侯金偉，陳燾，南志標(biāo)

（蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州大學(xué)草地微生物研究中心，蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅蘭州730020）

土壤種子庫是指存在于土壤表面以及土壤中的全部種子的總和，其在植被更新與生態(tài)恢復(fù)等過程中發(fā)揮著重要作用［1-3］。然而，除了少數(shù)種子能夠成功萌發(fā)外，土壤種子庫中大多數(shù)種子在生物以及非生物因素的作用下最終死亡［4-6］。大量研究表明，除年齡老化導(dǎo)致生理死亡外，由捕食者和病原真菌侵染導(dǎo)致的死亡是土壤種子庫衰減的重要原因［7-10］。一般認(rèn)為，土壤表面或上層種子更容易受捕食者的影響，而土壤中的種子更容易受病原真菌的影響［11］。目前，國外已有大量研究探討了病原真菌對(duì)土壤種子庫的影響［8-10］，但是國內(nèi)尚未見報(bào)道。

另外，負(fù)密度依賴假說［12-13］表明，種子的存活以及幼苗的建植與土壤種子的密度密切相關(guān)，即在熱帶雨林中，靠近母株周圍幼苗不易存活，這可能是由于母株周圍種子密度高，更容易受到專一病原真菌的侵染。目前，大量野外試驗(yàn)驗(yàn)證了該假說在森林生態(tài)系統(tǒng)中的有效性［14-18］，然而在草地中是否也存在負(fù)密度依賴假說，有待于進(jìn)一步的驗(yàn)證［19］。這主要是因?yàn)椴莸刂胁煌参锔到豢椩谝黄?，很難在種群水平確定病原真菌對(duì)幼苗或種子的負(fù)效應(yīng)。

本研究采用“種子埋藏-取回”的方法，即將一定數(shù)目的種子通過殺菌劑處理，并且以不同方式（單種或者不同種混合，以改變同種植物種子埋藏密度）裝入尼龍網(wǎng)袋后埋入土壤中，定期取回并觀察種子的存活情況，探討病原真菌對(duì)土壤種子存活的影響，以期為草地保護(hù)以及退化草地修復(fù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究地位于甘肅省環(huán)縣甜水堡鎮(zhèn)大梁洼村—蘭州大學(xué)草業(yè)科學(xué)野外試驗(yàn)站，地處鄂爾多斯臺(tái)地前沿的陜、甘、寧交接地段（37.12° N，106.82° E，海拔為1650 m）。年均氣溫 7.1 ℃，≥10 ℃的年均積溫2487.3 ℃，無霜期123 d，年日照時(shí)數(shù)2766.4 h，日照率62% 以上。多年平均降水量360 mm ，約70%的降水集中于6-9 月；年均蒸發(fā)量1993.3 mm，8 級(jí)大風(fēng)每年有38～85 d，多集中在冬春季，風(fēng)沙嚴(yán)重，屬黃土高原溝壑區(qū)典型的大陸型季風(fēng)氣候。該地區(qū)優(yōu)勢(shì)植物為茵陳蒿（Artemisia capillaris）、長芒草（Stipa bungeana）和胡枝子（Lespedeza davurica）［20］。其他常見植物有白草（Lespedeza davurica）、砂珍棘豆（Oxytropis racemosa）、阿爾泰狗娃花（Heteropappus alta?icm）、狗尾草（Setaria viridis）、野胡麻（Dodartia orientalis）、多裂委陵菜（Potentilla multifida）、二裂委陵菜（Po?tentilla bifurca）、乳漿大戟（Euphorbia esula）等。草地 4 月中下旬返青，6 月下旬至 8 月下旬進(jìn)入旺盛生長期，9 月中下旬開始枯黃。研究區(qū)在2001 年以前為公共放牧地，連續(xù)放牧多年，退化嚴(yán)重。

1.2 種子收集

本試驗(yàn)選取胡枝子、狗尾草和長芒草3 種植物種子作為試驗(yàn)材料（表1）。于2004 年6 月中旬（長芒草）和11月初（胡枝子和狗尾草）在試驗(yàn)站周圍采集3 種植物種子。收獲的種子帶回實(shí)驗(yàn)室晾干、清選干凈后保存于4 ℃冰箱，備用。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)設(shè)4 個(gè)處理，即3 物種×2 殺菌劑拌種（拌種和對(duì)照）×2 埋藏方式（單種和混合）× 2 埋藏時(shí)間（1 和3 個(gè)月），共24 個(gè)處理組合，每個(gè)處理組合重復(fù)10次，完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)。

