郭聰聰，沈永寶，史鋒厚

（1.江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院 風(fēng)景園林學(xué)院，江蘇 句容 212400；2.南京林業(yè)大學(xué) a.風(fēng)景園林學(xué)院；b.南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心；c.林學(xué)院；d.國(guó)家林業(yè)和草原局南方林木種子檢驗(yàn)中心，江蘇 南京 210037）

白皮松Pinus bungeana為松科Pinaceae 松屬Pinus的常綠針葉樹種，是東亞地區(qū)唯一的三針?biāo)?，是我?guó)特有樹種。其耐旱、耐寒、抗污染，并且觀賞價(jià)值高，在城市綠化和北方地區(qū)的荒山造林中廣泛應(yīng)用[1-2]。此外，它的球果和花粉是珍貴的中藥材，松脂為重要的化工原料，種子可食用。

種子萌發(fā)是一個(gè)復(fù)雜的生理過(guò)程，受自身內(nèi)部因子和外部環(huán)境因子的影響。每種因子都對(duì)發(fā)芽過(guò)程有特定的影響，通過(guò)單獨(dú)作用或者相互之間協(xié)同作用來(lái)調(diào)控種子的萌發(fā)[3]。溫度是影響種子萌發(fā)的重要環(huán)境因子，并且大多數(shù)物種需要適當(dāng)?shù)臏囟确秶蚪惶孀儨氐哪Ｊ揭詫?shí)現(xiàn)最大的萌發(fā)率。在一些植物中，種子的發(fā)芽習(xí)性還與種子的產(chǎn)生時(shí)間和散落時(shí)間有關(guān)，這是由種子成熟過(guò)程中母本植物所經(jīng)歷的環(huán)境條件以及散落后種子所經(jīng)歷的環(huán)境條件所引起的[4]。溫度可以直接作用于吸水和生理代謝反應(yīng)來(lái)調(diào)控種子萌發(fā)過(guò)程，從而影響種子的發(fā)芽率和萌發(fā)速率[5]。發(fā)芽率通常隨溫度升高到最佳溫度而線性增加，此后發(fā)芽率急劇下降[6-8]。溫度升高不僅影響種子發(fā)芽后的幼苗生長(zhǎng)，而且直接影響發(fā)芽過(guò)程。為了防止發(fā)芽后幼苗受損，種子中可能會(huì)發(fā)生某些生理反應(yīng)以應(yīng)對(duì)外界的高溫環(huán)境，產(chǎn)生熱抑制，發(fā)芽停止，當(dāng)遇到合適的溫度后立即發(fā)芽[9]。這種生態(tài)需求可以被視為植物的一種適應(yīng)性機(jī)制，以確保幼苗存活和生長(zhǎng)發(fā)育的有利條件[10]。此外，溫度還可以通過(guò)去除初生休眠或誘導(dǎo)次生休眠來(lái)調(diào)節(jié)種子萌發(fā)。如成熟脫落的青錢柳（Cyclocarya paliurus）種子在經(jīng)過(guò)冬季的自然低溫作用后，初生休眠已部分或完全解除，但在此過(guò)程中若遭遇不良環(huán)境條件（如中斷冷層積提高溫度），種子則再次進(jìn)入休眠狀態(tài)（二次休眠）[11]。

白皮松主要通過(guò)種子繁殖，以往文獻(xiàn)的相關(guān)研究多集中在種子休眠上[12-15]，如種胚的發(fā)育狀況、種皮透性問(wèn)題和萌發(fā)抑制物等方面，培養(yǎng)條件的設(shè)置通常為25℃，而種子萌發(fā)所需的環(huán)境條件并未引起足夠的重視。所以本文主要研究了白皮松種子萌發(fā)的適宜溫度條件，并探索了萌發(fā)過(guò)程中呼吸代謝途徑以及激素含量對(duì)外界溫度變化（適溫20℃和高溫25℃）所做出的響應(yīng)，這對(duì)白皮松種子繁育具有重要意義，并為種子萌發(fā)熱抑制的探索提供一定理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

新鮮的白皮松種子于2018年10月采于甘肅省天水市小隴山（34°05′～34°40′N，105°30～106°30′E，700～2 500 m）的天然白皮松林。球果晾干至種鱗開裂時(shí)，經(jīng)人工脫粒、水選以及棄去破損粒、蟲蛀粒和雜質(zhì)后，進(jìn)行不同溫度的萌發(fā)試驗(yàn)。種子含水量9.92%，生活力96%。

1.2 研究方法

1.2.1 種子萌發(fā)試驗(yàn)

