方炳雄，劉 琪，秦澤鴻，殷素華，李瑞芹，阮 杰（廣東省普寧市人民醫(yī)院 .檢驗(yàn)科，.婦產(chǎn)科，.病理科，廣東普寧 5500；4.廣東醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣東東莞 5808）

人乳頭瘤病毒(HPV)具有嗜上皮細(xì)胞性，可導(dǎo)致人皮膚黏膜多種良性和惡性疾病。目前已報(bào)道多種HPV亞型，其中有 30多種亞型已證實(shí)能導(dǎo)致癌前病變，根據(jù)其致病性的強(qiáng)弱，分為高危型和低危型兩大類型，其中高危型是女性宮頸癌的主要致病因素。大多數(shù) HPV感染無癥狀，90%感染 HPV者會(huì)自行清除病毒；另外5%～10%會(huì)重復(fù)感染和持續(xù)感染，增加患癌癥的風(fēng)險(xiǎn)[1]。研究報(bào)道全球女性每年新確診宮頸癌發(fā)病 53萬例[2]，其中我國每年宮頸癌新發(fā)病例超 13萬[3]，2015年死亡病例數(shù)為3.05萬[4]。宮頸癌早期一般無癥狀，大多數(shù)患者可通過常規(guī)篩查、HPV疫苗接種和對(duì)癌前病變治療來預(yù)防。但全球許多地區(qū)對(duì)宮頸癌的篩查不足，其仍然是全球第四常見的女性癌癥。因此，女性 HPV基因分型篩查非常重要，為 HPV疫苗開發(fā)及癌變患者早預(yù)防和早治療提供參考依據(jù)。本文收集19178例女性標(biāo)本，檢測(cè)其 HPV的 21種常見亞型的感染情況，及其中8399例女性的陰道脫落細(xì)胞液基薄層細(xì)胞學(xué)檢測(cè)(TCT)，分析宮頸病變與HPV基因亞型感染之間的關(guān)系，以期為宮頸癌的早期篩查和臨床診療工作提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

收集2016年11月至2019年12月在我院接受HPV分型檢查的19178例女性的臨床資料為研究對(duì)象，年齡1～97歲。各年齡段受檢人數(shù)如下，≤ 20歲的442例，21～30歲的5446例，31～40歲的5595例，41～50歲的5358例，51～60歲的1739例，≥ 61歲的598例。其中8399例女性同時(shí)進(jìn)行了 TCT檢查。本項(xiàng)目研究通過醫(yī)院的倫理委員會(huì)審批同意。

1.2 主要設(shè)備與試劑

陰道脫落細(xì)胞 DNA提取試劑盒、HPV雜交試劑盒和核酸分子快速導(dǎo)流雜交儀由廣東凱普生物科技有限公司提供；定性 PCR儀由杭州生物技術(shù)有限公司提供；本項(xiàng)目檢測(cè)范圍為 HPV 21種亞型，分別是高危型：16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66和68亞型；低危型：6、11、42、43、44和81亞型。

1.3 HPV-DNA分離提取及HPV亞型檢測(cè)

按照檢測(cè)試劑說明書的步驟進(jìn)行HPV-DNA分離提取及亞型檢測(cè)。(1)DNA分離提?。菏占幍烂撀浼?xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，煮沸法提取 DNA；取DNA溶液進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。(2)目標(biāo)片段行 PCR擴(kuò)增：PCR產(chǎn)物 4℃保溫待用。(3)導(dǎo)流雜交：熱變性的單鏈DNA與雜交膜上的探針雜交，進(jìn)行酶反應(yīng)。(4)結(jié)果判讀：顯示藍(lán)紫色為陽性，每次實(shí)驗(yàn)需要質(zhì)控陽性，再判讀標(biāo)本結(jié)果。

1.4 細(xì)胞學(xué)檢查

應(yīng)用液基細(xì)胞學(xué)檢查方法(TCT)進(jìn)行女性宮頸脫落細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查。分類診斷結(jié)果為：(1)未見宮頸上皮病變或惡性改變(NILM)；(2)未明確診斷的非典型鱗狀上皮細(xì)胞(ASC-US)；(3)低級(jí)別宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變(LSIL)；(4)高級(jí)別宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變(HSIL)；(5)宮頸上皮細(xì)胞癌(CIN)，包括 CINⅠ、CINⅡ和CINⅢ；(6)宮頸癌，包括浸潤性宮頸癌(ICC)、鱗狀細(xì)胞癌(SCC)、腺癌(AC)和非典型腺細(xì)胞(AGC)。ASC-US以上病變?yōu)榧?xì)胞學(xué)檢查陽性，其中 LSIL、HSIL、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、ICC、SCC、AC和AGC統(tǒng)一歸為癌變組。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS19.0軟件和EXCEL2017對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料用百分率表示，采用χ2檢驗(yàn)比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HPV感染情況

