呂靜 劉超 李可佳 周曉慧 薛晶 王明娟

(承德醫(yī)學(xué)院 1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,河北 承德 067000;2附屬醫(yī)院心臟內(nèi)科;3形態(tài)學(xué)實驗中心)

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一，近年來發(fā)病率呈上升趨勢，且晚期、復(fù)發(fā)性子宮內(nèi)膜癌預(yù)后極差，臨床治療十分困難〔1，2〕。因此尋找特異性強的分子標志物及子宮內(nèi)膜癌致病機制的確切靶點用于子宮內(nèi)膜癌的早期診斷和治療尤為重要。長鏈非編碼RNAs(LncRNAs)是一類不具有編碼蛋白質(zhì)功能，核苷酸長度>200 nt的RNA分子，在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，是潛在的腫瘤標志物及治療靶點〔1，3，4〕。LncRNA-ATB位于人類第13、14、22號染色體上，研究發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中異常表達，如肝細胞癌〔5〕、肺小細胞癌〔6〕、結(jié)腸癌〔7〕、乳腺癌〔8〕等。但其對子宮內(nèi)膜癌細胞生物學(xué)行為的影響尚未見報道。本研究通過靶向抑制子宮內(nèi)膜癌細胞內(nèi)LncRNA-ATB的表達，觀察LncRNA-ATB對子宮內(nèi)膜癌細胞增殖能力、凋亡水平、遷移和侵襲能力的影響，以期為尋找早期診斷子宮內(nèi)膜癌的分子標志物及其治療的確切靶點提供有價值的理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞株購自南京凱基生物公司，人子宮內(nèi)膜癌HEC-1-A細胞株購自北京北納聯(lián)創(chuàng)公司，RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購自Gibco公司，McCoy 5A培養(yǎng)基購自中科邁晨，TRIzol試劑、Lipofectamine2000、熒光定量PCR試劑盒購自美國Invitrogen公司，二甲基亞砜(DMSO)、噻唑藍(MTT)、胰蛋白酶-二氨基聯(lián)苯胺(EDTA)消化液(0.25%)、胰蛋白酶(0.25%，不含EDTA和酚紅)，磷酸鹽緩沖液(PBS)購自Solarbio公司，F(xiàn)ITC標記的Annexin-V及碘化丙啶(PI)試劑購自美國BD公司，Transwell小室購自美國Corning公司，LncRNA-ATB-SiRNA及LncRNA-ATB-NC由上海吉瑪公司設(shè)計并合成，RNA逆轉(zhuǎn)錄和實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒購自日本TaKaRa公司。

1.2實驗分組 LncRNA-ATB干擾組(ISK-siRNA組和HEC-siRNA組)：轉(zhuǎn)染LncRNA-ATBsiRNA；陰性對照組(ISK-NC組和HEC-NC組)：轉(zhuǎn)染LncRNA-ATB-NC；空白對照組(ISK組和HEC組)：僅以10%FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞。

1.3轉(zhuǎn)染 將Ishikawa細胞、HEC-1-A細胞分別常規(guī)培養(yǎng)于含10%FBS的培養(yǎng)基中，取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。將細胞密度調(diào)整為5×105/ml，將Ishikawa細胞、HEC-1-A細胞分別接種于6孔板，接種24 h后，細胞密度達到60%～70%，按照實驗分組進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染試劑的配制參照Lipofectamie2000說明書。轉(zhuǎn)染5 h后更換為含10%FBS的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4qRT-PCR檢測細胞中LncRNA-ATB mRNA的表達水平 轉(zhuǎn)染24 h后，TRIzol法分別提取細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA作為模板。LncRNA-ATB引物上游序列：5′-TCCTGGCTGTGGACTGGCTA-3′，下游序列：5′-TGTATCAACTCAGGCTCTGTGCTTC-3′，擴增產(chǎn)物長度：133 bp。內(nèi)參GAPDH引物上游序列：5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游序列：5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′，擴增產(chǎn)物長度：138 bp。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃、15 min，變性95℃、10 s，退火60℃、30 s，40個循環(huán)，重復(fù)3次。用2-△△Ct方法計算目的基因表達量。

