椎間盤細胞線粒體功能受損參與IDD的發(fā)生發(fā)展[37]。有研究表明，在大鼠NP細胞中Progerin蛋白的積累可以通過提高ROS水平，破壞線粒體膜電位，降低ATP產(chǎn)生以及改變線粒體酶復合物的活性，進而破壞線粒體的結構和功能，加速IDD進程[38]。另有研究報道，衰老的NP細胞中與線粒體功能相關的基因(包括底物脫氫酶、細胞色素和底物載體的編碼基因)的表達顯著上調(diào)，表明在衰老的NP細胞中線粒體功能發(fā)生異常[39]。Chen等[40]研究了骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC)對 NP 細胞再生作用的影響，發(fā)現(xiàn)與BMSC共培養(yǎng)可降低NP細胞內(nèi)的ROS，并維持細胞線粒體膜電位和線粒體完整性，從而減輕壓力誘導的NP細胞線粒體損傷。由此可見，線粒體功能在IDD過程中發(fā)揮著重要作用，線粒體衍生的ROS加速了椎間盤細胞氧化應激誘導的早衰，進而導致IDD。因此，針對椎間盤細胞中線粒體功能障礙的機制研究有助于揭示椎間盤細胞衰老的潛在機制和IDD的發(fā)病機理。

3.4 端?？s短和DNA損傷

哺乳動物的端粒由重復DNA片段(TTAGGG)組成，長度為50～400個核苷酸[41]。由于DNA末端的不完全復制，在細胞復制過程中端粒長度逐漸縮短。有研究表明，隨著IDD的發(fā)展，端粒長度逐漸縮短，端粒酶活性逐漸降低，同時衰老信號通路(p53-p21-Rb和p16-pRb信號通路)激活，提示端?？s短在IDD發(fā)生發(fā)展過程中觸發(fā)了椎間盤細胞的復制性衰老[4]。Jeong等[42]從接受椎間盤手術的不同年齡(35歲、42歲、55歲、66歲和76歲)患者中提取并培養(yǎng)人NP細胞，發(fā)現(xiàn)隨著細胞的復制，不同年齡患者的NP細胞都表現(xiàn)出衰老特征，具體為SA-β-gal陽性細胞數(shù)量增加、端?？s短、端粒酶活性降低及p53-p21-pRb和p16-pRb通路激活。Wu等[43]用慢病毒載體將端粒酶逆轉錄酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)轉入衰老的人NP細胞中，發(fā)現(xiàn)隨著細胞的復制，端粒長度得以維持，端粒酶活性得到恢復，細胞衰老得到延緩，同時細胞增殖速率有所提高。以上研究結果表明，端粒長度的保持及端粒酶活性的維持在細胞復制性衰老中發(fā)揮重要的作用，而基于載體導入的基因治療可能是未來治療IDD的方向之一。

DNA損傷是指物理或化學因素引起的細胞內(nèi)DNA雙鏈的破壞，導致基因突變、染色體重排，嚴重者導致遺傳信息丟失、細胞周期停滯和凋亡等[44]。研究表明，端?？s短常引起細胞內(nèi)DNA損傷反應，而細胞損傷是細胞衰老的內(nèi)在觸發(fā)因素[4]。有研究報道，電離輻射通過導致細胞內(nèi)DNA損傷進而增加野生型小鼠NP組織中p16陽性細胞的數(shù)量[45]。Nasto等[46]將成年野生型和DNA修復基因Ercc1缺陷的小鼠暴露于電離輻射中，以誘導DNA損傷并研究其對椎間盤結構的影響，結果發(fā)現(xiàn)在Ercc1缺陷的小鼠椎間盤中，細胞衰老和凋亡均明顯增加。因此，各種因素導致的DNA損傷引起的椎間盤細胞衰老是介導IDD發(fā)生發(fā)展的重要因素之一。

