李瑞哲，徐驚濤，馬志杰，孫永剛，韓銀倉，陳生梅

(青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，西寧 810016)

硒是動物機體必需的微量元素之一，在繁殖、免疫、抗氧化、調(diào)節(jié)機體代謝等生理功能中具有重要作用[1]。硒蛋白是指含有硒半胱氨酸(selenocysteine)殘基的一類蛋白質(zhì)，是硒發(fā)揮生物學(xué)功能的主要載體[2]。硒蛋白的特殊之處在于編碼硒半胱氨酸的密碼子為UGA，而在其他蛋白質(zhì)中UGA一般作為終止密碼子。目前為止，在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的硒蛋白已經(jīng)有二十多種，主要成員包括谷胱甘肽過氧化物酶家族(glutathione peroxidase，GPxs)、硫氧還蛋白還原酶家族(thioredoxin reductases，TrxRs)、脫碘酶家族(iodothyronine deiodinases，DIOs)等[2]。谷胱甘肽過氧化酶能夠催化還原H2O2和有機過氧化物，將其轉(zhuǎn)變?yōu)镠2O和相應(yīng)的有機醇，起著抗氧化和維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡的作用[3]。在哺乳動物中已經(jīng)鑒定出GPx1～GPx8八個成員[4]，其中GPx1是最早被鑒定出的含硒蛋白，廣泛分布于機體各類組織中，在抗氧化應(yīng)激、炎癥信號介導(dǎo)、糖和脂類代謝、卵泡發(fā)育、代謝疾病以及癌癥發(fā)生等生理病理過程中起著重要作用[5-8]。

小鼠上的研究表明，在低硒飼養(yǎng)的條件下，GPx1的mRNA水平和蛋白表達量急劇下降[9]，提示GPx1可以作為動物硒狀態(tài)的指示劑；對豬的研究表明，GPx1是豬圓環(huán)2型病毒(Porcine circovirus type 2，PCV2)感染過程中重要的防御因子，能夠阻止PCV2的擴散[10]；對牛的研究表明，GPxs的活性與動物體內(nèi)硒含量和泌乳期有關(guān)，泌乳前期的硒含量和GPxs的活性均較高[11]。在牦牛上尚未見到GPx1與生理病理過程的相關(guān)研究。因此，本試驗克隆了牦牛GPX1基因的CDS區(qū)，分析了其核苷酸序列，為進一步研究牦牛GPx1的生理功能提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為實驗室保存的牦牛耳緣皮膚成纖維傳代細(xì)胞。

1.2 主要試劑

TRIzol試劑購自賽默飛世爾科技公司(Thermo Fisher Scientific)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser)購自TaKaRa公司，高保真PCR試劑盒(KP203)，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(DP209)，pLB零背景快速連接試劑盒(VT205)和感受態(tài)細(xì)胞(DH5α)購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 基因克隆

采用TRIzol法提取RNA，提取出的RNA采用Nanodropone測定濃度。然后采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。參考黃牛GPX1 mRNA序列(NM_174076.3)設(shè)計引物，上游引物為5’-GGAAACGGATACCATGTGCG-3’，下游引物為5’-GGCATTCCTCCACGTAGGTT-3’。以上述cDNA為PCR模板，進行目的基因擴增。PCR反應(yīng)各組分為：2×UltraHiFi Mix 25μL，上下游引物各1.25μL，DNA模板2μL，ddH2O 20.5μL。PCR反應(yīng)參數(shù)為：94℃ 2min；98℃ 10s，61℃ 30s，68℃ 20s，35個循環(huán)；68℃5min。反應(yīng)結(jié)束后采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增情況。

采用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收目的基因片段，檢測濃度后與pLB載體連接；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含氨芐青霉素的瓊脂平板后37℃過夜培養(yǎng)；次日挑取單個菌落置于LB液體培養(yǎng)基，37℃震蕩培養(yǎng)；經(jīng)菌液PCR鑒定陽性的樣品送上海生工測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用BioEdit 7.2軟件進行目的基因的序列提取和ORF分析，采用DNAMAN 9.0軟件進行核苷酸和氨基酸的序列一致性分析，采用MEGA 10.2軟件中的Neighbor Joining法進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

