張 東 劉 艷 張 晗 張子健 王 洋 劉美岑

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院，呼和浩特 010011；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)內(nèi)蒙古野生特有蔬菜種質(zhì)資源與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010011）

植物一生固著于地面，因而更易遭受生物和非生物逆境脅迫。在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中，植物從形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理生化等諸多方面演化形成一套完整的適應(yīng)機(jī)制以抵御逆境脅迫。葉片作為地上部感知外界環(huán)境最敏感器官，其形態(tài)結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出與環(huán)境之間良好的適應(yīng)協(xié)同性，如葉片表面蠟質(zhì)可以抵御病原微生物和蟲害以及其他生物脅迫和非生物脅迫［1～2］，表皮腺體分泌物對(duì)生物脅迫和非生物脅迫［3］，角質(zhì)膜調(diào)節(jié)非氣孔性蒸騰與體表溫度［4］和防御病蟲害叮咬［5～6］等。氣孔是植物葉片特有的結(jié)構(gòu)，在調(diào)節(jié)植物與環(huán)境之間氣體交換、水分?jǐn)U散中發(fā)揮重要作用。

干旱脅迫下植物葉片常通過(guò)調(diào)節(jié)氣孔導(dǎo)度，增加氣孔阻力以減少水分喪失。此外氣孔密度、氣孔大小和氣孔形態(tài)結(jié)構(gòu)等也與植物抗旱性密切相關(guān)［7］。腺毛（腺體）是陸生植物地上部分表面廣泛分布的特殊結(jié)構(gòu)，它們具有合成、貯存和分泌次生代謝產(chǎn)物以及反射強(qiáng)光降低葉溫、減少蒸騰等功能，在植物防御外界生物和非生物脅迫中起著重要作用。因此，了解葉片氣孔、腺體等結(jié)構(gòu)特征以及對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)是闡明植物抗逆機(jī)理的重要內(nèi)容。甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）是豆科（Leguminosae）甘草屬（Glycyrrhiza）多年生草本植物［8］，多生長(zhǎng)在干旱、半干旱荒漠草原、沙漠邊緣和黃土丘陵地帶。其根系發(fā)達(dá)，抗性強(qiáng)，是荒漠半荒漠地區(qū)改良土壤、保持水土、防風(fēng)固沙的重要植物。目前，關(guān)于甘草抗旱性研究多集中在植株抗氧化系統(tǒng)［9～11］、種子萌發(fā)特性［12］、次生代謝［13～14］等方面，對(duì)干旱脅迫下甘草葉片形態(tài)結(jié)構(gòu)研究較少。本試驗(yàn)采用盆栽控水模擬土壤干旱的方法，研究不同干旱脅迫程度對(duì)甘草幼苗葉片表面結(jié)構(gòu)特征和光合作用的影響，旨在了解葉片表面結(jié)構(gòu)對(duì)干旱逆境的響應(yīng)特征，為闡明甘草抗旱機(jī)理提供重要的形態(tài)學(xué)和生理學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料及處理

試驗(yàn)于2018 年3 月至9 月在內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)踐教學(xué)基地進(jìn)行。甘草種子由內(nèi)蒙古天創(chuàng)藥業(yè)科技股份有限公司提供。挑選充實(shí)飽滿的甘草種子，濃硫酸浸種后人工催芽，將均勻露白的甘草種子點(diǎn)播于花盆（高20 cm、直徑為22 cm）中，盆土以細(xì)沙和營(yíng)養(yǎng)土5∶3 組成（V/V），每盆填充7 kg，出苗后正常管理。待幼苗長(zhǎng)至4～5 片真葉時(shí)間苗，每盆保留生長(zhǎng)一致、健壯苗20 株，生長(zhǎng)2 個(gè)月后開始處理。試驗(yàn)共設(shè)4 個(gè)處理，即正常供水對(duì)照（CK）、輕度干旱脅迫（light stress，LS）、中度干旱脅迫（moderate stress，MS）、重 度 干 旱 脅 迫（severe stress，SS），每處理8盆。4個(gè)處理的土壤相對(duì)含水量（SRWC）分別為75%±3.0%、65%±1.6%、50%±1.9%、35%±2.5%。自然干旱至不同處理水平，稱重控制土壤水分含量，并于每天18：00左右補(bǔ)充水分來(lái)保持不同干旱脅迫水平。10 d 后，不同處理植株受害程度出現(xiàn)明顯差異時(shí)結(jié)束處理，取樣并測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。

