錢明明，譚政堂，王文著，李昶鎣，邱正良，郭志云*

(1.西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，中國四川成都610031；2.中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心，中國北京100071)

增強(qiáng)子(enhancer)是真核生物基因組中的一類順式作用元件，它通過組織特異性的方式招募轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor，TF)及其輔因子來正向調(diào)控基因表達(dá)。增強(qiáng)子作為一種非編碼序列，在組織中高度保守，增強(qiáng)子失活會導(dǎo)致包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生[1]。微RNA(microRNA，mi-RNA)是一種長約22個核苷酸的非編碼RNA，在大約60%的人類基因表達(dá)中起關(guān)鍵作用，有些miRNA可能通過調(diào)控癌基因表達(dá)而成為致癌miRNA[2]。先前研究表明增強(qiáng)子參與了miRNA的合成與調(diào)控，并可通過促進(jìn)Drosha/DGCR8募集和pri-miRNA加工來促進(jìn)細(xì)胞特異性miRNA的產(chǎn)生[3]。研究證明，基因周圍富集增強(qiáng)子的miRNA往往與癌癥預(yù)后不良相關(guān)[3]。

乳腺癌是女性中最常見的癌癥，約占所有癌癥的16%[4]。目前，增強(qiáng)子與miRNA在乳腺癌中形成何種調(diào)控網(wǎng)絡(luò)尚不清楚。為此，我們通過癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)數(shù)據(jù)庫[5]獲取了乳腺浸潤癌(breast invasive carcinoma，BRCA)相關(guān)miRNA-seq數(shù)據(jù)，識別了一系列在BRCA中由增強(qiáng)子調(diào)控的差異表達(dá)miRNAs，通過對這些miRNAs的靶基因進(jìn)行基因本體論(Gene Ontology，GO)和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)分析以及生存分析，找到了BRCA中關(guān)鍵的增強(qiáng)子-miRNA-靶基因調(diào)控關(guān)系，這些調(diào)控關(guān)系中的增強(qiáng)子、miRNA、基因有望作為乳腺癌潛在的生物標(biāo)志物，為乳腺癌遺傳機(jī)制研究提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

人類BRCA和正常組織的miRNA表達(dá)量數(shù)據(jù)(miRNA-seq)來源于在線數(shù)據(jù)庫TCGA(https://portal.gdc.cancer.gov/)。增強(qiáng)子位點數(shù)據(jù)(hg19)來源于Chen等[6]的研究。miRNA位點數(shù)據(jù)(hg19)來源于FANTOM5[7]。基因位點數(shù)據(jù)(hg19)來源于GENCODE[8]。

1.2 差異表達(dá)miRNA的識別

從112個BRCA樣本和104個正常組織樣本的miRNA-seq數(shù)據(jù)中，分別篩選在至少10%的癌癥/正常樣本中有表達(dá)量的miRNA為候選mi-RNA。以|log2FC|＞1(FC:fold change)和 P＜0.05(t檢驗)為閾值，篩選在癌癥中(相較于正常組織)顯著差異表達(dá)的miRNA。

1.3 增強(qiáng)子與miRNA相互作用的識別

參照先前關(guān)于增強(qiáng)子與miRNA調(diào)控關(guān)系的研究[3]，識別增強(qiáng)子與miRNA調(diào)控的公式如下:S=(EG-EM)/(EM+EG)，其中EG為增強(qiáng)子與其最近基因的距離，EM為增強(qiáng)子與其最近miRNA的距離。如果S＜0.2，則認(rèn)為增強(qiáng)子調(diào)控其最近的miRNA。

1.4 生存分析

利用TCGA中BRCA患者生存時間的數(shù)據(jù)，使用Survival包(R 3.6.0)分析與癌癥患者生存相關(guān)的miRNA。采用Kaplan-Meier生存曲線[9]分析miRNA表達(dá)水平與BRCA患者預(yù)后的相關(guān)性。利用GEPIA[10](http://gepia.cancer-pku.cn/detail.php)分析與BRCA患者生存相關(guān)的基因。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.5 miRNA靶基因的識別

利用miRWalk2.0[11](http://zmf.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk2/)的Validated Target Module，得到增強(qiáng)子調(diào)控的差異表達(dá)miRNA的靶基因。Validated Target Module用于分析已被前人研究證實的miRNA-靶基因調(diào)控關(guān)系。

1.6 miRNA靶基因的功能分析

為了理解關(guān)鍵miRNA靶基因的生物學(xué)機(jī)制，利用clusterProfiler包[12](R 3.6.0)對靶基因進(jìn)行GO和KEGG功能富集分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.7 癌癥驅(qū)動靶基因的識別及PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