試驗(yàn)設(shè)置5 個(gè)溫度分別為10、15、20、25 和30℃，每個(gè)處理3×100 粒種子，在蒸餾水中浸泡96 h 后擺放在濕潤(rùn)脫脂棉上，置于不同溫度的光照培養(yǎng)箱進(jìn)行萌發(fā)試驗(yàn)。在30 d 的培養(yǎng)過(guò)程中，每天觀察并記錄發(fā)芽種子數(shù)，胚根長(zhǎng)度≥2 mm 則視為種子萌發(fā)，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)計(jì)算發(fā)芽率、平均發(fā)芽時(shí)間（Mean germination time,MGT）以及發(fā)芽速率（Speed of germination,SG）。

式中：n為第t天萌發(fā)種子數(shù)。

1.2.2 種子萌發(fā)過(guò)程中呼吸代謝關(guān)鍵酶活性和激素含量測(cè)定

從上述不同溫度的萌發(fā)試驗(yàn)得出白皮松種子可以萌發(fā)的溫度范圍（15～20℃），超過(guò)該范圍則種子萌發(fā)受阻。而高溫與種子萌發(fā)呼吸方式和激素含量變化密切相關(guān)，溫度過(guò)高通常會(huì)降低吸脹種子中的溶氧量，影響種子呼吸作用。同時(shí)，低氧會(huì)影響ABA8'-羥化酶活性，干擾ABA 氧化分解代謝，進(jìn)而通過(guò)激素之間的互作效應(yīng)，參與種子萌發(fā)的調(diào)控[16-18]。所以試驗(yàn)設(shè)置了抑制萌發(fā)的高溫25℃（這也是以往研究通常采用的溫度）和適宜萌發(fā)的溫度20℃作為培養(yǎng)條件研究了種子萌發(fā)過(guò)程中呼吸途徑及激素變化，也在一定程度上揭示種子在高溫下萌發(fā)失敗的原因。

種子吸脹96 h 后置于濕潤(rùn)脫脂棉上進(jìn)行萌發(fā)試驗(yàn)。試驗(yàn)過(guò)程中每2 天取樣一次，14 d 時(shí)結(jié)束取樣。每次取樣后，隨機(jī)抽取3×40 粒種子，用小鉗子夾裂后去掉內(nèi)、外種皮，剝出種胚、胚乳切片混勻，分別稱取胚和胚乳各0.3 g，放入-80℃冰箱貯存待測(cè)各項(xiàng)生理指標(biāo)。磷酸己糖異構(gòu)酶（PGI）、G-6-PDH 和6-PGDH 聯(lián)合酶的活性測(cè)定參照Wary 和Brown 的方法[19]，蘋果酸脫氫酶（MDH）活性測(cè)定參照朱廣廉法[20]。內(nèi)源激素玉米素核苷（ZR）、生長(zhǎng)素（IAA）、赤霉素（GA3）和脫落酸（ABA）含量測(cè)定采用酶聯(lián)免疫法[20]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2010 軟件處理數(shù)據(jù)和繪制圖表，SPSS 19.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析、Duncan 多種對(duì)比和Pearson 相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度條件下種子的萌發(fā)

溫度對(duì)白皮松種子萌發(fā)具有顯著影響（P＜0.05），且不同溫度下種子的開始萌發(fā)時(shí)間也不同（圖1）。20℃下種子開始萌發(fā)時(shí)間最早，置床7 d 后種子開始萌發(fā)。15℃下種子從10 d 后開始萌發(fā)，而25℃和30℃下，少數(shù)種子從14 d 左右開始萌發(fā)。20℃下種子30 d 后最終發(fā)芽率為92.67%，顯著高于15℃下種子發(fā)芽率87.33%。20℃下種子的平均發(fā)芽時(shí)間和發(fā)芽速率分別為13.45 d、5.62%.d-1，均顯著優(yōu)于15℃中的平均發(fā)芽時(shí)間17.61 d 和發(fā)芽速率5.23%.d-1（圖2）。隨著溫度繼續(xù)升高，種子發(fā)芽率急劇降低，25℃和30℃下種子發(fā)芽率分別為5%和1%，且兩者平均發(fā)芽時(shí)間均大于20 d，發(fā)芽速率均小于1%.d-1。而10℃下則沒有種子萌發(fā)。

圖1 不同溫度下種子的萌發(fā)進(jìn)程Fig.1 Germination process of seeds at different temperatures

