施慧嬡 陳發(fā)菊 梁宏偉 王玉兵

（三峽區(qū)域植物遺傳與種質創(chuàng)新重點實驗室/三峽大學生物技術研究中心，宜昌 443002）

瑤山苣苔（Dayaoshania cotinifolia）為苦苣苔科（Gesneriaceae）瑤山苣苔屬（Dayaoshania）多年生草本植物，僅分布于廣西大瑤山局部地區(qū)［1］，因其僅有一個分布點，個體數量稀少，分布面積狹窄，且受人類活動的影響而處于瀕危狀態(tài)。在1999 年國務院頒布的《國家重點保護植物名錄》（第一批）中被列為國家Ⅰ級保護植物；在2012 年原國家林業(yè)局頒布的《全國極小種群野生植物拯救保護實施方案（2010～2015）》中，瑤山苣苔被列為優(yōu)先拯救保護的極小種群植物；在2013 年原環(huán)境保護部和中國科學院發(fā)布的《中國生物多樣性紅色名錄——高等植物卷》中被評估為極危種（CR）（http：//www.mee.gov.cn/gkml/hbb/bgg/201309/t20130912_260061.htm）。目前，瑤山苣苔的生物學研究主要集中于開花生物學［2］、形態(tài)解剖學［3］、種群生態(tài)學［4～6］、組織培養(yǎng)［7～8］和保護遺傳學［9］等方面，而與瑤山苣苔生殖生物學相關研究未見報導。本文利用常規(guī)石蠟切片法對瑤山苣苔的大小孢子和雌雄配子體發(fā)育進行研究，探討其在該發(fā)育過程中是否存在致瀕環(huán)節(jié)，其結果也可為瑤山苣苔及苦苣苔科植物的生殖生物學研究積累基礎資料。

1 材料和方法

瑤山苣苔實驗材料于2009 年5 月至2010 年7月采自廣西壯族自治區(qū)金秀老山自然保護區(qū)。將不同發(fā)育時期的瑤山苣苔花芽和受精后的雌蕊材料于FAA 固定液（70%Ethyl alcohol 90ml：Acetic acid 5mL：Formalin 5mL）中固定24 h 后，帶回實驗室，分離出雌蕊和雄蕊并分別放入裝有70%酒精溶液的小瓶中，置于4℃冰箱備用。采用常規(guī)石蠟切片法［10］，Laica RM切片機連續(xù)切片，切片厚度8 μm；采用番紅—固綠（Safranin-Fast Green）對染法進行染色，脫水透明封片；用Nikon 80i顯微鏡觀察與拍照。

2 結果與分析

2.1 花藥壁的發(fā)育

瑤山苣苔一朵花中常具2枚雄蕊，雄蕊由花絲和花藥組成，花藥背著，每個花藥具4個花粉囊（見圖版Ⅰ：A）。早期花藥為四棱形的花藥原始體，花藥原始體中部的細胞發(fā)育成藥隔和維管束，隨著花藥原始體不斷發(fā)育，其四個角隅處表皮下出現細胞核大、細胞質濃的孢原細胞。孢原細胞經過平周分裂，向外形成初生周緣細胞，向內產生初生造孢細胞。初生周緣細胞進行平周和垂周分裂形成4～5 層細胞的花藥壁細胞；初生造孢細胞分裂形成次生造孢細胞，次生造孢細胞具有較大且明顯的核，細胞質濃厚，染色較深，排列緊密整齊（見圖版Ⅰ：B）。隨著次生造孢細胞的進一步發(fā)育，花藥壁細胞出現分化，當小孢子母細胞形成時，花藥壁由外到內依次發(fā)育為表皮、藥室內壁、中層和絨氈層（見圖版Ⅰ：C）。在小孢子形成雄配子體的過程中，表皮下藥室內壁細胞體積增大，徑向延長，其細胞壁逐漸特化，發(fā)生帶狀纖維加厚，僅在相鄰兩個花粉囊連接處的細胞壁不加厚；在小孢子母細胞減數分裂時，中層細胞的儲藏物逐漸減少，并在小孢子形成過程中逐漸解體被吸收，直至消失；花藥壁最內層細胞體積明顯增大，區(qū)別于其他花藥壁層。絨氈層細胞初期為單核，細胞核大，呈多邊形，細胞質濃厚，小孢子母細胞減數分裂之前，絨氈層細胞體積迅速擴大，并伴隨液泡化?，幧杰奶?月份花芽分化開始細胞內容物迅速增加，此時絨氈層細胞發(fā)達，細胞質濃厚，排列整齊（見圖版Ⅰ：D）；在小孢子進一步發(fā)育形成雄配子體的過程中，絨氈層不斷解體，為小孢子的發(fā)育提供充足的營養(yǎng)（見圖版Ⅰ：G），當花粉粒成熟時，絨氈層消失（見圖版Ⅰ：H）。