從DriverDBv3[13]下載BRCA的驅(qū)動基因數(shù)據(jù)集。利用Python 3.7編程獲取miRNA靶基因與BRCA驅(qū)動基因的交集，交集里的基因被認(rèn)為是miRNA驅(qū)動靶基因。

使用STRING在線數(shù)據(jù)庫[14](https://string-db.org/)建立miRNA驅(qū)動靶基因的PPI網(wǎng)絡(luò)，以置信分?jǐn)?shù)＞0.4作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。生成的PPI網(wǎng)絡(luò)在Cytoscape軟件[15]中可視化。利用Cytoscape App cyto-Hubba計算網(wǎng)絡(luò)中各節(jié)點基因的得分。

2 結(jié)果與討論

2.1 BRCA中差異表達(dá)的miRNA

為了獲得在BRCA中增強(qiáng)子調(diào)控的差異表達(dá)miRNA，我們首先對BRCA中差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行了識別。通過分析BRCA miRNA-seq數(shù)據(jù)，共識別出322個顯著差異表達(dá)的miRNAs，其中包括227個上調(diào)miRNAs和95個下調(diào)miRNAs(|log2FC|＞1，P＜0.05)。上調(diào)倍數(shù)最大的 miRNA 是hsa-mir-105-1，其在BRCA中上調(diào)約67倍；下調(diào)幅度最大的miRNA是hsa-mir-486-1，其在BRCA中的表達(dá)量約為正常組織的1/26(圖1)。

圖1 差異表達(dá)的miRNAs紅色圓點代表在BRCA中上調(diào)的miRNAs，其中hsa-mir-105-1上調(diào)倍數(shù)最大，約67倍；紫色圓點代表在BRCA中下調(diào)的miRNAs，其中hsa-mir-486-1下調(diào)幅度最大，其在BRCA中的表達(dá)量約為正常組織的1/26；灰色圓點代表表達(dá)無顯著差異的miRNAs。Fig.1 Differentially expressed miRNAsRed dots represent the up-regulated miRNAs in invasive breast cancer.The most up-regulated miRNA is hsa-mir-105-1(～67 fold).Purple dots represent the down-regulated miRNAs.The most down-regulated miRNA is hsa-mir-486-1(～1/26 of the expression level in the normal tissue).Gray dots represent the miRNAs without significantly differential expression.

2.2 增強(qiáng)子-差異表達(dá)miRNA的調(diào)控關(guān)系

增強(qiáng)子的功能主要通過調(diào)控下游的基因(包括miRNA基因)來實現(xiàn)，因此增強(qiáng)子與腫瘤失調(diào)mi-RNA的調(diào)控關(guān)系可能在腫瘤中發(fā)揮重要作用。為此，根據(jù)先前關(guān)于增強(qiáng)子與miRNA調(diào)控關(guān)系的研究(見方法)，在1 170個BRCA增強(qiáng)子和322個差異表達(dá)miRNAs中識別了220對增強(qiáng)子-差異表達(dá)miRNA調(diào)控關(guān)系，涉及220個增強(qiáng)子和56個差異表達(dá)miRNAs，平均1個miRNA受到4個增強(qiáng)子的調(diào)控。通過對56個受增強(qiáng)子調(diào)控的差異表達(dá)miRNAs進(jìn)行生存分析，發(fā)現(xiàn)其中6個miRNAs的表達(dá)水平顯著與BRCA患者生存相關(guān)(P＜0.05，圖2)。除了hsa-mir-195下調(diào)(2.90倍)外，其余5個 miRNAs:hsa-mir-671(2.17 倍)、hsa-mir-3619(5.80 倍)、hsa-mir-4664(11.05 倍)、hsa-mir-5003(2.71 倍)、hsa-mir-5691(3.47 倍)在 BRCA 中均上調(diào)(P＜0.05)。其中，miR-195、miR-671、miR-3619和miR-5003已經(jīng)被證實與乳腺癌高度相關(guān)。miR-195通過調(diào)節(jié)乳腺癌中胰島素受體底物1(insulin receptor substrate 1，IRS1)的水平，抑制腫瘤生長和血管生成[16]。在福爾馬林固定石蠟包埋(formalinfixed paraffin-embedded，F(xiàn)FPE)的乳腺癌組織中，研究人員發(fā)現(xiàn)miR-671與其化學(xué)耐藥性相關(guān)，并認(rèn)為miR-671可作為化學(xué)療法中的有效靶標(biāo)以及乳腺癌的潛在生物標(biāo)志物[17]。miR-3619在MCF-7乳腺癌細(xì)胞中的高表達(dá)可以阻礙磷脂酶D2(phospholipase D2，PLD2)的翻譯，發(fā)揮腫瘤抑制作用[18]。已知腫瘤抑制因子miR-34也在一些癌癥中上調(diào)，包括腎細(xì)胞癌、結(jié)腸癌和肝細(xì)胞癌，但其中的機(jī)制有待進(jìn)一步研究[19]，miR-3619的情況可能與之類似。研究表明，在轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞中，如果miR-5003-3p受到抑制，那么癌細(xì)胞的遷移和侵襲也可能受到抑制[20]。因此，這6個miRNAs被識別為增強(qiáng)子-miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵miRNAs。

圖2 受增強(qiáng)子調(diào)控的6個差異表達(dá)miRNAs的生存分析Fig.2 Survival analysis of the six differentially expressed miRNAs regulated by enhancers

2.3 關(guān)鍵miRNA的靶基因識別與功能富集分析

miRNA的功能主要是通過結(jié)合下游靶基因的mRNA來實現(xiàn)。為此，我們通過miRWalk分析了這6個受增強(qiáng)子調(diào)控的關(guān)鍵miRNAs(hsa-mir-195、hsa-mir-671、hsa-mir-3619、hsa-mir-4664、hsa-mir-5003、hsa-mir-5691)的靶基因，共識別了1 172個實驗證實的靶基因。GO分析的結(jié)果表明，miRNAs的靶基因顯著富集在Wnt途徑(圖3A)。Wnt途徑是腫瘤關(guān)鍵信號通路，通常可介導(dǎo)和調(diào)節(jié)一系列生物進(jìn)程，包括增殖、遷移、黏附和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)等，在許多人類癌癥中均異常激活，對于腫瘤的發(fā)生、生長和轉(zhuǎn)移非常重要[21]。KEGG富集分析的結(jié)果表明，miRNAs靶基因參與的通路最顯著富集在PI3K-Akt信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、癌癥中的蛋白多糖(proteoglycans in cancer)、乳腺癌(breast cancer)(圖 3B)。其中，PI3K-Akt信號通路與線粒體介導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞凋亡有關(guān)[22]。這些結(jié)果進(jìn)一步說明，篩選出的這6個關(guān)鍵mi-RNAs與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展高度相關(guān)。

圖3 6個miRNAs的靶基因功能富集分析(A)6個miRNAs靶基因的GO分析結(jié)果；(B)6個miRNAs靶基因的KEGG分析結(jié)果。Fig.3 Functional enrichment analysis of target genes of the six miRNAs(A)The GO analysis result；(B)The KEGG analysis result.

2.4 增強(qiáng)子調(diào)控miRNAs驅(qū)動靶基因識別及PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

為了進(jìn)一步分析6個miRNAs的靶基因在BRCA中的潛在臨床作用，我們對這些靶基因進(jìn)行了癌癥驅(qū)動基因分析。首先，通過搜索癌癥驅(qū)動基因數(shù)據(jù)庫DriverDBv3，獲取了BRCA驅(qū)動靶基因；為了進(jìn)一步識別驅(qū)動靶基因中的關(guān)鍵基因，通過STRING獲取了驅(qū)動靶基因所對應(yīng)蛋白質(zhì)產(chǎn)物的PPI調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；最后，根據(jù)Cytoscape App cytoHubba計算，識別了排名前20%的網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵節(jié)點:TP53(tumor protein P53)、CCND1(cyclin D1)、KRAS(KRAS proto-oncogene，GTPase)、CDKN1A(cyclin dependent kinase inhibitor 1A)、RPS6KB1(ribosomal protein S6 kinase B1)和CCNE2(cyclin E2)(圖4A)。這6個節(jié)點的基因已被證明與乳腺癌高度相關(guān)。研究表明，所有BRCA1缺陷型乳腺癌都含有TP53基因突變，這表明TP53與乳腺癌發(fā)展密切相關(guān)[23]。CCND1是細(xì)胞周期蛋白D家族的成員，研究顯示CCND1基因的擴(kuò)增導(dǎo)致乳腺癌預(yù)后較差[24]。在乳腺癌細(xì)胞中，KRAS/MAPK信號通路的激活可以調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、遷移和侵襲[25]。CDKN1A是RUSC1-AS1的靶基因，是參與RUSC1-AS1介導(dǎo)的乳腺癌進(jìn)展的腫瘤抑制基因[26]。相關(guān)研究報道，RPS6KB1基因的表達(dá)降低可能與絕經(jīng)前肥胖婦女乳腺癌風(fēng)險降低有關(guān)[27]。另外，細(xì)胞周期蛋白E2(CCNE2)通過促進(jìn)Hippo通路下游介質(zhì)YAP的核定位和活性來調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞的運動性和侵襲性[28]。進(jìn)一步的生存分析顯示，在這6個網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵節(jié)點中TP53、CCNE2的基因表達(dá)水平與BRCA患者生存時間顯著相關(guān)(P＜0.05，圖4B)。這表明在6個網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵性節(jié)點中，相較于其他節(jié)點，TP53和CCNE2可能在乳腺癌下游調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中具有更重要的作用，因此TP53、CCNE2基因被進(jìn)一步識別為增強(qiáng)子-miRNA調(diào)控的關(guān)鍵驅(qū)動靶基因(圖4A)。以上結(jié)果表明，增強(qiáng)子-mi-RNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可能通過關(guān)鍵miRNAs靶向重要的癌癥驅(qū)動基因，從而在癌癥中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