1.2 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.2.1 土壤含水量測(cè)定

采用鮑士旦［15］的方法。

1.2.2 光合指標(biāo)測(cè)定

采用CIRAS-3 便攜式光合儀（購(gòu)自漢莎科學(xué)儀器有限公司）測(cè)定。每個(gè)處理隨機(jī)選取10 片植株中部成熟葉片，測(cè)定其凈光合速率（Pn）、胞間CO2濃度（Ci）、氣孔導(dǎo)度（Gs）、蒸騰速率（Tr）。

1.2.3 葉片掃描電鏡觀測(cè)

參照李柏年等［16］方法略有改動(dòng)。取每個(gè)處理甘草植株頂端新葉、中部成熟葉和基部衰老葉，避開主脈，用刀片分別切取8 mm×5 mm的葉肉組織，2.5%戊二醛固定2 h，抽氣下沉，不同濃度乙醇梯度脫水，臨界點(diǎn)干燥及噴金處理，掃描電鏡觀察并照相。每個(gè)處理選取10個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)氣孔密度、氣孔開張比并測(cè)量氣孔開張度。氣孔開張度為每個(gè)視野隨機(jī)選取10 個(gè)開張氣孔，測(cè)量氣孔孔徑寬度并計(jì)算平均值；氣孔開張比為每個(gè)視野中開張的氣孔數(shù)占總氣孔數(shù)的百分比。

1.3 數(shù)據(jù)處理分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2013 整理，SPSS 21.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析，Sigma Plot軟件作圖。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 干旱脅迫對(duì)甘草葉片形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

利用掃描電鏡分別觀測(cè)不同干旱脅迫程度下、不同發(fā)育狀態(tài)（頂端新葉、中部成熟葉、基部衰老葉）甘草葉片形態(tài)結(jié)構(gòu)。在葉上下表面均觀察到氣孔、腺毛和具分泌功能的腺體結(jié)構(gòu)。且上述結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出不同葉部位、不同發(fā)育程度和不同干旱脅迫程度的差異性（見圖版Ⅰ）。

2.1.1 氣孔結(jié)構(gòu)

葉片上下表皮均觀察到有大量氣孔結(jié)構(gòu)存在（見圖版Ⅰ：A～B），氣孔有開張、微開張和閉合；有與葉表面相平或突出葉表面等不同形態(tài)（見圖版Ⅰ：C～F）。且氣孔形態(tài)、密度等在上下表皮間、葉片不同發(fā)育程度間、干旱脅迫處理間有顯著差異。如表1所示，不同干旱脅迫處理下，無(wú)論是新葉、成熟葉還是衰老葉，葉片下表皮氣孔密度均顯著高于上表皮，下表皮氣孔密度均值為196.0 個(gè)·mm-2，上表皮氣孔密度僅為67.2 個(gè)·mm-2。正常供水條件下，成熟葉下表皮氣孔密度最高，為260個(gè)·mm-2，其次為新葉216.7 個(gè)·mm-2，衰老葉最低，為167.3 個(gè)·mm-2；不同發(fā)育程度葉片上表皮氣孔密度差異不大，均值為74.3 個(gè)·mm-2。干旱脅迫下，葉片上下表皮氣孔總量（密度）總體均表現(xiàn)出較對(duì)照顯著下降的變化趨勢(shì)。其中，新葉在中度、重度脅迫下氣孔密度較對(duì)照顯著下降；成熟葉和衰老葉在輕度脅迫下氣孔密度即較對(duì)照顯著下降，且隨著脅迫程度加深，氣孔密度較對(duì)照下降幅度增加。

氣孔開放程度是影響葉片內(nèi)外氣體交換和水分蒸騰的重要因素，氣孔開張比和開張度是衡量氣孔開放程度的2 個(gè)重要指標(biāo)。如表1 所示，無(wú)論是正常供水的對(duì)照，還是干旱脅迫處理，植株新葉、成熟葉、衰老葉氣孔開張比均表現(xiàn)為上表皮大于下表皮的特征。正常供水條件下，成熟葉氣孔開張比最高，新葉和衰老葉相當(dāng)，略低于成熟葉；隨著干旱脅迫程度的加劇，3種類型葉片氣孔開張比呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，即輕度脅迫下氣孔開張比較對(duì)照有所上升，中度和重度脅迫下，氣孔開張比較對(duì)照下降。