2.2 種子萌發(fā)過(guò)程中呼吸代謝關(guān)鍵酶活性變化

2.2.1 磷酸己糖異構(gòu)酶（PGI）活性變化

PGI 是糖酵解途徑（EMP）中六碳糖向丙酮酸轉(zhuǎn)化過(guò)程中的關(guān)鍵酶，其活性變化可以在一定程度上反映EMP 的活化程度。20℃下，白皮松種子中PGI 活性變化表現(xiàn)為初期有所降低而后維持穩(wěn)定狀態(tài)（圖3）。胚中PGI 活性0 d 時(shí)為171.06 U·g-1，2 天時(shí)降低至139.59 U·g-1，之后未有顯著變化（P＞0.05），至14 天時(shí)PGI 活性為138.85 U·g-1。胚乳中PGI 活性2 天時(shí)為100.69 U·g-1，較0 天降低了25.12 U·g-1，2～14 d 胚乳中PGI 活性無(wú)明顯變化，波動(dòng)范圍97.44～112.81 U·g-1；25℃下，種子內(nèi)PGI 活性始終保持在剛置床時(shí)的高活力水平，且始終高于20℃下種子PGI 活性。胚中PGI 活性波動(dòng)范圍162.29～171.06 U·g-1，胚乳中PGI 活性變化范圍102.03～128.83 U·g-1。表明該溫度下EMP途徑活化程度較高，種子可能主要經(jīng)由該途徑進(jìn)行呼吸作用。

圖2 不同溫度下種子的平均發(fā)芽時(shí)間與發(fā)芽速率Fig.2 MGT and SG at different temperatures

圖3 種子萌發(fā)過(guò)程PGI 活性變化Fig.3 Variations in PGI activity of seeds during germination process

2.2.2 蘋果酸脫氫酶（MDH）活性變化

MDH 是三羧酸循環(huán)（TCA）中催化蘋果酸脫氫生成草酰乙酸和NADH 的關(guān)鍵酶，它可以反映TCA 循環(huán)活化狀態(tài)，繼而反映種子內(nèi)部呼吸作用特征。20℃下，白皮松種子置床后，EMP 途徑產(chǎn)生的丙酮酸在氧氣充足條件下進(jìn)入線粒體轉(zhuǎn)入TCA 循環(huán)，6 天時(shí)胚與胚乳MDH 活性分別上升至12.20 U·g-1min-1和10.80 U·g-1min-1，約 是0 天酶活性的6 倍（圖4）。但該溫度下EMP 途徑產(chǎn)生的丙酮酸較少，TCA 循環(huán)反應(yīng)底物不足引起8 天時(shí)MDH 活性短暫下降。之后隨著丙酮酸不斷積累，14 天時(shí)胚與胚乳MDH 活性分別回升至18.98 U·g-1min-1和11.62 U·g-1min-1；25 ℃下，種子內(nèi)MDH 活性變化趨勢(shì)與20℃一致，但由于溫度過(guò)高造成種子中溶氧量減少，EMP 途徑產(chǎn)生的丙酮酸只有部分進(jìn)入TCA 循環(huán)，種子繼續(xù)維持以EMP 途徑為主的呼吸代謝方式，所以其MDH活性始終低于20℃下酶活性，14 天時(shí)胚與胚乳MDH 活性分別為6.29 U·g-1min-1和8.87 U·g-1min-1。

2.2.3 G-6-PDH 和6-PGDH 聯(lián)合酶活性變化

G-6-PDH 和6-PGDH 聯(lián)合酶是戊糖磷酸（PPP）途徑中葡萄糖在細(xì)胞質(zhì)中氧化分解的限速酶，其活性大小反映PPP 途徑的活化狀態(tài)。20℃下，PPP 途徑在白皮松種子置床后活化，G-6-PDH 和6-PGDH 聯(lián)合酶活性呈升高趨勢(shì)，6 天時(shí)胚中酶活性上升為68.93 U·g-1min-1（圖5）。隨著種子即將萌發(fā)，胚生長(zhǎng)需要大量NADPH 為細(xì)胞合成反應(yīng)提供還原力以及原料合成核苷酸和輔酶等物質(zhì)，PPP途徑隨之增強(qiáng)，14 天時(shí)胚中酶活性快速升高至143.47 U·g-1min-1，是0 d 酶活性的4.76 倍。與此同時(shí)，胚乳中PPP 途徑開始啟動(dòng)，14 天時(shí)酶活性提高至58.47 U·g-1min-1；25℃下，種子中G-6-PDH 和6-PGDH 聯(lián)合酶活性始終處于初始水平，胚和胚乳中酶活性變化范圍分別為22.07～33.00 U·g-1min-1和12.87～22.93 U·g-1min-1，可見該溫度下種子主要通過(guò)PPP途徑外的其他代謝途徑進(jìn)行呼吸作用。

