武國(guó)凡 成宏斌 吳玉俊 沈 娟 吳旺澤*

（1. 西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，蘭州 730070；2. 蘭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，蘭州 730030）

CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）基因簇是細(xì)菌和古生菌基因組中廣泛存在的一種DNA重復(fù)序列家族。在該重復(fù)序列上游還存在一個(gè)多態(tài)性的Cas（CRISPR associated）蛋白家族基因，它們伴隨著細(xì)菌和古生菌的進(jìn)化，形成了一種高度保守的CRISPR/Cas 系統(tǒng)。研究顯示，這種特殊的CRISPR/Cas 系統(tǒng)構(gòu)成了原核生物的獲得性免疫防御系統(tǒng)，以抵抗外源遺傳物質(zhì)的入侵［1］。所以研究者利用細(xì)菌這種特殊的CRISPR/Cas 系統(tǒng)，開(kāi)發(fā)了繼鋅指核酸內(nèi)切酶（Zinc finger endonuclease，ZFN）和類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（Transcription activator-like effector nuclease，TALEN）技術(shù)之后發(fā)展起來(lái)的另一種基因組編輯新技術(shù)，由于它靈活、高效且易于操作，該技術(shù)已成為目前最為熱門(mén)的基因組編輯工具［2］。

根據(jù)Cas結(jié)構(gòu)和功能的不同，CRISPR/Cas系統(tǒng)可大體分為兩類，第一類編輯系統(tǒng)對(duì)外源基因組的剪切需要一個(gè)較大的Cas蛋白復(fù)合物和引導(dǎo)RNA；第二類編輯系統(tǒng)對(duì)外源基因組的剪切只需要一個(gè)單一的剪切蛋白，如Cas9蛋白和cpf1蛋白。因此通過(guò)CRISPR/Cas9系統(tǒng)，研究者僅需基于靶基因的基因序列，合成一個(gè)含PAM（Protospacer Adjacent Motifs）序列的sgRNA 靶序列，即可通過(guò)Cas9 蛋白的核酸內(nèi)切酶活性可以通過(guò)切割靶DNA并形成體內(nèi)DNA 修復(fù)機(jī)制并使DNA 雙鏈斷裂（DSB）導(dǎo)致基因修飾，造成基因突變（如：插入，缺失和置換）［3～4］。目前CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)不僅在動(dòng)物遺傳突變體的構(gòu)建，以及遺傳性疾病治療等方面發(fā)揮重要作用，而且在作物新品種選育和作物改良中也具有重要意義［5～7］。因此，這一技術(shù)的廣泛應(yīng)用，極大加快了人類對(duì)功能基因的深入研究。

油菜素內(nèi)酯（Brassinosteroids，BRs）是一種天然產(chǎn)生的植物激素，在調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中有重要作用［8］。當(dāng)BR 合成通路或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受損時(shí)，其突變體表現(xiàn)出種子萌發(fā)率下降、植株極度矮小、開(kāi)花時(shí)間延遲、雄性的育性能力降低、葉片延緩衰老等表型［9］。由于BRs 在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中具有重要的功能，自從1997 年BR 受體BRI1被克隆鑒定之后，人們通過(guò)各種遺傳（如EMS 誘變、激活標(biāo)簽和T-DNA 插入篩選等）和生化（如酵母雙雜交、雙向電泳等）手段對(duì)BRs 的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程進(jìn)行了廣泛且深入的研究［10］。2017 年Sun 等利用TILLING（Targeted Induced Local Lesions In Genomes）技術(shù)獲得了多個(gè)BRI1 突變體，并證實(shí)這些突變體中BRI1 不同位點(diǎn)的突變，對(duì)BR 信號(hào)通路有不同的影響，因此這些突變體的發(fā)現(xiàn)為BR 信號(hào)通路中早期事件的研究奠定了基礎(chǔ)［11］。

本研究利用CRISPR/Cas9 基因組編輯技術(shù)，在模式植物擬南芥Col-0 生態(tài)型中定向編輯BRs受體BRI1，以期獲得新的擬南芥BRI1 的突變體，為進(jìn)一步闡釋BRI1 生物學(xué)的功能以及驗(yàn)證其他物種中BRI1同源基因的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物及培養(yǎng)