葉片上下表皮氣孔開張度總體均值無(wú)顯著差異，分別為1.19 和1.10 μm。正常供水條件下，氣孔開張度表現(xiàn)為成熟葉＞新葉＞老葉；隨著干旱脅迫程度加劇，氣孔開張度同氣孔開張比變化趨勢(shì)基本一致，呈先升高后降低的變化趨勢(shì)。

2.1.2 泌腺結(jié)構(gòu)

掃描電鏡觀察到甘草葉片上下表皮均具分泌功能的腺體結(jié)構(gòu)（見圖版Ⅰ：G～H）。其分泌物在電鏡下呈白色透明結(jié)晶狀；分泌物在葉表面堆積，呈圓盤狀高出于葉表面，圓盤直徑約為50 μm；正常供水或輕度干旱脅迫下泌腺及其分泌物多呈光滑圓盤狀（見圖版Ⅰ：I），隨著干旱脅迫程度加劇，中度和重度脅迫下腺體及分泌物有的出現(xiàn)周邊皺褶，中間凹陷（見圖版Ⅰ：J），有的呈中間分泌物聚積、破損（見圖版Ⅰ：K）。泌腺在葉片上下表皮分布數(shù)量不均，在下表皮分布數(shù)量大于上表皮。正常供水條件下，新葉和成熟葉泌腺數(shù)量相當(dāng)，上下表皮總量分別為7.26 和7.63 個(gè)·mm-2，衰老葉僅為5.08 個(gè)·mm-2，顯著低于新葉和成熟葉；干旱脅迫下，3種類型葉片泌腺數(shù)量均較對(duì)照有所增加。其中，輕度脅迫下，新葉和成熟葉泌腺數(shù)量即較對(duì)照顯著增加，并一直維持較高水平至中度和重度脅迫；衰老葉則在重度脅迫下泌腺數(shù)量迅速增加，顯著高于對(duì)照。

2.1.3 腺毛結(jié)構(gòu)

利用掃描電鏡同時(shí)觀察到甘草葉片上下表皮具腺毛結(jié)構(gòu)（見圖版Ⅰ：G～H），腺毛長(zhǎng)約90 μm，垂直于葉表面，基部較粗，呈圓環(huán)狀，向上漸尖伸長(zhǎng)，形似短毛。腺毛在葉肉組織和葉脈表面上均有分布。正常供水條件下，3種類型葉片上下表皮間腺毛數(shù)量無(wú)顯著差異，約為4.96 個(gè)·mm-2；干旱脅迫下，3 種類型葉片腺毛數(shù)量均有所增加，其中新葉在輕度脅迫下腺毛數(shù)量即較對(duì)照顯著增加，至中度脅迫達(dá)最多，較對(duì)照增加了174.26%，到重度脅迫下腺毛數(shù)量降至與對(duì)照相當(dāng)水平；成熟葉則在中度和重度脅迫下腺毛數(shù)量顯著增加，較對(duì)照增加了203.96%；衰老葉僅在輕度脅迫下較對(duì)照有小幅增加，中度、重度脅迫下腺毛數(shù)量均與對(duì)照相當(dāng)。

表1 干旱脅迫下甘草葉片表皮氣孔形態(tài)結(jié)構(gòu)Table1 Leaf epidermal morphology of G.uralensis under drought stress

表2 干旱脅迫下甘草葉片表皮腺體分布Table 2 Epidermal gland density in leaves of G. uralensis under drought stress

表3 干旱脅迫下甘草葉片表皮腺毛分布Table 3 Epidermal glandular trichome density in leaves of G.uralensis under drought stress