圖5 種子萌發(fā)過(guò)程G-6-PDH 和6-PGDH 聯(lián)合酶活性變化Fig.5 Variations in G-6-PDH and 6-PGDH activities of seeds during germination process

2.3 種子萌發(fā)過(guò)程中內(nèi)源激素含量變化

2.3.1 玉米素核苷（ZR）含量變化

ZR 在白皮松種子胚與胚乳中初始含量較為接近，分別為2.63 ng/g 和2.97 ng/g（圖6）。20℃下，種子中ZR 含量隨萌發(fā)的進(jìn)行不斷升高，胚中ZR 含量在8 天時(shí)上升到4.23 ng/g。之后由于胚的生長(zhǎng)和細(xì)胞不斷分裂，ZR 含量繼續(xù)升高，12 天時(shí)ZR 含量達(dá)峰值5.24 ng/g，顯著高于0～8 d 的ZR含量（P＜0.05）。胚乳中ZR 含量6 天時(shí)上升至4.39 ng/g，顯著高于0 d 含量，14 天時(shí)ZR 含量達(dá)最大值5.36 ng/g；25℃下，種子中ZR 含量較0 d時(shí)略有上升，胚中ZR 含量在2～14 d 的變化范圍3.28～4.19 ng/g，各時(shí)間ZR 含量差異不顯著（P＞0.05）。2～14 d 胚乳ZR 含量波動(dòng)范圍3.73～4.86 ng/g，除第8 天外，其余各時(shí)間ZR 含量無(wú)明顯差異。

圖6 種子萌發(fā)過(guò)程ZR 含量變化Fig.6 Variations in ZR content of seeds during germination process

2.3.2 生長(zhǎng)素（IAA）含量變化

白皮松種子胚乳中IAA 含量均遠(yuǎn)高于胚中含量，是胚IAA 含量的3～4 倍（圖7）。20℃下，種子中IAA 含量隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸升高。剛置床時(shí)胚中IAA含量為9.64 ng/g，8 d時(shí)升高至12.15 ng/g。隨著萌發(fā)的推進(jìn)，14 天時(shí)IAA 含量升高至17.66 ng/g。胚乳中IAA 的變化趨勢(shì)與胚中相同，0～6 d 胚乳中IAA 含量緩慢上升為41.07 ng/g，之后IAA 含量繼續(xù)升高，14 天時(shí)上升為47.99 ng/g；25℃下，種子中IAA 含量始終低于20℃下IAA 含量。胚中IAA 含量除8 天時(shí)有所升高之外，其余時(shí)間IAA 含量相差不大，波動(dòng)范圍9.63～11.80 ng/g。胚乳中IAA 含量在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中無(wú)顯著變化（P＞0.05）。

圖7 種子萌發(fā)過(guò)程IAA 含量變化Fig.7 Variations in IAA content of seeds during germination process

2.3.3 赤霉素（GA3）含量變化

GA3在白皮松種子胚和胚乳中含量分布相差不大（圖8）。20℃下，胚中GA3含量在0～8 d呈波動(dòng)上升趨勢(shì)，且在6 天含量最高為4.22 ng/g。10～14 d GA3含量穩(wěn)步升高，14 天時(shí)達(dá)4.94 ng/g，顯著高于6 天時(shí)GA3含量（P＜0.05）；25℃下，在培養(yǎng)過(guò)程中胚中GA3含量略有所升高，最大值3.77 ng/g 在6 天時(shí)取得，僅比0 天提高了0.76 ng/g，且該溫度下胚中GA3含量始終低于20℃下胚中GA3含量。兩溫度下胚乳中GA3含量相差不大，均未有明顯升高趨勢(shì)，變化范圍為3.74～4.54 ng/g。

2.3.4 脫落酸（ABA）含量變化

白皮松種子胚乳中ABA 含量始終高于胚中含量，這表明ABA 在干燥種子中積累的主要位點(diǎn)是胚乳。在同一溫度下，胚與胚乳中ABA 含量變化趨勢(shì)基本一致（圖9）。20℃下，胚中ABA 含量在2 天后（47.21 ng/g）開始降低，8 天時(shí)顯著降低至39.94 ng/g（P＜0.05）。此后ABA 含量下降趨于緩慢，最小值32.14 ng/g 在12 天時(shí)取得。胚乳中ABA 含量整體上也呈下降趨勢(shì)，波動(dòng)范圍60.90～74.64 ng/g；25℃下，種子中ABA 含量隨時(shí)間延長(zhǎng)而升高。0～4 d，胚中ABA 含量緩慢上升，6 d 后ABA 含量顯著升高，14 天時(shí)含量上升至66.17 ng/g，是0 天時(shí)ABA 含量的1.57 倍。胚乳中ABA 含量也表現(xiàn)為升高趨勢(shì)，變化范圍65.76～80.70 ng/g。