野生型擬南芥Col-0，WS2 及BR 突變體bri1-5和bri1-701 均由蘭州大學(xué)黎家實(shí)驗(yàn)室提供。植物材料培養(yǎng)，挑選飽滿度均一的擬南芥種子，在EP管中加無(wú)菌蒸餾水，4℃春化2～3 d，用移液器點(diǎn)播于營(yíng)養(yǎng)土中，在溫室中22℃長(zhǎng)日照培養(yǎng)（16 h光照/8 h 黑暗）。1/2 MS 固體培養(yǎng)基培養(yǎng)無(wú)菌的材料，在超凈臺(tái)用75%（v/v）滅菌1 min，用無(wú)菌ddH2O 清洗2～3 次，然后1%次氯酸鈉（v/v）滅菌15 min，再用無(wú)菌ddH2O清洗3～5次。用無(wú)菌槍頭點(diǎn)播于1%（w/v）蔗糖和0.8%（w/v）瓊脂的1/2 MS 固體培養(yǎng)基，在超凈臺(tái)吹干后用Prafilm 封口，倒置放于4℃冰箱春化3 d，然后放入培養(yǎng)箱，在22℃長(zhǎng)日照培養(yǎng)（16 h 光照/8 h 黑暗）。下胚軸處理實(shí)驗(yàn)，4℃春化后，22℃24 h持續(xù)暗培養(yǎng)。

1.1.2 菌株和質(zhì)粒

本實(shí)驗(yàn)所用的大腸桿菌菌株（DH5α）和根癌農(nóng)桿菌菌株（GV3101），CRISPR/Cas 系統(tǒng)載體pCBC-DT1T2 和pHEE401 均由蘭州大學(xué)黎家實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3 試驗(yàn)試劑

DNA 膠回收試劑盒、植物總RNA 提取試劑盒及質(zhì)粒小量提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技公司，DNA 聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自諾唯贊公司，限制性內(nèi)切酶購(gòu)自NEB 公司，TransStart?Top Green qPCR SuperMix 試劑盒購(gòu)自TransGen Biotech 公司，DNA 提取試劑盒和2，4-表油菜素內(nèi)酯購(gòu)自生工生物工程（上海）公司，引物合成（見(jiàn)表3）及測(cè)序服務(wù)由北京華大公司提供。

1.1.4 數(shù)據(jù)處理方法

用SPSS 22.0 軟件統(tǒng)計(jì)分析，Image J 軟件測(cè)量根和下胚軸的長(zhǎng)度，Photoshop CC 2019 軟件作圖。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 sgRNA靶位點(diǎn)的選取

首先從擬南芥數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.arabidopsis.org）中獲得AtBRI1 基因序列（AT4G39400）。并登陸CRISPR-PLANT 網(wǎng)站（http：//www.genome.arizona.edu/crispr/CRISPR search.html）輸入目的基因序列，分析獲得含有PAM序列的潛在靶位點(diǎn)（見(jiàn)表1）?；谇捌趯?duì)BRI1 突變體的研究報(bào)道［11］，BRI1蛋白的N 端在植物信號(hào)感知中具有重要作用，我們初步選擇了一條位于BRI1 胞外區(qū)功能結(jié)構(gòu)域的sgRNA 靶點(diǎn)序列（AGCTCCAAGCCTCTCAACGT-CGG）進(jìn)行基因定向編輯。

表1 AtBRI1基因中sgRNA序列Table 1 sgRNA sequence in AtBRI1 gene

1.2.2 CRISPR/Cas9-AtBRI1載體構(gòu)建

合成含靶點(diǎn)序列的引物DT1-BsF，DT1-F0，DT2-R 和DT2-BsR（見(jiàn)表3），以pCBC-DT1T2 為模板擴(kuò)增獲得帶有目的序列的基因片段，并通過(guò)酶切連接構(gòu)建表達(dá)載體CRISPRCas9-AtBRI1（見(jiàn)表2）。

表2 酶切—連接體系Table 2 Enzyme digestion-connection system

1.2.3 擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化與陽(yáng)性株檢測(cè)

將載體CRISPR/Cas9-AtBRI1熱激轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌（GV3101），通過(guò)花浸法轉(zhuǎn)入擬南芥，獲得的種子在含有40 mg·L-1潮霉素的1/2 MS 培養(yǎng)基篩選，獲得T0代陽(yáng)性單株。挑選具有bri1 突變體類似表型的植株葉片DNA 用引物（AtBRI1-F，AtBRI1-R）擴(kuò)增包含編輯位點(diǎn)的片段并測(cè)序。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