2.2 小孢子發(fā)生及雄配子體形成

花發(fā)育到9月份，花藥壁內的孢原細胞分化出初生造孢細胞，再經過數次有絲分裂，產生次生造孢細胞。次生造孢細胞繼續(xù)發(fā)育，體積增大，細胞質濃厚；到9月初次生造孢細胞發(fā)育成多面形的小孢子母細胞（即花粉母細胞）（見圖版Ⅰ：C）。隨即小孢子母細胞進入減數分裂期，經第一次減數分裂形成兩個子核，隨即進入第二次減數分裂形成四個子核，此過程是連續(xù)型胞質分裂，而不伴隨細胞板的形成；隨后四分體小孢子逐漸形成自己的細胞壁，并包被在共同的胼胝質壁中，呈品字形（見圖版Ⅰ：E）。剛釋放出來的小孢子細胞形狀不規(guī)則，伴隨小孢子體積縱向擴展和細胞壁增厚，細胞質和細胞核在細胞的一側，此時的小孢子細胞多呈腎形，長橢圓形，半球形（見圖版Ⅰ：F）。隨著小孢子體積的進一步增大，小孢子細胞質迅速液泡化形成大液泡，核大而胞質少，這時絨氈層細胞已經開始解體，把營養(yǎng)提供給小孢子以繼續(xù)發(fā)育成熟，隨著小孢子的發(fā)育，細胞質增多，小孢子細胞核移到細胞的一側（見圖版Ⅰ：G），形成單核靠邊期小孢子。隨后小孢子細胞中的液泡逐漸變小直至消失，核分裂形成一個大的生殖核和一個小的營養(yǎng)核，隨后發(fā)生胞質分裂，生殖核游離在營養(yǎng)細胞的細胞質中，發(fā)育形成成熟花粉粒即雄配子體（見圖版Ⅰ：H～I）。

雄配子體在同一花藥室內發(fā)育時期基本同步，但同一花中不同花藥的發(fā)育不同步。同時可以觀察到瑤山苣苔花粉有極少部分敗育現象，圓球形染色較深的為可育花粉；少量花粉皺縮，呈不規(guī)則的圓錐形或圓餅形，為敗育花粉。

2.3 胚珠的發(fā)生與結構

瑤山苣苔的雌蕊由兩個心皮組成，從子房橫切面看，2 個心皮分別向近軸面（腹面）卷曲，與邊緣的遠軸面（背面）相連，并向子房室中部內伸，膨大分叉，內伸胎座膜上具有角質層，形成介于典型的側膜胎座與典型的中央胎座之間的中間類型，子房1 室，多胚珠（見圖版Ⅱ：A～B）。胚珠發(fā)生時在子房室特化的側膜胎座處表皮下產生一團分生細胞即胚珠原基（見圖版Ⅱ：D）；在大孢子時期，胚珠原基基部兩側表皮下的細胞分裂，向上生長，包住珠心，成為具2～3層細胞的單層珠被，其頂端留有珠孔，大孢子母細胞只被一層珠心組織所包圍。珠被在發(fā)育過程中，圍繞胚囊合點端至2/3胚囊處產生珠被絨氈層，胚囊成熟時，珠被及珠被絨氈層將胚囊包圍。由于珠被和珠柄以及其他部分的不對稱生長，使胚珠的珠孔一端逐漸向下方彎曲，成熟時胚珠為倒生型、單珠被、薄珠心（見圖版Ⅱ：C）。