表1 供試植物種子參數(shù)Table 1 Seed parameters of tested plant species

供試殺菌劑選用福美雙，是一種保護(hù)性廣譜殺菌劑，廣泛應(yīng)用于農(nóng)田與草地病害防治。經(jīng)預(yù)試驗(yàn)確定，胡枝子、狗尾草與長芒草殺菌劑拌種的適宜（指不影響種子發(fā)芽率的前提下，所能采用的最大殺菌劑劑量）濃度（質(zhì)量百分比）為0.7%，0.2%和0.9%。

用0.28 mm 的尼龍網(wǎng)（網(wǎng)眼大小能保證供試種子不外漏）制作10 cm×10 cm 種子袋。單種埋藏處理時(shí)每種子袋裝入60 粒同種種子，混合埋藏處理時(shí)每種子袋3 種種子各20 粒，共60 粒。每種植物挑選健康、飽滿的種子用于試驗(yàn)。殺菌劑處理的種子在裝入種子袋前用相應(yīng)的殺菌劑進(jìn)行拌種處理，以加無菌水?dāng)嚢柰瑯訒r(shí)間的種子作為對(duì)照。

1.4 種子袋埋藏與取回

在試驗(yàn)站周圍選取一塊地勢(shì)平坦、植被組成較為均一的草地作為試驗(yàn)小區(qū)。試驗(yàn)小區(qū)內(nèi)按照完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)布置樣點(diǎn)。于2005 年6 月初，在每個(gè)預(yù)設(shè)樣點(diǎn)埋入備好的種子袋，埋深約5 cm，做好標(biāo)識(shí)。種子袋之間間距約30 cm，共240 個(gè)種子袋。

在2005 年7 月初和9 月初分別取回種子袋，每次取回120 袋，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理。埋藏種子取回后，以下面幾種狀態(tài)存在：已萌發(fā)種子，完整種子，死亡種子和丟失種子［21］。統(tǒng)計(jì)每袋中各類種子數(shù)量，并且計(jì)算種子田間發(fā)芽率和死亡率。相關(guān)計(jì)算公式如下：

1.5 室內(nèi)發(fā)芽試驗(yàn)

對(duì)未萌發(fā)的完整種子進(jìn)行萌發(fā)試驗(yàn)。將種子用75%酒精處理1 min，0.1%NaClO 處理5 min，無菌水潤洗后均勻擺放于直徑12 cm 的培養(yǎng)皿（內(nèi)鋪雙層濾紙）中，置于20 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行發(fā)芽。每天適當(dāng)澆水保持濾紙濕潤；逐日統(tǒng)計(jì)，連續(xù)2 d 無發(fā)芽認(rèn)為發(fā)芽結(jié)束，計(jì)算種子室內(nèi)發(fā)芽率。計(jì)算公式如下：

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

植物種、埋藏方式、殺菌劑處理和埋藏時(shí)間對(duì)種子田間發(fā)芽率、死亡率以及室內(nèi)萌發(fā)率的影響采用廣義線性混合模型（generalized linear mixed models）分析。在后檢驗(yàn)中，不同處理之間的差異采用非參數(shù)檢驗(yàn)（Kruskal-Wallis test）進(jìn)行檢測。在統(tǒng)計(jì)分析之前，所有百分?jǐn)?shù)數(shù)據(jù)進(jìn)行平方根反正弦轉(zhuǎn)換。所有統(tǒng)計(jì)分析和制圖采用R 3.5.1 完成［22］。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子田間發(fā)芽率

廣義線性混合模型分析表明，植物種和埋藏時(shí)間對(duì)種子田間發(fā)芽率的影響最大，埋藏方式也有一定程度的影響，均達(dá)到顯著水平；殺菌劑處理對(duì)種子田間發(fā)芽率沒有顯著影響（表2）。另外，植物種和埋藏時(shí)間對(duì)種子田間發(fā)芽率的影響存在交互作用（表2）。3 種植物中，長芒草種子的田間發(fā)芽率最高，平均約為51.9%，顯著高于胡枝子和狗尾草，二者分別為14.6%和26.1%（圖1a～c）。隨著埋藏時(shí)間的增加，3 種植物種子田間發(fā)芽率顯著增加（圖1a～c）。另外，狗尾草種子混合埋藏后田間種子發(fā)芽率較單種埋藏有所提高，但未達(dá)到顯著差異；另外兩種植物不同埋藏方式對(duì)種子田間發(fā)芽率沒有顯著影響（圖1c）。

表2 植物種、埋藏方式、殺菌劑處理和埋藏時(shí)間對(duì)種子田間發(fā)芽率、死亡率以及取回后室內(nèi)萌發(fā)率影響的廣義線性混合模型分析Table 2 Results from generalized linear mixed models for the effects of plant species，sowing treatment，fungicide treatment，and burial time and their interactions on field germination，field mortality，and lab germination of burial seeds