圖8 種子萌發(fā)過(guò)程GA3 含量變化Fig.8 Variations in GA3 content of seeds during germination process

圖9 種子萌發(fā)過(guò)程ABA 含量變化Fig.9 Variations in ABA content of seeds during germination process

2.3.5 ZR/ABA、IAA/ABA 和GA3/ABA 比值變化

20℃下，白皮松種子中ZR、IAA 和GA3與ABA 的比值均隨萌發(fā)時(shí)間的延長(zhǎng)而升高（圖10）。胚中ZR/ABA、GA3/ABA 在12 d 時(shí)達(dá)峰值，IAA/ABA 在14 天時(shí)達(dá)最大值，分別顯著高于0～8 d的ZR、GA3、IAA 與ABA 的比值（P＜0.05）。胚乳中的ZR、IAA、GA3與ABA 的比值變化規(guī)律與胚中類似，整體上呈現(xiàn)上升趨勢(shì)；25℃下，胚中IAA/ABA、GA3/ABA 表現(xiàn)為下降趨勢(shì)，ZR/ABA 無(wú)明顯規(guī)律性變化。胚乳中IAA、GA3、ZR與ABA 的比值變化不明顯。

2.4 發(fā)芽率與各生理指標(biāo)之間的相關(guān)性分析

對(duì)白皮松種子萌發(fā)過(guò)程中的發(fā)芽率與各生理指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明不同溫度下種子的呼吸代謝關(guān)鍵酶活性以及激素含量在培養(yǎng)過(guò)程中均發(fā)生了相應(yīng)的改變，且以胚中代謝活動(dòng)較為強(qiáng)烈（表1～4）。20℃下，發(fā)芽率與胚中MDH、G-6-PDH 和6-PGDH 聯(lián)合酶活性之間表現(xiàn)為極顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01），且與后者的相關(guān)性更大（R2=0.860**）。表明這兩種酶在種子萌發(fā)呼吸途徑中具有重要作用，且以G-6-PDH 和6-PGDH 聯(lián)合酶所反映的PPP 途徑所占據(jù)的比例更大。另外，該溫度下種子中IAA、ZR 和GA3含量與發(fā)芽率之間呈現(xiàn)出極顯著的正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01），而ABA 含量與則發(fā)芽率之間極顯著負(fù)相關(guān)（R2=-0.679**）?？梢奍AA、ZR 和GA3在白皮松種子萌發(fā)中發(fā)揮著正向調(diào)節(jié)，而ABA 的作用則相反。25℃下，種子14 d 內(nèi)的發(fā)芽率不足1%，種子呼吸作用活動(dòng)微弱，發(fā)芽率與胚中PGI、MDH 和G-6-PDH 和6-PGDH聯(lián)合酶活性相關(guān)關(guān)系不明顯（P＞0.05）。

圖10 種子萌發(fā)過(guò)程ZR/ABA、IAA/ABA 和GA3/ABA比值變化Fig.10 Variations in ZR/ABA、IAA/ABA and GA3/ABA of seeds during germination process

表1 20℃下發(fā)芽率與胚生理指標(biāo)相關(guān)性分析?Table 1 Correlation analysis between germination and physiological indexes in embryos at 20℃

表3 25℃下發(fā)芽率與胚生理指標(biāo)相關(guān)性分析?Table 3 Correlation analysis between germination and physiological indexes in embryos at 25℃

表4 25℃下發(fā)芽率與胚乳生理指標(biāo)相關(guān)性分析?Table 4 Correlation analysis between germination and physiological indexes in endosperm at 25℃