2 結(jié)果與分析

2.1 牦牛GPX1基因克隆

牦牛GPX1基因PCR結(jié)果見圖1。獲得的目的片段與預(yù)期大小相符。

圖1 牦牛GPX1基因PCR擴增結(jié)果

2.2 序列分析結(jié)果

采用BioEdit軟件提取目的基因的序列信息，并進行ORF分析。經(jīng)測序目的片段長度為727 bp，與預(yù)期結(jié)果相符。進行ORF分析時，由于ORF尋找程序通常將TGA識別為終止密碼子，而實際上在某些mRNA中UGA編碼的為硒半胱氨酸[12]，因此ORF結(jié)果需進行相應(yīng)的調(diào)整。ORF分析結(jié)果表明，牦牛GPX1基因的ORF長度為618bp，編碼205個氨基酸，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAG(圖2)。

圖2 預(yù)測的牦牛GPX1 ORF及其編碼的氨基酸序列起始密碼子ATG用方框標(biāo)示，終止密碼子用*標(biāo)示，深色背景TGA標(biāo)示其編碼的硒半胱氨酸

表1 牦牛與其他物種GPX1基因的CDS區(qū)和氨基酸序列一致性分析

2.3 同源性分析與系統(tǒng)進化樹

采用DNAMAN軟件將克隆獲得的牦牛CDS區(qū)序列和氨基酸序列與普通牛、瘤牛、水牛、綿羊、豬、人、狗、小鼠、雞和斑馬魚的CDS區(qū)序列和氨基酸序列進行序列一致性分析，結(jié)果見表1。牦牛GPX1基因的CDS序列和氨基酸序列與普通牛和瘤牛完全一致，與其他哺乳動物的序列一致性均超過80%。

采用MEGA軟件構(gòu)建牦牛GPX1基因CDS區(qū)核苷酸序列與上述幾種物種GPX1基因CDS區(qū)核苷酸序列的系統(tǒng)進化樹(圖3)。牦牛首先與普通牛、瘤牛、水牛等牛亞科動物聚類，而后是羊亞科和偶蹄目動物，然后是人、狗、小鼠等哺乳類動物，與斑馬魚遺傳距離最遠。

圖3 牦牛與其他10個物種基于GPX1基因的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

牦牛是生活在青藏高原及其毗鄰區(qū)域的特色畜種，在漫長的進化過程中適應(yīng)了高寒、缺氧的生態(tài)環(huán)境。與其近緣種普通牛相比，牦牛在基因分子序列、組織形態(tài)結(jié)構(gòu)、器官生理功能等方面都表現(xiàn)出了對缺氧應(yīng)激的適應(yīng)性進化[13-15]。GPx1是第一個被鑒定出的硒蛋白，它以同四聚體的形式存在，能夠以還原型谷胱甘肽等還原劑為底物，將H2O2和其他可溶性小分子量有機過氧化物還原為水和相應(yīng)的有機醇，是機體重要的抗氧化酶[6]。GPX1敲除的小鼠雖然能夠正常生長發(fā)育，但是其對氧化應(yīng)激的抵抗能力會減弱，De Haan等[16]的研究表明10mg·kg-1的百草枯就能對GPX1-/-小鼠產(chǎn)生致死作用(野生型小鼠LD50約為70 mg·kg-1)，當(dāng)劑量增加到30 mg·kg-1時所有的GPX1-/-小鼠會死亡，而此時對野生型小鼠尚未表現(xiàn)出致死效應(yīng)。在人、小鼠、牛、豬等多個物種上的研究均表明GPx1與代謝、繁殖、免疫、疾病等生理病理過程密切相關(guān)，而在牦牛上尚未見到GPx1與生理病理過程的相關(guān)研究，因此本試驗克隆了牦牛GPX1基因的CDS區(qū)，分析了其核苷酸序列，為進一步研究牦牛GPx1的生理功能提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