19178例患者標(biāo)本中，HPV陽性感染率為16.94%(3248/19178)，由于存在多重基因感染，亞型累計(jì)檢出率23.43%(4494/19178)，其中單一基因、二重基因、三重基因和四重及以上基因感染率依次為12.48%(2394/19178)、3.12%(599/19178)、0.90%(172/19178)和0.43%(83/19178)，單純高危型、單純低危型和高低?；旌闲透腥韭史謩e為12.94%、2.22%和1.77%。

2.2 HPV基因亞型分布

15種高危型HPV和6 種低危型HPV均有檢出，高危亞型和低危亞型的累計(jì)檢出率分別為81.55%(3665/4494)和18.45%(829/4494)。其中最常見的高危亞型依次是 HPV52(16.78%)、HPV16(11.53%)、HPV58(9.32%)、HPV39(6.34%)、HPV53(6.23%)和HPV18(5.43%)，最常見的低危亞型是HPV6(5.81%)和HPV81(5.18%)。具體結(jié)果如圖1 所示。

2.3 不同年齡段HPV感染情況分析

≤ 20歲、21～30歲、31～40歲、41～50歲、51～60歲和≥ 61歲的總感染率依次為37.33%、18.73%、14.37、15.02%、18.11%和23.24%?！?20歲組的總感染率、單一基因、二重基因、單純高危型及高低?；旌细腥韭示哂?1～60歲各年齡組(P＜0.01)?！?1歲組的總感染率、單一基因及單純高危型感染率均高于21～60歲年齡段(P＜0.05)。如表1 和圖2 所示。

2.4 TCT檢查結(jié)果與HPV感染的關(guān)系

TCT結(jié)果顯示，總陽性率為6.04%(507/8399)，包括非典型鱗狀上皮細(xì)胞(ASC-US)組陽性率為5.20%(437/8399)和癌變率為0.83%(70/8399)。與HPV感染關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)，癌變組的 HPV感染率(71.43%)最高，ASC-US組(32.72%)的次之，宮頸正常(NILM)組(15.46%)最低，且 3組之間感染率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。3組均以高危型和單一基因感染為主，且癌變組的單一基因和高危型感染率明顯高于ASCUS組和NILM組(P＜0.05)。結(jié)果如表2 所示。

圖1 HPV基因亞型分布

表1 不同年齡段HPV感染情況例(%)

表2 8399例患者進(jìn)行TCT檢測(cè)與HPV感染的關(guān)系例(%)

圖2 不同年齡段HPV感染趨勢(shì)

3 討論

HPV是一種嗜上皮細(xì)胞病毒，其持續(xù)、重復(fù)感染是宮頸癌發(fā)生的重要原因之一 [5]。早期篩查是目前預(yù)防和早期診斷宮頸癌的主要方法。在不同地區(qū)和人群中，HPV的感染率及亞型分布不同。我國經(jīng)濟(jì)條件和生活習(xí)慣差異大，使得性傳播疾病和癌癥相關(guān)的 HPV感染表現(xiàn)出地域和人群差異。因此，為了制定適合特定地區(qū)和人群的宮頸癌防控策略，實(shí)現(xiàn)科學(xué)預(yù)防的目標(biāo)，各地開展 HPV篩查工作及研究具有重要價(jià)值。