3 討論與結(jié)論

3.1 種子萌發(fā)的適宜溫度

大多數(shù)亞熱帶和溫帶種子萌發(fā)對(duì)20～30℃之間的溫度變化敏感。如20～25℃為樟子松Pinus sylvestrisvar.mongolica和沙地云杉Picea Mongolica[22]種子萌發(fā)的最適溫度。鳳尾杉Wollemia nobilis）[23]和銀杏Ginkgo biloba[24]種子在25～30℃溫度范圍內(nèi)萌發(fā)最快。相對(duì)中等的溫度25℃適合很多植物種子萌發(fā)，如油松Pinus tabuliformis[25]、黃枝油杉Keteleeria davidianavar.calcarea[26]和江南油杉Keteleeria fortuneivar.cyclolepis[27]等。而白皮松種子則在更低的溫度范圍（15～20℃）內(nèi)萌發(fā)效果較好，并且對(duì)高溫敏感。在供試溫度中，白皮松種子15 和20℃下發(fā)芽率均較高，分別為87.33%和92.67%，且20℃下種子發(fā)芽速度更快。當(dāng)溫度升高到25 和30℃時(shí)，種子萌發(fā)被抑制，發(fā)芽率急劇降低至5%以下。類似的發(fā)芽習(xí)性在其他針葉樹種中也有發(fā)現(xiàn)，如阿勒頗松Pinus halepensis和土耳其松Pinus brutia種子的最佳發(fā)芽溫度范圍為15～20℃，更高的溫度則抑制發(fā)芽[28]。草本植物菠菜Spinacia oleracea[29]和豆科植物鳥爪豆Ornithopus pinnatus[30]種子萌發(fā)對(duì)溫度也極為敏感，被高溫所抑制。此外，在后續(xù)研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)白皮松種子從高溫條件轉(zhuǎn)移到較低溫度中時(shí)有生活力（＞80%）的種子無(wú)需任何處理即可快速萌發(fā)。當(dāng)萌發(fā)環(huán)境恢復(fù)到低溫時(shí)，高溫對(duì)Myrsine parvifolia種子萌發(fā)的抑制作用同樣也是可逆的[31]。高溫下種子萌發(fā)被抑制的這種溫度效應(yīng)稱為熱抑制或高溫抑制，特征是當(dāng)溫度略高于最佳條件時(shí)發(fā)芽率急劇降低，但區(qū)別于白蠟屬植物種子的二次休眠[32-33]。

3.2 不同萌發(fā)溫度下種子的呼吸代謝途徑

呼吸代謝的啟動(dòng)是種子吸脹后的早期事件，它促進(jìn)了相關(guān)代謝途徑的恢復(fù)和貯藏物質(zhì)的動(dòng)員，進(jìn)而推動(dòng)種子萌發(fā)。吸脹種子中有3 條比較活躍的代謝途徑，分別為糖酵解途徑（EMP）、三羧酸循環(huán)（TCA）以及戊糖磷酸途徑（PPP），不同的代謝途徑為種子萌發(fā)提供不同的原料、能荷和還原力。

EMP 在有氧和無(wú)氧條件下均可發(fā)生，糖類在細(xì)胞質(zhì)中經(jīng)此途徑分解代謝是呼吸作用產(chǎn)生能量的第一步。白皮松種子置床后，EMP 途徑首先被激活。25℃下，種子中PGI 活力水平較高，EMP維持高活化狀態(tài)。TCA 循環(huán)需要在有氧條件下才能將EMP 途徑產(chǎn)物丙酮酸進(jìn)一步氧化磷酸化[34]，而25℃下種子中溶解氧濃度下降，細(xì)胞內(nèi)O2含量不足，僅部分丙酮酸進(jìn)入TCA 循環(huán)，MDH 活性有所升高。在不利于萌發(fā)的高溫條件下，白皮松種子呼吸代謝緩慢，線粒體中ATP 的產(chǎn)生受到低氧條件限制，EMP 途徑占優(yōu)勢(shì)，TCA 循環(huán)雖然啟動(dòng)但比例不大，產(chǎn)生的少許能量用于維持種子“靜止”狀態(tài)。浦心春等指出休眠結(jié)縷草Zoysia japonica種子不能萌發(fā)是因?yàn)門CA 循環(huán)強(qiáng)度在萌發(fā)后期下降，種子中無(wú)足夠ATP 合成，細(xì)胞代謝反應(yīng)所需能量更多來(lái)源于無(wú)氧呼吸（EMP途徑）[35]。水稻Oryza sativa種子在缺氧或CO2濃度較高的環(huán)境中萌發(fā)時(shí)，幼胚生長(zhǎng)同樣會(huì)被抑制[36]。此外，白皮松種子EMP 途徑產(chǎn)生的丙酮酸可能在高溫低氧環(huán)境中部分進(jìn)入了發(fā)酵途徑，并伴隨酒精等有害物質(zhì)產(chǎn)生，種子腐爛率升高。