選取在1/2 MS 固體培養(yǎng)基生長(zhǎng)10 d 的擬南芥幼苗，經(jīng)1 μm·L-1BL 處理3 h 后提取植物總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 后，以Actin2 為內(nèi)參，分別檢測(cè)各樣品中CPD，DWF4，BR6ox2 及SAUR-AC1 的表達(dá)量，以從分子水平上分析各樣品中的BR 信號(hào)響應(yīng)是否受損。依據(jù)TransGen Biotech 公司Trans-Start?Top Green qPCR SuperMix 試劑盒用20 μL反應(yīng)體系進(jìn)行qPCR，每個(gè)樣品3 個(gè)重復(fù)。引物設(shè)計(jì)及檢測(cè)方法參考Wu等［12］。

1.2.5 BL處理根長(zhǎng)和下胚軸的測(cè)量

在超凈臺(tái)上用75%酒精和1%次氯酸鈉消毒后的擬南芥種子，點(diǎn)播于添加1 μm·L-1BL 的1%（w/v）蔗糖和0.8%（w/v）瓊脂的1/2 MS 培養(yǎng)基上。4℃春化2～3 d，培養(yǎng)皿垂直放置于22℃恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行長(zhǎng)日照培養(yǎng)（16 h 光照/8 h 黑暗）。7～8 d 后拍照，用Image J 測(cè)量根長(zhǎng)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。為了進(jìn)行BL 對(duì)下胚軸敏感性試驗(yàn)，將春化后的培養(yǎng)皿垂直放于22℃恒溫培養(yǎng)箱，進(jìn)行24 h 連續(xù)暗培養(yǎng)，7～8 d后拍照，用Image J測(cè)量根長(zhǎng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。

1.2.6 擬南芥鮮重測(cè)定

取生長(zhǎng)在溫室中22℃長(zhǎng)日照培養(yǎng)（16 h 光照/8 h 黑暗）30 d 幼苗進(jìn)行稱重，并通過(guò)SPSS 22.0 軟件分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 CRISPR/Cas9-AtBRI1敲除突變體分子鑒定

在擬南芥AtBRI1基因序列239 bp的位置設(shè)計(jì)四個(gè)引物（DT1-BsF、DT1-F0、DT2-R 和DT2-BsR），通過(guò)酶切連接體系，該靶序列經(jīng)退火復(fù)性插入到經(jīng)BsaⅠ酶切的AtU6：sgRNA載體（見(jiàn)圖1）。

表3 PCR引物序列Table 3 PCR primer sequence

將構(gòu)建好的帶有AtBRI1 基因靶序列的CRISPRCas9-AtBRI1 的農(nóng)桿菌，通過(guò)pHEE401植物表達(dá)載體鑒定引物U626-IDF（TGTCCCAGGATTAGAATGATTAGGC）和 U629-IDR（AGCCCTCTTCTTTCGATCCATCAAC）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，其條帶大小和預(yù)期片段大小相符，表明靶向敲除擬南芥AtBRI1 基因的CRISPR/Cas9 基因組編輯載體已構(gòu)建成功（見(jiàn)圖2A）。為了驗(yàn)證是否成功利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對(duì)野生型Col-0 中的BRI1 進(jìn)行了靶向基因編輯，提取具有bri1 突變體類似表型的植株葉片DNA，用引物（AtBRI1-F，AtBRI1-R）擴(kuò)增包含編輯位點(diǎn)的片段并測(cè)序（見(jiàn)圖2B）。對(duì)AtBRI1-F 和AtBRI1-R 擴(kuò)增獲得的條帶進(jìn)行測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)相比于野生型Col-0，不同的轉(zhuǎn)基因植株中均發(fā)現(xiàn)在Col-0 背景BRI1 254 bp 處插入了一個(gè)A（見(jiàn)圖3：A～C），導(dǎo)致原有序列提前終止（見(jiàn)圖3D），我們將通過(guò)CRISPR/Cas9 編輯產(chǎn)生的遺傳突變體命名為bri1-A。