2.2 干旱脅迫對(duì)甘草葉片光合特性的影響

葉片的主要功能是進(jìn)行光合作用，干旱脅迫影響葉片的形態(tài)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而對(duì)其功能造成影響。本研究測(cè)定了不同干旱脅迫程度下甘草成熟葉片光合相關(guān)指標(biāo)，結(jié)果如圖2 所示。正常供水條件下，甘草成熟功能葉Pn為8.2 μmol·m-2·s-1，輕度脅迫下，葉片仍維持較高的Pn，與對(duì)照差異不顯著；中度脅迫下，葉片Pn較對(duì)照下降了23.17%，差異顯著水平；重度脅迫下，葉片僅維持極微弱的Pn。氣孔導(dǎo)度是表示氣孔張開程度的重要指標(biāo)，隨干旱脅迫程度加深，甘草葉片氣孔導(dǎo)度呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，即輕度脅迫下較對(duì)照有小幅升高，中度脅迫下較對(duì)照顯著下降，至重度脅迫氣孔導(dǎo)度降至極低水平。干旱脅迫下葉片蒸騰速率變化趨勢(shì)與氣孔導(dǎo)度一致，呈輕度脅迫下小幅升高，中度和重度脅迫下較對(duì)照顯著下降。胞間CO2濃度在正常供水和輕度脅迫下均維持相對(duì)穩(wěn)定水平，約為247.5 mg·L-1；中度脅迫下Ci較對(duì)照下降了23.40%，達(dá)差異顯著水平；重度脅迫下，甘草葉片Ci迅速升高，為對(duì)照的2.4倍。

3 討論

葉片是植物進(jìn)行光合作用的主要器官，氣孔是葉表面特有的形態(tài)結(jié)構(gòu)，植物通過(guò)氣孔與外界環(huán)境進(jìn)行水分和氣體交換，氣孔開度控制著植物的光合作用以及蒸騰作用［17～18］，從而影響葉片水勢(shì)。因此，氣孔的形態(tài)建成、分布密度以及開放程度等均直接影響植物光合作用以及蒸騰作用。大量研究均證實(shí)，氣孔在葉表面分布不均，主要分布在下表面［19］。本研究同樣觀察到，甘草葉片氣孔在下表面分布密度遠(yuǎn)高于上表面。正常供水條件下，不同發(fā)育程度葉片表皮氣孔密度成熟葉＞新葉＞衰老葉，以及氣孔開張度也表現(xiàn)為成熟葉＞新葉＞衰老葉。這可能是隨著分生組織細(xì)胞成熟，最終分裂為氣孔，因而隨著葉片成熟，單位面積上氣孔數(shù)量增多［20］，然而隨著葉片衰老，氣孔也隨著發(fā)生PCD，繼而氣孔密度減小。

植物抵御干旱脅迫主動(dòng)適應(yīng)環(huán)境的一個(gè)重要調(diào)節(jié)因素就是氣孔調(diào)節(jié)［21］，干旱脅迫會(huì)誘導(dǎo)植物的氣孔出現(xiàn)微形態(tài)的變化，如氣孔密度增大［22］、氣孔開度減小［23～24］、氣孔下陷、氣孔器長(zhǎng)度和寬度顯著減小等［25］，以使植物抗性提高。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著干旱脅迫程度的加劇，葉片總氣孔密度、氣孔開張比呈先增大后減小的趨勢(shì)；而氣孔開張寬度呈逐漸減小的趨勢(shì)，可能是氣孔密度的增加有助于植物更好地控制呼吸作用，調(diào)節(jié)體內(nèi)H2O和CO2的進(jìn)出，同時(shí)脫落酸（ABA）觸發(fā)保衛(wèi)細(xì)胞釋放K+，保衛(wèi)細(xì)胞滲透壓和體積的降低導(dǎo)致氣孔開張寬度逐漸減小，甚至關(guān)閉。與張曉艷等［26］研究發(fā)現(xiàn)氣孔密度隨干早程度的加劇呈先增加后減小結(jié)果一致，說(shuō)明干旱脅迫程度加速了氣孔細(xì)胞的程序性死亡所造成的［27］，與趙殊麗［28］、齊紅巖等［29］、高彥萍等［30］的研究氣孔密度逐漸增大結(jié)果不同，這可能是甘草葉片具有表皮毛、腺體等適應(yīng)干旱的特征，對(duì)干旱逆境脅迫具有交叉適應(yīng)性，既能提高植株的抗旱能力，又能降低其在干旱環(huán)境下所受到的傷害。