PPP 途徑是種子萌發(fā)中的另一個(gè)需氧過(guò)程，可將糖類不經(jīng)過(guò)EMP 途徑而直接氧化，為細(xì)胞生物分子構(gòu)建和核酸合成提供原料并產(chǎn)生大量NADPH[34]。20℃下，白皮松種子中碳水化合物經(jīng)過(guò)EMP 途徑初始降解后，在細(xì)胞內(nèi)氧氣充足條件下，呼吸途徑進(jìn)入大量產(chǎn)能的TCA 循環(huán)，MDH活性不斷升高。之后隨著營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不斷消耗以及PPP 途徑的出現(xiàn)，二者共同的反應(yīng)底物丙糖磷酸（丙酮酸的前體物質(zhì)）產(chǎn)量不足以繼續(xù)維持TCA 循環(huán)的高活力運(yùn)轉(zhuǎn)，MDH 活有所降低。與此同時(shí)，線粒體變得活躍，胚中G-6-PDH 和6-PGDH聯(lián)合酶活性大幅提高，貯藏物質(zhì)降解轉(zhuǎn)化為胚根突破種皮的能量，為細(xì)胞分裂提供所需的還原力和生物合成原料物質(zhì)，高效產(chǎn)能的PPP 途徑逐漸占據(jù)主導(dǎo)地位。可見，PPP 途徑的啟動(dòng)在白皮松種子萌發(fā)中發(fā)揮重要作用。水稻種子萌發(fā)時(shí)胚根和胚芽的正常生長(zhǎng)也與PPP 途徑增強(qiáng)相關(guān)[36]。隨著G-6-PDH 活性增強(qiáng)和PPP 途徑在糖代謝中比例越來(lái)越大，西洋參Panax quinquefolius[37]和圓齒野鴉椿Euscaphis konishii[38]種子從休眠轉(zhuǎn)向萌發(fā)。

種子萌發(fā)受呼吸代謝途徑的調(diào)控，而細(xì)胞內(nèi)呼吸代謝類型與速率又因外界環(huán)境條件的變化而發(fā)生改變。不同溫度下白皮松種子萌發(fā)時(shí)的呼吸代謝規(guī)律可以大致歸納為：20℃下，種子呼吸途徑以高效產(chǎn)能的PPP 途徑為主，同時(shí)EMP-TCA循環(huán)占據(jù)一定比例，且胚中呼吸代謝較為活躍；25℃下，氧在熱抑制溫度下溶解度降低，未萌發(fā)的種子在低氧條件下主要通過(guò)EMP 進(jìn)行呼吸代謝，TCA 循環(huán)雖然啟動(dòng)但比例不大。

3.3 溫度對(duì)種子萌發(fā)過(guò)程中內(nèi)源激素含量的影響

種子萌發(fā)過(guò)程受激素信號(hào)傳遞途徑的調(diào)節(jié)，植物激素為種子提供了將外界復(fù)雜信息傳遞給胚所需的強(qiáng)度和靈活性，其整合內(nèi)源信號(hào)和環(huán)境線索后，通過(guò)各激素之間相互作用來(lái)確定不同環(huán)境中種子萌發(fā)的發(fā)展?fàn)顟B(tài)。

ABA 在種子休眠和萌發(fā)中起著重要作用，ABA 營(yíng)養(yǎng)缺陷型通常表現(xiàn)出增強(qiáng)的萌發(fā)潛力并伴隨胎萌種子產(chǎn)生，而過(guò)量累積ABA 的突變體和轉(zhuǎn)基因株系則顯示休眠加深[39]。干燥白皮松種子中儲(chǔ)存的ABA 結(jié)合物在吸脹后水解，充當(dāng)游離ABA 的潛在來(lái)源，初期含量增加。ABA 分解需要充足的氧氣，適宜溫度20℃下，種子中溶氧量較高，胚中ABA 分解代謝強(qiáng)烈含量降低。25℃下，ABA 分解活動(dòng)在低氧環(huán)境中受到抑制，且當(dāng)種子感知到溫度太高不利于萌發(fā)時(shí)，胚中ABA 通過(guò)某種途徑進(jìn)行了新的生物合成，積累并維持在高水平以抑制胚根生長(zhǎng)，迫使種子處于“靜止”狀態(tài)?？梢?，白皮松種子具有響應(yīng)高溫調(diào)節(jié)ABA 含量的特定機(jī)制，并使用特定的ABA 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑進(jìn)行萌發(fā)抑制。擬南芥Arabidopsis thalianaABA 缺陷和ABA 不敏感突變體（aba1和abi3）種子在超高溫度下可以萌發(fā)，同樣也證實(shí)ABA 在高溫下對(duì)種子萌發(fā)的抑制至關(guān)重要[40]。此外，白皮松種子在25℃下對(duì)ABA 反應(yīng)可能更為敏感和強(qiáng)烈。研究表明，大麥胚胎萌發(fā)對(duì)ABA 抑制的敏感性在高溫下增強(qiáng)[16]，谷類種子在休眠強(qiáng)烈表達(dá)的溫度（30℃）下也比在容易萌發(fā)的溫度（10℃）下對(duì)ABA 更敏感[41]。