2.4 大孢子的發(fā)生發(fā)育及雌配子體的形成

胚珠發(fā)育初期，在靠近珠孔端表皮層下分化出細胞質濃厚、細胞核顯著的大型細胞，即孢原細胞（見圖版Ⅱ：D）。孢原細胞分裂形成周緣細胞和造孢細胞，周緣細胞進行平周和垂周分裂增加珠心組織，造孢細胞直接發(fā)育為大孢子母細胞，其細胞體積大，細胞質濃厚，具顯著的細胞核，核仁明顯，與周圍珠心組織細胞有明顯差異，包被在薄地珠心組織中（見圖版Ⅱ：E）。隨著胚珠的發(fā)育，珠被發(fā)育完全，胚珠倒生，大孢子母細胞進行減數分裂，合點端的1 個大孢子細胞明顯增大，繼續(xù)發(fā)育成為功能大孢子，位于珠孔端的其余3個大孢子不發(fā)育，很快退化（見圖版Ⅱ：F）。功能大孢子沿珠孔—合點軸縱向伸長，體積增大并液泡化，形成單核胚囊（見圖版Ⅱ：G）。經過1次有絲分裂，形成2個游離核，分別移到胚囊兩極，形成2核胚囊（見圖版Ⅱ：H），胚囊中出現多個液泡，2 核分別在珠孔端和合點端再分裂，形成4 核胚囊，隨后再分裂一次，形成8 核胚囊（見圖版Ⅱ：I～L）。8 個核位于共同的細胞質中，珠孔端和合點端各有4 個核，隨后兩端各有1個核向胚囊中央移動，融合形成二倍體的中央細胞，位于胚囊中央（見圖版Ⅱ：J～K）。珠孔端的3個核分化形成1個卵細胞和2個助細胞的卵器，卵器包被濃厚的胚囊物質（見圖版Ⅱ：J），合點端其余3個核分化出細胞壁，反足細胞成品字排列（見圖版Ⅱ：L），形成成熟胚囊即雌配子體。

瑤山苣苔為胚珠倒生，單珠被，薄珠心，具有珠被絨氈層。雌配子體是由1 個功能大孢子發(fā)育而來，形成7 孢8 核胚囊，這種胚囊發(fā)育方式被稱為單孢子—蓼型胚囊，這一發(fā)育特點屬于原始發(fā)育類型。

2.5 胚和胚乳的發(fā)育

瑤山苣苔成熟胚囊發(fā)生雙受精以后，受精極核（見圖Ⅲ：A）的分裂早于合子，隨著初生胚乳核的分裂，將胚囊分割成大小不等的2 個腔，大的靠近珠孔端，小的靠近合點端，并分別由此發(fā)育出珠孔吸器和合點吸器（見圖Ⅲ：B）。合點吸器在胚乳發(fā)育早期將位于珠被最外層和珠被絨氈層之間的珠被細胞逐漸吸收解體，形成較大的空腔；而此時的珠孔吸器內的核未分裂，細胞質濃厚，染色較深。當受精卵發(fā)育成4細胞原胚時，吸器內的細胞高度液泡化，向外伸展，形成外珠孔，并逐步將包圍在珠孔端的珠被細胞吸收解體，珠孔吸器在隨后胚的發(fā)育過程中殘存較長時間。

位于珠孔吸器與合點吸器間的胚乳核經兩次橫分裂形成直線排列的4 核胚乳（見圖Ⅲ：B），隨即形成細胞壁，胚乳細胞在隨后的分裂過程中均伴隨細胞壁的分化，瑤山苣苔的胚乳發(fā)育為細胞型（見圖Ⅲ：C），在胚的發(fā)育過程中，胚乳被胚吸收耗盡（見圖Ⅲ：F）。

