朱覺新，黃永梅，黃連芳*（廣東醫(yī)科大學 .廣東天然藥物研究與開發(fā)重點實驗室；.海洋醫(yī)藥研究院，廣東湛江 5403）

自發(fā)性系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)的病因尚不完全清楚，多與遺傳、環(huán)境和雌激素等因素有關[1]。系統(tǒng)性紅斑狼瘡致股骨頭壞死[2]，骨密度下降和長期應用糖皮質激素治療患者易發(fā)生骨壞死[3]，超聲下可見骨侵蝕、滑膜增生、能量多普勒超聲滑膜炎、腱鞘炎等多種病變[4]；未發(fā)現骨壞死患者皮質骨發(fā)現空骨陷窩，骨小梁中央可見無活力骨細胞，其周圍有炎性細胞浸潤[5]，股骨頭部分骨細胞體積縮小，伴核固縮，較多骨細胞壞死溶解成碎片，伴成骨細胞凋亡[6]。Nevskaya等[7]整理文獻發(fā)現無癥狀的骨壞死發(fā)生率達 28.52%，因此，結締組織病患者存在不同程度的骨代謝異常，骨質疏松發(fā)生率較高[8]。青蒿為菊科植物黃花蒿的地面上的干燥部分，味苦、辛，性寒，歸肝、膽經，具有清虛熱、除骨蒸、解暑熱、截瘧、退黃的功效[9]，其主要有效成分為青蒿素，青蒿素類衍生物為蒿甲醚、雙氫青蒿素(DHA)等。近年來發(fā)現青蒿及其有效成分和衍生物治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡、皮膚病如濕疹、光敏感性皮膚病等具有良好療效[10]，蘇穎杭等[11-13]觀察青蒿素硫酸羥氯喹復方的中、高劑量組對大鼠佐劑性關節(jié)炎有一定的抗炎作用，青蒿素干預治療MRL/lpr狼瘡鼠，血清及腎組織MDA水平均明顯升高。目前青蒿素治療SLE的療效研究主要集中在免疫抑制和抗炎方面，對于青蒿素及其衍生物治療紅斑狼瘡后骨骼的改變如何，特別是腰椎骨密度和力學變化少見報道。本研究通過觀察青蒿素對 SLE小鼠腰椎骨密度及力學的影響，為 SLE導致的骨損壞的青蒿素臨床治療提供依據。

1 材料和方法

1.1 藥物

青蒿素的衍生物二氫青蒿素(71939-50-9，批號K913006-CN30，純度≥98%，上海笛柏生物科技有限公司)，經食用油配成1.5%的溶液，給藥劑量150 mg/kg。醋酸潑尼松片(批號160604，廣東華南醫(yī)藥集團有限公司)，劑量6 mg/kg，用生理鹽水配成0.06%的混懸溶液。

1.2 動物與分組

24只紅斑狼瘡小鼠[購買于南京大學模型動物研究中心的實驗鼠，動物生產許可證號：SCXK(蘇)2015-0001：6周齡雌性 B6.MRL-Faslpr/J小鼠(供體株MRL/MpJFaslpr，背 景 株 C57BL/6J，狼瘡小鼠(20.0±2.0) g、C57BL/6J野生型小鼠]在廣東醫(yī)科大學動物中心屏蔽系統(tǒng)環(huán)境中飼養(yǎng)，質量合格證明No.32002100001211，按“廣東省實驗動物監(jiān)測研究所和國家實驗動物監(jiān)測研究所實驗動物保護和使用指南”進行飼養(yǎng)。將其隨機分為3 組，即青蒿素組、潑尼松組和生理鹽水組，每組8只。另選取 8只健康的 6周齡 C57BL/6J野生型(WT)小鼠作為對照組(健康對照組)，每組分籠飼養(yǎng)。

1.3 實驗儀器

瑞士小動物活體顯微成像CT(Scanco Micro-CT VIVA 40)，美國生物力學儀(ElectroForce，3200 Series)。

1.4 方法

1.4.1 給藥 根據人類 SLE的治療劑量換算或參考文獻[7]等確定二氫青蒿素、醋酸潑尼松給藥劑量，保持濕度50%～60%，室溫24～28℃等實驗動物飼養(yǎng)條件。(1)青蒿素組：二氫青蒿素，150 mg/kg，灌胃，1次/d；(2)潑尼松組：醋酸潑尼松，6 mg/kg，灌胃，1次/d；(3)生理鹽水組：生理鹽水0.1 mL/10 g，灌胃，1次/d；(4)健康對照組：生理鹽水0.1 mL/10 g，灌胃，1次/d。用藥90 d后，小鼠眼球取血處死后取材，左側脛骨 Scanco Micro-CT VIVA 40掃描、骨三維重建；腰椎3、4 節(jié)行生物力學壓縮性能試驗。

1.4.2 掃描、骨三維重建 取腰椎進行高分辨率Scanco Micro-CT VIVA 40掃描、三維重建，參數如下：X球管電壓70 KVP，最大功率8 W，焦點直徑7 μm，圖像矩陣4096×4096像素，掃描尺寸38.9 mm×145 mm，CPU r×2800 i2。3D骨重建和圖像分析骨微結構參數：總體積、骨骼體積、骨體積分數、連接性骨密度、結構模型指數、骨小梁數量、厚度、骨組織骨密度、骨小梁分離度等。