2.2 種子田間死亡率

廣義線性混合模型分析表明，植物種、埋藏方式和殺菌劑處理對(duì)種子田間死亡率有顯著影響，埋藏時(shí)間對(duì)種子田間死亡率沒有顯著影響（表2）。另外，植物種和殺菌劑處理、埋藏方式和埋藏時(shí)間對(duì)種子田間死亡率的影響存在交互作用（表2）。3 種植物中，胡枝子種子的田間死亡率最低，平均約為1%，長芒草和狗尾草種子的田間死亡率分別為5.1%和4.4%（圖1d～f）。埋藏1 個(gè)月后，殺菌劑未處理和單種埋藏條件下長芒草和狗尾草種子的田間死亡率分別為12.5%和11.0%，顯著高于其他處理組合下兩種植物種子的死亡率（圖1e，f）。然而埋藏3 個(gè)月后，長芒草和狗尾草種子田間死亡率在不同處理組合之間沒有顯著差異（圖1e，f）。與之相比，胡枝子種子在埋藏1 和3 個(gè)月時(shí)，其種子死亡率在不同處理組合之間均無顯著差異（圖1d）。

2.3 種子室內(nèi)萌發(fā)率

廣義線性混合模型分析表明，植物種、埋藏時(shí)間和埋藏方式對(duì)種子室內(nèi)萌發(fā)率均有顯著影響，但是效應(yīng)依次減弱。而且，植物種和埋藏時(shí)間對(duì)種子室內(nèi)萌發(fā)率的影響存在交互作用（表2）。殺菌劑處理對(duì)種子室內(nèi)萌發(fā)率沒有顯著影響（表2）。3 種植物中，長芒草種子的室內(nèi)萌發(fā)率最高，平均約為64.3%，顯著高于狗尾草和胡枝子，二者的室內(nèi)萌發(fā)率分別為29.2%和5.9%（圖1g～i）。隨著埋藏時(shí)間的增加，胡枝子和狗尾草種子的室內(nèi)萌發(fā)率顯著下降，而長芒草種子的室內(nèi)萌發(fā)率卻顯著增加（圖1g～i）。在埋藏1 個(gè)月后，殺菌劑處理且混合埋藏條件下胡枝子和長芒草種子的室內(nèi)萌發(fā)率較高，顯著高于殺菌劑未處理且單種埋藏的種子（圖1g，h）。在埋藏3 個(gè)月后，殺菌劑處理且混合埋藏條件下狗尾草種子的室內(nèi)萌發(fā)率最高，顯著高于殺菌劑未處理且單種埋藏的狗尾草種子（圖 1i）。

3 討論

3.1 不同埋藏方式及殺菌劑拌種對(duì)種子田間發(fā)芽率的影響

圖1 不同播種方式、殺菌劑處理以及埋藏時(shí)間對(duì)胡枝子、長芒草、狗尾草種子田間發(fā)芽率、死亡率以及取回后種子在室內(nèi)萌發(fā)率的影響Fig. 1 Field germination and mortality in the burial period and lab germination after retrieval of seeds L. davurica，S. bungeana and S. viridis following fungicide treatment and buried in the field for 1 and 3 months in monoculture or mixture（n=10）

病原真菌侵染種子后，可通過釋放毒素或損傷種子膜結(jié)構(gòu)，進(jìn)而殺死或抑制種子的萌發(fā)［23-24］。Kirkpatrick等［25］研究發(fā)現(xiàn)，在馬鈴薯（Solanum tuberosum）葡萄糖瓊脂上接種交鏈孢（Alternariaspp.）后，一年生植物苘麻（Abutilon theophrasti）種子的發(fā)芽率降低了約92%。Chen 等［26］的研究也發(fā)現(xiàn)，在水瓊脂培養(yǎng)基上接種三線鐮刀菌（Fusarium tricinctum）后，后者菌絲體快速侵入萌發(fā)的長芒草和胡枝子種子，抑制了胚根的生長，從而在萌發(fā)初期殺死種子，降低了種子的萌發(fā)率。本研究發(fā)現(xiàn)不同埋藏方式下殺菌劑處理對(duì)3 種植物種子的田間發(fā)芽率沒有顯著影響。這一結(jié)果與Schafer 等［21］的研究結(jié)果一致，即殺菌劑處理并沒有提高無芒雀麥（Bromus inermis）和草地早熟禾（Poa pratensis）等一年生植物種子的萌發(fā)率。在另一項(xiàng)研究中，Leishman 等［6］研究發(fā)現(xiàn)，殺菌劑處理僅提高了天藍(lán)苜蓿（Medicago lupulina）種子的田間發(fā)芽率，而對(duì)另外3 種植物田旋花（Convolvulus arvensis）、百脈根（Lotus corniculatus）和歐洲黑莓（Rubus fruticosus）種子的萌發(fā)率沒有顯著影響。由此可見，在田間條件下，影響種子萌發(fā)的因素要比室內(nèi)條件復(fù)雜的多，除了病原真菌外，其他生物以及非生物因素（溫度變化、干濕交替等）也會(huì)影響種子的萌發(fā)［27-29］，從而抵消了病原真菌的效應(yīng)。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，3 種植物的田間發(fā)芽率隨著埋藏時(shí)間的增加顯著提高，可能是由于土壤水熱條件變化以及土壤顆粒的作用打破了部分種子的休眠［27-29］，從而提高了種子的萌發(fā)率。