1.5MTT法檢測細胞增殖能力 取對數(shù)生長期細胞，調(diào)整細胞密度為5×105/ml，接種于96孔板，24 h后進行轉(zhuǎn)染，每組設(shè)置3個復(fù)孔，并設(shè)置調(diào)零孔，邊緣孔加入PBS。分別于轉(zhuǎn)染后24、48、72 h每孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h，終止培養(yǎng)，吸除孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 μl DMSO，震蕩溶解，酶標儀檢測490 nm處吸光度(OD)值。

1.6Annexin V-FITC/PI細胞凋亡率檢測 收集轉(zhuǎn)染后48 h各組細胞，PBS清洗2遍，胰酶消化(無EDTA)，1 000 r/min離心5 min，棄培養(yǎng)液，加入2 ml PBS輕輕吹打，混勻，過篩網(wǎng)入另一組流式管，1 000 r/min離心5 min，棄PBS，加入100 μl緩沖液、5 μl FITC、5 μl PI輕混，室溫避光反應(yīng)15 min，再加入400 μl緩沖液，進行流式細胞儀檢測。

1.7Transwell小室檢測遷移能力 收集轉(zhuǎn)染24 h的各組細胞，PBS沖洗2遍，胰酶消化，培養(yǎng)液終止消化，離心，棄培養(yǎng)液，PBS清洗2遍，基培重懸，調(diào)整細胞密度為5×105/ml。每孔上室加入200 μl單細胞懸液，下室加入600 μl含20%FBS培養(yǎng)液。將小室放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h。取出小室，PBS沖洗2遍，4℃預(yù)冷的甲醛固定30 min，風(fēng)干，0.1%結(jié)晶紫染色15 min，棉簽擦去上層未遷移細胞，倒置顯微鏡下隨機觀察5個視野細胞數(shù)量計數(shù)，取平均值，實驗重復(fù)3次。

1.8Transwell小室檢測侵襲能力 將預(yù)置膠的Transwell小室從-20℃冰箱中取出，于上室和下室中分別加入500 μl基培，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中水化2 h。加入細胞懸液后在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育30 h，其余實驗方法同遷移實驗。

1.9統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS19.0軟件進行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染24 h后各組細胞中LncRNA-ATB mRNA的表達水平 Ishikawa中ISK-siRNA組LncRNA-ATB mRNA相對表達水平(0.167±0.050)顯著低于ISK-NC組(0.923±0.066)和ISK組(1.000±0.000，P<0.05)，ISK-NC組和ISK組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；HEC-1-A細胞中HEC-siRNA組LncRNA-ATB mRNA相對表達水平(0.035±0.012)低于HEC-NC組和HEC組(0.968±0.056，1.000±0.000)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，HEC-NC組和HEC組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.2MTT檢測轉(zhuǎn)染24、48、72 h后各組細胞增殖活性比較 ISK-siRNA組48、72 h OD值顯著低于ISK-NC組(P<0.05)，見圖1； HEC-siRNA組24、48 h OD值顯著低于HEC-NC組(P<0.05)，見圖2。

與ISK-NC組比較：1)P<0.05圖1 LncRNA-ATB對Ishikawa細胞增殖的影響

與HEC-siRNA組比較：1)P<0.05圖2 LncRNA-ATB對HEC-1-A細胞增殖的影響

2.3各組細胞凋亡率比較 ISK-siRNA組細胞總凋亡率為(21.990±1.265)%，ISK-NC組為(6.870±1.128)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。HEC-siRNA組細胞總凋亡率為(18.027±1.585)%，HEC-NC組為(9.090±1.896)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖3，圖4。

圖3 LncRNA-ATB對Ishikawa細胞凋亡的影響

圖4 LncRNA-ATB對HEC-1-A細胞凋亡的影響

2.4各組細胞遷移能力比較 遷移實驗結(jié)果顯示，ISK-siRNA組細胞穿膜細胞數(shù)〔(19.1±3.0)個〕少于ISK-NC組〔(34.4±2.4)個〕，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；HEC-siRNA組細胞穿膜細胞數(shù)〔(22.8±2.2)個〕少于HEC-NC組〔(45.9±2.8)個〕，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖5，圖6。