序列同源性分析是研究物種系統(tǒng)發(fā)育的重要內(nèi)容之一。在牦牛上目前已有多個與環(huán)境適應(yīng)性和經(jīng)濟性狀相關(guān)的基因被克隆。如段薈芹等[17]克隆了麥洼牦牛低氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)基因，序列分析結(jié)果表明麥洼牦牛HIF-1α基因與野牦牛、牦牛、普通牛、藏羚羊、綿羊、山羊的同源性最高，均達99%，與野豬、人的同源性分別為96%、94%；系統(tǒng)進化樹結(jié)果顯示麥洼牦牛最先與牦牛、野牦牛、普通牛聚為一支，再與藏羚羊、綿羊、山羊聚為一支，最后和其他哺乳動物聚為一支。馬志杰等[18]克隆了牦牛心臟脂肪酸結(jié)合蛋白基因(H-FABP)，序列分析結(jié)果表明牦牛H-FABP基因編碼區(qū)序列與普通牛、綿羊、山羊、豬、人、大鼠、小鼠、雞和斑馬魚的同源性大小分別為99.8%、97.8%、97.0%、92.8%、88.8%、83.3%、83.1%、76.4%和68.7%；系統(tǒng)進化樹結(jié)果顯示，牦牛與普通牛、綿羊與山羊先分別聚在一起，再與豬、人分別聚類，然后與小鼠和大鼠聚為一類，最后與雞聚為一類。楊聯(lián)等[19]克隆了牦牛生長激素基因，序列分析結(jié)果表明牦牛生長激素基因編碼區(qū)序列與牛、山羊、綿羊、馬、豬、貓和犬的同源性分別為99.8%、98.6%、97.7%、90.6%、90.1%、89.1%和88.9%；系統(tǒng)進化樹結(jié)果顯示，牦牛首先與牛聚類，而后與山羊和綿羊聚為一類，然后與豬聚為一類，最后與馬、貓和犬聚為一類。何向東等[20]克隆了牦牛促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素基因(CRH)，序列分析結(jié)果表明牦牛CRH基因與黃牛、貓、雞、人、小鼠、大鼠和豬的核苷酸同源性分別為99.8%、43.3%、36.1%、46.2%、39.0%、38.5%和56.4%；系統(tǒng)進化樹結(jié)果顯示，牦牛與黃牛首先聚為一小類，其次與豬、貓、人、小鼠和大鼠聚為一類，最后與雞聚為一類。朱江江等[21]克隆了牦牛谷胱甘肽過氧化物酶5基因(GPX5)，序列分析結(jié)果表明牦牛GPX5基因與山羊、綿羊、家豬、家貓和倉鼠的同源性分別是95%、95%、90%、87%和86%；系統(tǒng)進化樹結(jié)果顯示，牦牛首先與山羊和綿羊聚為一類，然后先后與家豬和家貓聚類，最后與倉鼠聚為一類。本研究結(jié)果顯示，牦牛GPX1基因的CDS序列和氨基酸序列與普通牛和瘤牛完全一致，與水牛和綿羊的序列一致性分別為98.9%和97.6%，與其他哺乳動物的序列一致性也都超過了80%，說明GPX1基因在哺乳動物中較為保守，在牛亞科動物間更為保守?；贕PX1基因的系統(tǒng)進化樹的結(jié)果表明，牦牛首先與普通牛、瘤牛、水牛等牛亞科動物聚類，而后是羊亞科和偶蹄目動物，然后是人、狗、小鼠等哺乳類動物，與斑馬魚遺傳距離最遠，這與動物分類學(xué)上的結(jié)論也基本一致，說明GPX1基因可以作為構(gòu)建物種之間系統(tǒng)進化樹的候選基因。