2.2 AtBRI1突變體表型分析

因?yàn)镃RISPR/Cas9-AtBRI1載體帶有潮霉素篩選標(biāo)簽，所以在1/2 MS 培養(yǎng)基添加40 mg·L-1濃度的潮霉素篩選T0代轉(zhuǎn)基因植株，將抗潮霉素命名為bri1-A（見(jiàn)圖4A）；與Col-0 相比，bri1-A 突變體的植株矮小，顏色深綠，葉柄縮短，蓮座葉縮小變圓，角果縮短，雄蕊的花絲縮短導(dǎo)致成熟的花粉不能授到柱頭上造成雄性不育，bri1-A 突變體與bri1-5突變體相比為強(qiáng)突變體，植株表現(xiàn)的更加矮小，顏色深綠及葉柄縮短等表型。bri1-A 突變體的表型和BR 強(qiáng)突bri1-701 的表型類似，證明bri1-A突變體的表型可能是通過(guò)CRISPR 編輯造成了BR信號(hào)通路的嚴(yán)重阻斷，從而表現(xiàn)出BR 強(qiáng)突變體的類似的表型（見(jiàn)圖4C-D），鮮重統(tǒng)計(jì)分析表明，bri1-A和背景Col-0差異明顯，也遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于BR弱突bri1-5，但比bri1-701 稍重，這和表型也相符（見(jiàn)圖4B）。

2.3 bri1-A對(duì)BL的敏感性分析

由于bri1-A 表現(xiàn)出類似于BR 缺失突變體類似的表型，為進(jìn)一步驗(yàn)證該表型是否是BR 信號(hào)通路受損相關(guān)，我們通過(guò)外源施加高濃度的BL 觀察該突變體對(duì)BL的敏感性。如圖5A和C所示，在用1 μm·L-1濃度的BL 處理時(shí)，野生型對(duì)照WS2 和Col-0 的根生長(zhǎng)均受到明顯的抑制，而bri1-A 同bri1-5 和bri1-701 一樣，對(duì)BL 的敏感性降低。同時(shí)我們還觀察了在暗培養(yǎng)條件，如圖5B，D 所示，高濃度BL 處理對(duì)不同植物材料下胚軸伸長(zhǎng)的影響，相比于野生型對(duì)照WS2和Col-0，在用1 μm·L-1濃度BL 處理后，bri1-A 同bri1-5 和bri1-701 一樣，BL 對(duì)幼苗下胚軸伸長(zhǎng)的抑制明顯減弱。因此以上結(jié)果從生理層面證明bri1-A同BRI1的其他一些突變體一樣對(duì)BL 的敏感性降低，說(shuō)明其產(chǎn)出的各種BR 缺失的表型與BR 信號(hào)通路的受阻息息相關(guān)。

為了從分子水平證明bri1-A 強(qiáng)烈的BR 突變體表型來(lái)自于通過(guò)CRISPR 編輯造成的BR 信號(hào)受損，我們采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR，檢測(cè)下游BR合成相關(guān)基因CPD，DWF4，BR6ox2，以及下游負(fù)反饋調(diào)節(jié)基因SAUR-AC1 的表達(dá)量，以驗(yàn)證突變體中BR 信號(hào)通路是否正常［12～13］。如圖6 所示，在正常生產(chǎn)情況下，相比于野生型對(duì)照，BR 合成相關(guān)基因CPD，DWF4 和BR6ox2 在bri1-5、bri1-701 和bri1-A 中顯著上調(diào)表達(dá)，而負(fù)反饋調(diào)節(jié)基因SAUR-AC1 則顯著下調(diào)表達(dá)。當(dāng)幼苗經(jīng)過(guò)1 μm·L-1濃度的BL 處理后，在Col-0 和WS2 兩種野生型對(duì)照 中，CPD、DWF4 和BR6ox2 分 別 降 低78.6%/72.7%、80%/68.9%和87.9%/86.6%，而bri1-5、bri1-701 和bri1-A 僅分別降低4%/7%/14%、22.8%/8.8%/10%和24.4%/8.2%/21.0%，同時(shí)負(fù)反饋調(diào)節(jié)基因SAUR-AC1 在野生型對(duì)照植株中，經(jīng)BL 處理后相比于正常植株顯著上調(diào)表達(dá)，而在bri1-5、bri1-701 和bri1-A 上調(diào)表達(dá)不顯著。因此以上結(jié)果從基因表達(dá)調(diào)控層面再次證明bri1-A 對(duì)BL 敏感性降低，且突變體中的BR 信號(hào)通路被阻斷。