圖5 LncRNA-ATB對Ishikawa細胞遷移的影響(0.1%結(jié)晶紫染色，×200)

2.5各組細胞侵襲能力比較 侵襲實驗結(jié)果顯示，ISK-siRNA組細胞穿膜細胞數(shù)〔(15.8±2.2)個〕少于ISK-NC組〔(31.0±3.8)個〕，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖7；HEC-siRNA組細胞穿膜細胞數(shù)〔(20.5±2.3)個〕少于HEC-NC組〔(40.7±3.1)個〕，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖8。

圖8 LncRNA-ATB對HEC-1-A細胞侵襲的影響(0.1%結(jié)晶紫染色，×200)

3 討 論

近來研究表明，LncRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮促癌或抑癌的作用，參與了細胞增殖、凋亡調(diào)控及腫瘤浸潤與轉(zhuǎn)移等〔9〕。LncRNA-ATB全長2 446 nt，位于人14號染色體上，相關(guān)研究表明，LncRNA-ATB在多種腫瘤細胞中異常表達，并調(diào)控腫瘤細胞的增殖、凋亡及遷移、侵襲等生物學(xué)特性〔10，11〕。Shi等〔8〕研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)LncRNA-ATB的表達可抑制曲妥珠單抗耐藥SKBR-3細胞的增殖并促進SKBR-3細胞的凋亡。趙偉等〔12〕通過LncRNA-ATB-shRNA有效沉默LncRNA-ATB在人淋巴瘤Ragi中的表達后，發(fā)現(xiàn)細胞增殖能力受抑制，凋亡能力提高，細胞周期停滯在G1期。本研究利用siRNA干擾載體沉默LncRNA-ATB構(gòu)建了LncRNA-ATB低表達子宮內(nèi)膜癌細胞Ishikawa、HEC-1-A細胞株，結(jié)果表明LncRNA-ATB可能作為癌基因，以相同的作用機制促進子宮內(nèi)膜癌細胞增殖，抑制其凋亡。

上皮細胞間質(zhì)化(EMT)是上皮細胞向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化的過程，是腫瘤細胞獲得侵襲和遷移能力的主要步驟〔13〕，當腫瘤細胞發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移時，EMT可誘導(dǎo)腫瘤細胞獲得耐凋亡、免疫豁免等干細胞特性，上皮細胞失去細胞間連接，細胞內(nèi)細胞骨架重構(gòu)，細胞的運動性增加，從而促進腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。EMT時表現(xiàn)為維持細胞上皮性基因表達降低，如細胞黏附因子(E-cadherin)，而表現(xiàn)細胞間葉性質(zhì)的基因上調(diào)，如波形蛋白(Vimentin)、鈣黏素(N-cadherin)〔14〕。研究證明miR-141-3P靶向抑制TM4SF1的表達進而抑制胰腺癌細胞的遷移與侵襲，乳腺癌細胞中miR-141-3P也有同樣的作用〔15〕。ZEB1可以減少基底膜的合成，同時激活基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)1、MMP9、MMP14的表達，從而促進基底膜的重塑和細胞對周圍組織的侵襲〔16〕。體外實驗證明miR-200c高表達可以通過抑制靶基因ZEB1影響細胞EMT作用。LncRNA-ATB通過競爭性結(jié)合抑制miR-141-3P表達，促進EMT相關(guān)因子N-cadherin、Vimentin、ZEB1和ZEB2表達，并抑制EMT相關(guān)因子E-cadherin表達，促進EMT發(fā)生，增強乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移能力〔17〕。本研究結(jié)果推測LncRNA-ATB增強子宮內(nèi)膜癌細胞轉(zhuǎn)移侵襲能力有可能是通過競爭性結(jié)合并抑制miR-141-3P/miRNA-200c的表達，促進腫瘤的EMT而實現(xiàn)。

綜上，LncRNA-ATB可以調(diào)控促進子宮內(nèi)膜癌細胞增殖、抑制凋亡并增強其轉(zhuǎn)移侵襲能力，此研究結(jié)果將為子宮內(nèi)膜癌轉(zhuǎn)移的臨床治療提供重要的理論和實驗依據(jù)，但其確切的分子機制還有待進一步研究。