旱生植物葉表皮及其附屬物發(fā)生明顯變化，如表皮毛、腺毛、瘤狀或乳狀突起等。楊九艷等［31～32］認(rèn)為表皮毛反射強(qiáng)光使得葉片降溫，免受灼傷，可代替蒸騰作用而間接減少蒸騰用水。宋玉霞等［33］對(duì)賀蘭山幾種旱生灌木葉表皮進(jìn)行了掃描電鏡觀察，認(rèn)為表皮毛的附著可起到防止日灼，對(duì)葉表皮細(xì)胞和葉肉細(xì)胞均起著很大的保護(hù)作用，還可以在氣孔開放時(shí)起保護(hù)作用，減少水分的蒸騰。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，在正常供水下，泌腺及其分泌物多呈光滑圓盤狀，泌腺在葉片上下表皮分布數(shù)量不均，在下表皮分布數(shù)量大于上表皮，其中衰老葉泌腺數(shù)量顯著低于新葉和成熟葉，可能是干旱脅迫導(dǎo)致葉片PCD，繼而影響了泌腺發(fā)育；隨著干旱脅迫程度的加劇葉片上表皮和下表皮腺體密度總數(shù)整體上呈增大的趨勢(shì)，腺體顏色隨著干旱脅迫程度的加劇逐漸加深，形狀出現(xiàn)不規(guī)則褶皺和內(nèi)陷，3 種類型葉片腺毛數(shù)量均比對(duì)照多，表明甘草葉片表面的腺體特征參與抗旱逆境調(diào)節(jié)，從而避免甘草植株受到干旱逆境脅迫的傷害。這與Randhawa 等［34］研究發(fā)現(xiàn)抗性強(qiáng)的品種具有數(shù)量更多的腺毛結(jié)果一致。

干旱脅迫對(duì)植物光合作用的影響范圍很廣，從限制CO2向葉綠體的擴(kuò)散，限制莖和根產(chǎn)生的激素介導(dǎo)的氣孔開放，到限制CO2向葉肉運(yùn)輸，以及改變?nèi)~片中光化學(xué)反應(yīng)和碳代謝過(guò)程。這些影響隨著脅迫的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間以及葉片的年齡（老葉片更容易受到干旱的影響，積累更多的鹽分）和植物種類而變化［35］。近年來(lái)的研究表明，在快速或輕度干旱條件下，氣孔限制是光合作用下降的主要原因，而緩慢干旱、中度干旱或嚴(yán)重干旱條件下，光合作用主要受非氣孔因素限制。植物受旱后，葉片光合作用受抑制的主要原因都有從氣孔因素向非氣孔因素轉(zhuǎn)變的過(guò)程，其轉(zhuǎn)變時(shí)間因植物的抗旱能力、干旱程度及施加方式等因素而異。在干旱脅迫下，植物吸水受阻導(dǎo)致體內(nèi)水分缺乏，蒸騰速率會(huì)逐漸減緩，以維持植物基本代謝活動(dòng)，這是植物抵御干旱脅迫的防御機(jī)制［36］，氣孔導(dǎo)度是蒸騰速率大幅度下降的主要原因。研究表明Pn與Gs和Tr呈顯著正相關(guān)，是由于氣孔在植物光合氣體交換中影響著Pn和Gs的過(guò)程，其調(diào)節(jié)能力是植物適應(yīng)水分逆境的主要措施之一［37］。Valladares等［38］研究發(fā)現(xiàn)在小麥開花后，小麥葉片凈光合速率隨干旱脅迫程度的加劇呈先增大再減小的趨勢(shì)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示隨著干旱脅迫程度的加劇，甘草幼苗葉片的Pn、Tr、和Gs都呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)；在輕度干旱脅迫時(shí)，Pn、Tr、和Gs顯著高于CK，這可能是甘草葉片表面氣孔影響所致。而Ci呈逐漸上升的趨勢(shì)，在重度脅迫時(shí)迅速增高，這與Y.Ohashi［39］等研究結(jié)果一致，表明在重度干旱脅迫下甘草幼苗失去抗旱能力，以及限制甘草幼苗光合作用的因素是由非氣孔因素導(dǎo)致的。