3.2 不同埋藏方式及殺菌劑拌種對(duì)種子田間死亡率的影響

大量野外埋藏試驗(yàn)表明，添加殺菌劑能夠提高埋藏種子的存活率［6，9，30-31］。本研究發(fā)現(xiàn)不同埋藏方式及殺菌劑處理對(duì)3 種植物種子的田間死亡率影響不一。在埋藏1 個(gè)月時(shí)，單種埋藏及未添加殺菌劑條件下，長芒草和狗尾草種子的死亡率最高，而混合埋藏或者殺菌劑處理后兩種植物種子的死亡率均顯著降低。這一結(jié)果在一定程度上支持了負(fù)密度依賴假說，即單種埋藏條件下，由于同種植物種子密度較大，更容易受到病原真菌的侵染，而混合埋藏降低了單種植物種子的密度，從而降低了專一病原真菌在同種植物種子間的傳播，因此降低了種子的田間死亡率。然而，本研究在胡枝子種子上并未觀察到這一結(jié)果。事實(shí)上，胡枝子種子在田間的死亡率很低，平均不到1%。究其原因，可能與種子休眠特性有關(guān)。胡枝子屬于豆科植物，其種子具有很強(qiáng)的物理休眠。研究發(fā)現(xiàn)種皮是否透水是病原真菌入侵種子的關(guān)鍵［32］。處于物理休眠的胡枝子種子由于種皮不透水，因此可以有效抵御病原真菌的入侵。與之相比，長芒草和狗尾草種子雖具有生理休眠，但是室內(nèi)常溫條件下儲(chǔ)藏一段時(shí)間可有效破除種子休眠，因此更容易受到病原真菌的侵染而死亡［26］。

3.3 不同埋藏方式及殺菌劑拌種對(duì)種子室內(nèi)萌發(fā)率的影響

埋藏種子取回后進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)，其萌發(fā)率高低可在一定程度上反映種子埋藏后的生活力狀況。本研究發(fā)現(xiàn)殺菌劑處理后3 種植物種子室內(nèi)萌發(fā)率有所提高，而且混合埋藏下種子室內(nèi)萌發(fā)率高于單種埋藏，說明殺菌劑處理或者混合埋藏可提高種子的生活力。O’Hanlon-Manners 等［10］研究發(fā)現(xiàn)，殺菌劑處理后，白樺樹（Betula papyr?ifera）種子在室內(nèi)的萌發(fā)率顯著提高，本研究結(jié)果與此一致。在Mitschunas 等［31］的研究中，殺菌劑處理后多年生草本植物鴨茅（Dactylis glomerata）和牛至（Origanum vulgare）種子生活力分別增加了42%和57%。但是也有研究發(fā)現(xiàn)，殺菌劑處理對(duì)種子生活力的影響因種而異。如Leishman 等［6］研究發(fā)現(xiàn)，殺菌劑處理提高了天藍(lán)苜蓿和歐洲黑莓種子的生活力，但是對(duì)田旋花和百脈根種子的生活力沒有顯著影響。另外，本研究發(fā)現(xiàn)3 種植物種子室內(nèi)萌發(fā)率隨埋藏時(shí)間變化不同。長芒草種子室內(nèi)發(fā)芽率隨埋藏時(shí)間顯著提高，而胡枝子和狗尾草則隨埋藏時(shí)間顯著下降?？赡艿脑蚴情L芒草種子屬于短暫種子庫［33］，在野外埋藏一段時(shí)間后種子休眠基本上破除，因此取回后萌發(fā)率較高。與之相比，胡枝子和狗尾草更容易形成持久種子庫［34］，具有明顯的萌發(fā)循環(huán)，因此需要更長的時(shí)間破除休眠。

4 結(jié)論

1）殺菌劑處理顯著降低了長芒草和狗尾草種子的田間死亡率，而對(duì)胡枝子種子的死亡率沒有顯著影響，表明殺菌劑處理能顯著降低土壤種子的死亡率，但是效應(yīng)因植物種而異，可能與種子的休眠方式有關(guān)。

2）較單種埋藏相比，混合埋藏顯著降低了長芒草和狗尾草種子的田間死亡率，表明降低同種植物種子密度能夠降低種子的死亡率，可能是由于混合埋藏稀釋了病原真菌的效應(yīng)。