瑤山苣苔的卵細胞受精以后，經過短暫休眠從珠孔伸入早期胚乳核游離的腔中（見圖Ⅲ：D）。隨著胚乳的發(fā)育，休眠合子經1 次橫向分裂，形成一個頂細胞和一個基細胞。頂細胞再進行2 次縱向分裂形成4 細胞原胚，隨后經1 次橫分裂形成8細胞原胚（見圖Ⅲ：E），再經幾次分裂形成多細胞球胚，至此不再分裂直到果實成熟；基細胞經幾次橫分裂形成胚柄，瑤山苣苔的胚柄在胚的發(fā)育過程中并不解體。隨著胚和胚乳的發(fā)育，珠被外表皮呈瓦片狀增厚，發(fā)育成為外種皮，珠被絨氈層細胞壁增厚發(fā)育為內種皮。

3 討論

植物生殖生物學的性狀因受外部環(huán)境因素的影響較少而具有相對的遺傳穩(wěn)定性，是系統(tǒng)學及分類學研究的重要內容，特別在進行屬以上的系統(tǒng)發(fā)育研究時具有重要的意義［11］?，幧杰奶ε咧榈股?、單珠被、薄珠心，具有珠被絨氈層，胚囊為單孢子發(fā)生類型，屬典型的蓼型胚囊發(fā)育方式，這些發(fā)育特征與苦苣苔科其他植物胚胎的發(fā)育方式基本相似［12～18］，表明瑤山苣苔與其他苦苣苔科各屬種之間系統(tǒng)發(fā)育上具有一致性，這一研究結果也為苦苣苔科植物的胚囊發(fā)育的類型確定提供了新的佐證資料。

本研究表明，瑤山苣苔即具有一些較為原始的胚胎學特征，如倒生胚珠、二核花粉粒、單孢子胚囊的蓼形胚囊等［16，19］；同時，瑤山苣苔也具有較為進化的胚胎學特征，如絨氈層為較進化的腺質絨氈層和單珠被，表明瑤山苣苔的胚胎學特征具有過渡特征。王文采認為瑤山苣苔的雄蕊著生于花冠近基部處，花藥二室平行，不開叉，是苦苣苔科較為原始的屬種［1］。由于苦苣苔科植物的胚胎學信息較少，本研究雖不能確定瑤山苣苔的系統(tǒng)位置，但可以推測瑤山苣苔是苦苣苔科系統(tǒng)進化中是由原始向進化的一種過渡植物類群。

植物的有性生殖成功與否對物種的延續(xù)和種群的拓展起決定性作用，而與植物有性生殖相關的過程包括花器官的分化、雌雄配子的形成、傳粉受精、胚胎發(fā)育以及種子的形成等，這些生殖過程中的任何一個環(huán)節(jié)出現異?，F象，都將不同程度地導致生殖失敗，進而可能引起植物瀕危［20］。瑤山苣苔在雌雄配子體發(fā)育及胚胎發(fā)育過程的細胞學觀察，發(fā)現有少量花粉敗育現象，但其花粉量大，絕大部分均為發(fā)育成熟，少量的花粉敗育對其生殖成功影響不大；雌配子體形成過程中也未見異常的現象，表明雌配子體形成在瑤山苣苔的胚胎發(fā)育過程中可以正常發(fā)育，不是導致其瀕危的原因。

瑤山苣苔在果實發(fā)育成熟時，胚僅發(fā)育至球形胚時期，需要經過一定時間的休眠才能完成形態(tài)后熟；而瑤山苣苔果實成熟已是深秋，自然條件下，要經過一個相對干旱寒冷的冬季，可能影響種子胚的形態(tài)后熟，從而導致種子萌發(fā)率降低。在野外調查中發(fā)現，在瑤山苣苔群落較大的種群附近，很少見到瑤山苣苔的幼苗，這很可能是造成瑤山苣苔瀕危的主要內在原因。