3.5 營養(yǎng)剝奪

細胞營養(yǎng)的減少被認為是IDD的另一重要原因?，F(xiàn)有研究已經(jīng)證明，血清饑餓會抑制人工培養(yǎng)椎間盤細胞的增殖，并增加其衰老速率，而給予高濃度血清可增加NP細胞的增殖速率[47]。多種血清來源的生長因子可增強椎間盤細胞的增殖，包括胰島素樣生長因子(insulin like growth factor，IGF)、成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)、血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor，PDGF)和轉化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)等[48～50]。此外，由于椎間盤組織的無血管性，CEP對椎間盤營養(yǎng)供應至關重要，大多數(shù)營養(yǎng)物質(zhì)通過其擴散以滋養(yǎng)椎間盤細胞，從而維持椎間盤正常的結構和功能[51]。在CEP退化的病理過程中，CEP細胞的凋亡和鈣化阻斷了椎間盤的營養(yǎng)供應，從而加速了椎間盤細胞的衰老，最終導致IDD[4]。因此，椎間盤正常營養(yǎng)的供應對維持其正常功能十分重要，而CEP的變性可能是導致椎間盤細胞衰老的原因之一。

3.6 機械載荷異常

人類的脊柱承受多方向的機械載荷，包括軸向、徑向和圓周方向的壓縮、拉伸與剪切力，而機械載荷異常是IDD的危險因素之一[4]。研究表明，肥胖引起的脊柱機械負荷增加是IDD發(fā)生發(fā)展的危險因素，體重指數(shù)的增加改變了椎間盤的生物力學，最終導致椎間盤間隙的變窄和椎間盤細胞分解代謝的增強[52]。Feng等[53]發(fā)現(xiàn)NP細胞長時間暴露于周期性機械張力下可誘導其過早性衰老。Liang等[54]通過前肢截肢術誘導大鼠直立行走來模擬人類的直立姿勢，發(fā)現(xiàn)長時間的直立姿勢會導致NP組織膠原蛋白結構紊亂，AF出現(xiàn)裂隙和椎間盤高度降低，同時ECM分解增強。另外，長時間的直立姿勢上調(diào)了椎間盤細胞衰老相關基因(包括 p16、p27、p19ARF、p27KIP、RB、PTEN 和 RAGE)的表達。Ao等[55]基于實驗性小鼠的疏水性，將實驗組小鼠放置在含水深度約5 mm的空間內(nèi)以誘導其雙足站立姿勢(每天6 h)，而對照組正常飼養(yǎng)，10周后發(fā)現(xiàn)實驗組小鼠椎間盤退變程度明顯加重。以上研究表明，機械負荷異常導致椎間盤細胞的衰老，從而加速IDD的發(fā)展進程。

3.7 表觀遺傳學改變

表觀遺傳學是研究DNA序列不變的前提下，基因表達可遺傳的改變的一門遺傳學分支學科，其研究對象主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾和RNA編輯等，這些變化是通過環(huán)境與基因組的相互作用來調(diào)控基因的特異性表達，使其產(chǎn)生永久性改變，在疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[56]。Ikuno等[57]研究表明，在IDD晚期，DNA甲基化程度明顯加重。Yang等[58]報道，miR-143-5p在退變的NP細胞中高表達，并且在NP細胞中加入miR-143-5p特異性抑制劑后，細胞增殖增加，凋亡下降，且SA-β-gal染色陽性細胞數(shù)量顯著減少。遺憾的是，關于表觀遺傳學改變在IDD中的研究仍處于起步階段，具體機制仍需要大量的研究來證明。

4 結語和展望

綜上所述，在IDD發(fā)生發(fā)展過程中，細胞衰老是導致IDD進展的重要因素，而炎癥反應、氧化應激、線粒體功能障礙、端?？s短、DNA損傷、營養(yǎng)剝奪、機械負荷異常和表觀遺傳學改變是導致椎間盤細胞衰老的常見原因。因此，降低細胞衰老水平可以減輕椎間盤退變程度。然而，IDD是一個緩慢進展的過程，其具體機制仍不完全明確。目前，國內(nèi)外許多學者利用動物模型并在細胞水平進行相關實驗研究，均無法完全模擬人體內(nèi)IDD進程中椎間盤功能和結構的具體改變，這也使得現(xiàn)有的研究成果難以解釋其復雜的機制。此外，關于IDD的研究目前多集中在NP組織，而在AF和CEP層面的研究仍然很少，對于這方面的研究也是未來非常有前途的方向之一?？偟膩碇v，椎間盤細胞衰老研究的不斷深入和抗衰老策略的持續(xù)開發(fā)，必將為這種慢性疾病提供新的治療契機。