1.4.3 生物力學腰椎壓縮性能測試 實驗結束后，剔除腰椎第3、4節(jié)的肌肉及軟組織，用生理鹽水紗布將其包裹，再用錫紙、密封袋裝好，負 20℃冰箱冷存，檢測時恢復室溫，通過生物力學測試儀進行壓縮性能實驗。儀器設置參數：椎體正中線為加壓點，Limits(Load -40,450)，加載速率2.0 mm/min，自動記錄 Load等對應的最大載荷參數等。Load性能測試指標包括彈性模量、彈性載荷、最大載荷、斷裂載荷等。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 腰椎微結構參數比較

與生理鹽水組、潑尼松組相比，青蒿素組小鼠的骨小梁數量、骨體積分數、連接性骨密度與骨組織骨密度均明顯增加，骨小梁分離度與結構模型指數均明顯減少，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。與健康對照組比較，青蒿素組小鼠的腰椎微結構指標的差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見表1、圖1。

2.2 生物力學腰椎壓縮性能測試指標

與生理鹽水組、潑尼松組比較，青蒿素組小鼠的彈性載荷、最大載荷、斷裂載荷明顯增加(P＜0.05)，與健康對照組比較，青蒿素組小鼠的生物力學腰椎壓縮性能指標差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見表2。

3 討論

SLE疾病導致骨代謝異常、微結構變差，骨吸收明顯增加，骨形成抑制，骨量丟失，骨質侵蝕，軟骨破壞，關節(jié)畸形，力學性能也隨之下降。SLE普遍發(fā)生骨密度(BMD)下降，骨質疏松發(fā)生率顯著升高[14]。激素治療雖然改善了小梁微結構，但骨生物力學性能和骨質量沒有得到緩解，且長期激素治療易發(fā)生激素性股骨頭或肱骨頭壞死、肌無力、冠狀動脈病變，腎性高血壓、長期加重心臟負荷等引起高脂血癥、心絞痛、心肌損害及心力衰竭等。有研究顯示，長期服用小劑量潑尼松，骨密度有顯著的降低，服用大劑量潑尼松，骨股頭壞死的發(fā)生率越高[15-16]。Lucinda等[17]觀察到成骨細胞的 Bax表達在糖皮質激素誘導的骨質疏松癥中增加。分析原因可能是激素使機體的凝血-纖溶系統(tǒng)存在明顯的功能障礙[18]。本研究結果中顯示，使用潑尼松治療SLE可使骨吸收有所下降，骨小梁稀疏變薄，骨量減少，分離度增加，連接骨密度和骨小梁密度明顯下降，改善了小梁微結構，但與健康對照組比較，腰椎微結構與生物力學腰椎壓縮性能等指標的差異仍有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，即不能恢復至正常。

表14組小鼠腰椎微結構參數變化(±s， n=8)

表14組小鼠腰椎微結構參數變化(±s， n=8)

與健康對照組比較：aP＜0.05；與生理鹽水組比較：bP＜0.05；與潑尼松組比較：c P＜0.05

圖1 青蒿素對SLE小鼠腰椎的三維結構圖

表2 藥物治療對自發(fā)性紅斑狼瘡小鼠腰椎生物力學變化的影響(±s， n=8)

表2 藥物治療對自發(fā)性紅斑狼瘡小鼠腰椎生物力學變化的影響(±s， n=8)

與健康對照組比較：aP＜0.05；與生理鹽水組比較：bP＜0.05；與潑尼松組比較：c P＜0.05

青蒿為菊科植物黃花蒿，現代中藥藥理學證明青蒿的主要成分是青蒿素，具有抗瘧、抗炎、解熱、鎮(zhèn)痛、抗病毒、抗菌等作用[19]。近年來發(fā)現其具有抗炎及免疫調節(jié)作用而廣泛應用于紅斑狼瘡、類風濕關節(jié)炎等治療。已有研究證實，青蒿素的藥理作用機制與Wnt/β-Catenin、NF-κB、RasMAPK、PPAR、Notch等信號通路相關[20-21]，這些通道都與成骨細胞、破骨細胞的分化增殖、功能調節(jié)密切相關，特別是對成骨細胞調控相關信號通道的影響。實驗結果表明，與生理鹽水組、潑尼松組相比，青蒿素組骨小梁數量、骨體積分數、連接性骨密度、骨組織骨密度、斷裂載荷、最大載荷、彈性載荷等均明顯增加(P＜0.05)，骨小梁分離度與結構模型指數均明顯減少(P＜0.05)，與健康對照組比較，青蒿素組腰椎微結構與生物力學腰椎壓縮性能等指標的差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。說明青蒿素改善 SLE所致的骨量減少、連接密度與小梁密度明顯下降、骨吸收明顯增加等骨微結構和生物力學腰椎壓縮性能，骨代謝正常，且有效阻止 SLE導致的小鼠骨量丟失，顯著抑制其骨吸收增加，不降低骨形成。

綜上所述，青蒿素改善 SLE所致的骨微結構惡化和骨生物力學壓縮性能下降，阻止 SLE導致的小鼠骨量丟失。文章主要研究二氫青蒿素的作用，實驗設計中只有1個劑量組。本實驗是預實驗，目的是初步觀察二氫青蒿素對 SLE小鼠骨損害的防治作用。本文中二氫青蒿素的劑量是根據臨床上二氫青蒿素治療 SLE的劑量換算而來。根據本實驗的結果，我們下一步接著要做二氫青蒿素高、中、低劑量對 SLE骨損害的干預作用，篩選出最佳使用劑量范圍，為其臨床合理應用提供依據。