圖4 驅(qū)動靶基因蛋白質(zhì)產(chǎn)物的PPI網(wǎng)絡(luò)及TP53和CCNE2的生存分析(A)驅(qū)動靶基因蛋白質(zhì)產(chǎn)物參與的PPI網(wǎng)絡(luò)及增強(qiáng)子-miRNA-關(guān)鍵驅(qū)動靶基因調(diào)控關(guān)系。橢圓表示PPI網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點，節(jié)點紅色越深，其在網(wǎng)絡(luò)中的重要性越大，菱形表示調(diào)控相應(yīng)基因的miRNA，長方形表示調(diào)控miRNA的增強(qiáng)子；(B)TP53、CCNE2基因在BRCA中的生存分析。Fig.4 PPI network of driver target genes and survival analysis of TP53 and CCNE2(A)The PPI network of the protein product of driver target genes and the regulatory relationship of enhancer-miRNA-key driver target gene.The ellipses represent the nodes.The redder the node，the greater its importance in the network.The diamonds represent the miRNAs that regulate the genes.The rectangles represent the enhancers that regulate miRNAs；(B)Survival analysis of TP53 and CCNE2 in invasive breast cancer.

3 結(jié)論

本研究通過差異表達(dá)分析，識別了在BRCA中受增強(qiáng)子調(diào)控的322個差異表達(dá)miRNAs，其中227個顯著上調(diào)，95個顯著下調(diào)。為了探究乳腺癌增強(qiáng)子與差異表達(dá)miRNA的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，識別了220對增強(qiáng)子-差異表達(dá)miRNA調(diào)控關(guān)系，包括220個增強(qiáng)子和56個差異表達(dá)miRNAs，其中6 個 miRNAs(hsa-mir-195、hsa-mir-671、hsa-mir-3619、hsa-mir-4664、hsa-mir-5003、hsa-mir-5691)的表達(dá)水平顯著與BRCA患者生存相關(guān)。對6個miRNAs的靶基因進(jìn)行GO/KEGG功能富集分析，結(jié)果顯示其顯著富集在癌癥相關(guān)通路上，暗示這6個miRNAs可能通過調(diào)控關(guān)鍵靶基因參與癌癥相關(guān)通路。因此，我們進(jìn)一步對6個miRNAs靶基因進(jìn)行了癌癥驅(qū)動基因與PPI網(wǎng)絡(luò)分析，共識別了6個網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵基因，生存分析表明其中的TP53、CCNE2基因顯著與BRCA患者生存相關(guān)。綜上所述，通過差異表達(dá)分析與增強(qiáng)子-miRNA調(diào)控關(guān)系識別，本文構(gòu)建了BRCA中增強(qiáng)子-miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，同時通過進(jìn)一步分析網(wǎng)絡(luò)中6個重要miRNAs的關(guān)鍵靶基因，獲得了可能在BRCA中有重要作用的增強(qiáng)子-miRNA-基因調(diào)控關(guān)系，即增強(qiáng)子chr17:6 925 152～6 925 653可能通過調(diào)控hsa-mir-195影響CCNE2基因；hsa-mir-5003可能受到5個增強(qiáng)子調(diào)控，從而影響其靶向的TP53基因。這些結(jié)果為進(jìn)一步探究乳腺癌中增強(qiáng)子-miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)與癌癥的關(guān)聯(lián)提供了理論和方法參考。