本文回顧性分析了粵東地區(qū)2016年11月至2019年12月進(jìn)行 HPV篩查的19178例女性感染情況發(fā)現(xiàn)，HPV總感染率為16.94%，低于2019年韶關(guān)地區(qū)(25.32%)[6]和2020年深圳地區(qū)(29.12%)[7]。略高于2019年一項(xiàng) meta分析報(bào)道的中國大陸城市女性感染率14.1%和農(nóng)村女性感染率15.7%[4]。在感染形式上，本地區(qū)的單一基因、二重基因、三重基因和四重及以上基因感染率依次為12.48%、3.12%、0.90%和0.43%，單純高危型、單純低危型和高低?；旌闲透腥韭史謩e為12.94%、2.22%和1.77%，說明本地區(qū)女性 HPV感染以單一基因和高危亞型為主。所檢測(cè)的 21種基因亞型均有檢出，高危亞型和低危亞型的累計(jì)檢出率各占81.55%和18.45%，前者遠(yuǎn)高于后者，所以更應(yīng)該重視 HPV高危亞型的篩查。在陽性標(biāo)本中，HPV52(16.78%)、HPV16(11.53%) 和HPV58(9.32%)構(gòu)成比明顯高于其他亞型，提示這 3種高危亞型是易感型，與我國各地報(bào)道較為一致[4,6-8]。韋夢(mèng)娜等[5]2020年的一項(xiàng) meta分析顯示，不同級(jí)別宮頸病變中 HPV型別分布有差異，最常見的前 3位，宮頸癌中為 HPV16/18/58，CIN3和CIN2中均為HPV16/58/52，CIN1中為 HPV16/52/58，提示我們應(yīng)該重點(diǎn)關(guān)注這3 種亞型感染的人群，加強(qiáng)防范和相關(guān)疫苗的研制及預(yù)防接種。

本地區(qū)研究的19178女性年齡范圍為1～97歲，其中21～60歲人數(shù)為18138人，約占95%的比例，說明該年齡段的女性對(duì)于 HPV感染的篩查意識(shí)較強(qiáng)，有利于宮頸病變的早發(fā)現(xiàn)和早治療。在本文所分的6個(gè)年齡段中，≤ 20歲組的總感染率、單一基因、二重基因、單純高危型及高低?；旌细腥韭示哂?1～60歲各年齡組(P＜0.01)?！?61歲組的總感染率、單一基因及單純高危亞型感染率均高于21～60歲年齡段(P＜0.01)。HPV感染率隨著年齡增加呈現(xiàn)“ U”型趨勢(shì)，即 40歲之前感染率呈下降趨勢(shì)，41歲之后感染率呈上升趨勢(shì)。提示≤ 20歲和≥ 61歲是 HPV感染的高危人群，而本地區(qū)這兩個(gè)年齡段的篩查人數(shù)僅占 5%，本文作者以往研究本地區(qū)男性HPV的感染情況，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)年齡段男性人群的篩查人數(shù)少和感染率高的情況[9]，故應(yīng)該提高此類人群的早期篩查意識(shí)。

對(duì) HPV感染篩查中的8399人同時(shí)進(jìn)行了 TCT檢測(cè)，其中7892例 TCT結(jié)果顯示宮頸正常(NILM)組，437例表現(xiàn)為未明確診斷的非典型鱗狀上皮細(xì)胞(ASC-US)組，70例發(fā)生宮頸病變(癌變組)，病變率為0.83%。與HPV感染相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，癌變組的HPV陽性率、高危型和單一基因感染率明顯高于ASC-US組和NILM組，各組之間的多重感染率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示隨著宮頸病變程度的增加，HPV高危型感染陽性率呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)，多重感染與疾病嚴(yán)重程度不相關(guān)。證實(shí) HPV高危亞型感染增加了宮頸癌變的機(jī)率，與相關(guān)的研究報(bào)道一致[10]。

本文對(duì)近3 年多粵東地區(qū)進(jìn)行 HPV篩查的數(shù)據(jù)分析，為了解本地區(qū)女性宮頸感染和病變提供了有用資料。研究揭示了 HPV感染在本地區(qū)女性人群較為普遍，特別是≤ 20歲和≥ 61歲年齡段的女性 HPV感染率高，這可能與女性的陰道內(nèi)部微環(huán)境不穩(wěn)定、正常菌群失調(diào)、造成局部免疫功能異常有關(guān)[11]，但其篩查人數(shù)少，應(yīng)該提高此類人群的早期篩查意識(shí)。TCT檢查也提示宮頸病變的女性 HPV總感染率和高危亞型感染率明顯高于宮頸組織正常的女性。故在女性人群中開展 HPV感染篩查很有必要，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)本地區(qū)各個(gè)年齡段女性的 HPV篩查，為宮頸癌的早發(fā)現(xiàn)和早治療提供保障。