3 討論

T-DNA 插入技術(shù)是我們?cè)缙谘芯炕蚬δ艹Ｓ玫囊环N技術(shù)，Gang 等利用該技術(shù)甚至在白樺中鑒定到了由T-DNA 插入引起的突變體［14］。但對(duì)于特定靶基因的編輯，T-DNA 插入技術(shù)往往顯得有些捉襟見(jiàn)肘。雖然鋅指核酸內(nèi)切酶（ZFNs）和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)因子核酸酶（TALENs）這兩種基因編輯技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)靶向基因編輯［15～16］，但CRISPR/Cas9 技術(shù)在基因編輯中有著更為簡(jiǎn)單快速的優(yōu)點(diǎn)［17］，一方面CRISPR/Cas9 技術(shù)有較強(qiáng)的可操作性，可以通過(guò)Cas9 有目的敲除需要的靶點(diǎn)序列，另一方面，CRISPR/Cas9技術(shù)操作方便，且目的基因序列每8 個(gè)堿基就能找到一個(gè)進(jìn)行編輯的PAM 序列［18］?；谶@些優(yōu)點(diǎn)，CRISPR/Cas9 技術(shù)已得到許多科研工作者認(rèn)同，到目前為止，CRISPR/Cas9系統(tǒng)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域、植物科學(xué)領(lǐng)域以及動(dòng)物科學(xué)領(lǐng)域被廣泛認(rèn)可并成功研究應(yīng)用。

在植物生長(zhǎng)及發(fā)育過(guò)程中難免會(huì)遭受諸如病毒、細(xì)菌、真菌甚至昆蟲(chóng)等的侵襲，所以植物在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中形成了一系列的防御體系調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，而植物激素就該調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中扮演著重要角色。已有大量研究顯示，油菜素內(nèi)酯作為一種植物激素除了調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育，也參與植物免疫防御反應(yīng)［19～24］。因此定位于植物細(xì)胞膜上的油菜素內(nèi)酯的受體BRI1，在植物生長(zhǎng)、發(fā)育和免疫過(guò)程中起著很重要的調(diào)控作用［25～27］。但目前越來(lái)越多的研究顯示，BRI1 不同的位點(diǎn)或結(jié)構(gòu)域在調(diào)控不同生物學(xué)的過(guò)程中起不同作用。所以為進(jìn)一步了解BRI1 的功能，利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)，構(gòu)建多種新的BRI1突變體，對(duì)BRI1功能的深入理解必定起到積極的推動(dòng)作用。在本研究中我們初步嘗試?yán)肅RISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)，構(gòu)建了一個(gè)新的BRI1 突變體bri1-A。如圖7 所示，其是由于一個(gè)堿基的插入突變，導(dǎo)致正常的BRI1 蛋白序列提前終止。由于現(xiàn)有BRI1 強(qiáng)突變體大多數(shù)為某些位點(diǎn)的替換，對(duì)某些特定結(jié)構(gòu)域的功能研究產(chǎn)生不便。因此我們的初步嘗試為后續(xù)BRI1 功能的深入研究提供了參考。

綜上所述，本研究利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)成功獲得了新的擬南芥BRI1 突變體，證明利用該技術(shù)獲得新的突變體就有一定可行性。同時(shí)對(duì)新突變體的深入研究，我們發(fā)現(xiàn)一些新的位點(diǎn)或者某些蛋白序列對(duì)基因功能的發(fā)揮至關(guān)重要，可能不同的位點(diǎn)以及特定的結(jié)構(gòu)域在植物生長(zhǎng)發(fā)育或植物對(duì)生物與非生物脅迫的響應(yīng)中具有不同的調(diào)控作用。這就為今后深入研究特定基因的功能提供了重要遺傳基礎(chǔ)。由于BRI1 在不同物種中同源性相對(duì)較高，且發(fā)揮著類似的功能，所以利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)編輯其他物種中的BRI1，為后期分析其他物種中BRI1 的功能，甚至還可為優(yōu)良作物品種的選育提供優(yōu)質(zhì)的種植資源，為推動(dòng)綠色農(nóng)業(yè)的發(fā)展提供動(dòng)力。