高溫抑制往往不是由單獨(dú)增強(qiáng)的ABA 生物合成引起的，保持ABA 含量低于抑制閾值可以達(dá)到耐熱性，但種子萌發(fā)仍然需要GA3參與且在ABA介導(dǎo)的萌發(fā)抑制被克服后起作用[42-43]。由于ABA和GA3在生物合成中共享甲羥戊酸途徑的早期部分[44]，25℃下白皮松種子胚中ABA 合成代謝旺盛，抑制了中間體向GA3生物合成的轉(zhuǎn)變使其不能發(fā)揮其作用，從而抑制種子萌發(fā)使胚根無(wú)法突破種皮。同樣，擬南芥種子在高溫下促進(jìn)參與ABA 合成基因的表達(dá)，ABA 下調(diào)GA3生物合成途徑中基因并抑制其表達(dá)[45]。而當(dāng)白皮松種子在20℃下萌發(fā)時(shí)，ABA 合成被抑制，胚中GA3合成代謝活躍并以足夠的水平存在從而促進(jìn)萌發(fā)。所以，GA3在白皮松種子萌發(fā)中通過(guò)其對(duì)ABA 代謝的干擾來(lái)發(fā)揮作用并影響其對(duì)溫度的反應(yīng)。類似的，外源施用GA3則可以通過(guò)促進(jìn)ABA 分解從而減輕萵苣Lactuca sativa種子熱抑制并增加其萌發(fā)溫度上限[46]。

IAA 通常不被認(rèn)為是種子萌發(fā)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，其在種子休眠和萌發(fā)中的作用存在爭(zhēng)議。如ABA 通過(guò)增強(qiáng)IAA 信號(hào)傳導(dǎo)抑制了擬南芥種子萌發(fā)期間胚軸伸長(zhǎng)[47]。但在萌發(fā)的豌豆Pisum sativum種子中，IAA 卻可以通過(guò)調(diào)節(jié)乙二醛酶活性而加快細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育速率[48]。20℃下，白皮松種子中IAA 含量在萌發(fā)過(guò)程中不斷升高。一方面可能源于成熟種子胚乳中大量積累的IAA 綴合物，另一方面是IAA 在胚中從頭進(jìn)行了生物合成。而在抑制萌發(fā)的25℃下，則可能是由于IAA 從胚乳的轉(zhuǎn)移和胚自身的合成作用受到了抑制，IAA無(wú)法正常發(fā)揮其對(duì)細(xì)胞壁建成和細(xì)胞伸長(zhǎng)的促進(jìn)作用。紫椴Tilia amurensis[49]和水曲柳Fraxinus mandshurica[33]種子在適溫下萌發(fā)時(shí)種子中IAA 含量同樣高于高溫下IAA 含量。可見，IAA 在適溫下種子萌發(fā)中起促進(jìn)作用。ZR 是細(xì)胞分裂素中活性強(qiáng)且易測(cè)定的激素儲(chǔ)存形式，是植物生長(zhǎng)和發(fā)育生理過(guò)程的活躍參與者[50]。白皮松種子在干燥成熟過(guò)程中積累了一定量ZR，種子吸脹后被激活。20℃下種子中ZR 在胚根即將突破種皮時(shí)含量快速升高，促進(jìn)了細(xì)胞分裂和胚根的起始生長(zhǎng)，在種子萌發(fā)中發(fā)揮積極作用。

種子萌發(fā)過(guò)程受到外界環(huán)境信號(hào)的刺激后，引起內(nèi)部激素含量和比例的改變，進(jìn)而產(chǎn)生相應(yīng)的生理響應(yīng)來(lái)調(diào)控萌發(fā)進(jìn)程。不同萌發(fā)溫度下白皮松種子中激素含量變化顯示：20℃下，種子中GA3、IAA 和ZR 含量隨萌發(fā)進(jìn)行而升高，ABA分解代謝旺盛含量下降，GA3/ABA、IAA/ABA 和ZR/ABA 呈上升趨勢(shì)，向著種子萌發(fā)方向發(fā)展；25℃下，種子中GA3、IAA 和ZR 含量變化不大，ABA 分解活動(dòng)受到抑制且在高溫低氧誘導(dǎo)下重新進(jìn)行了生物合成，積累并維持在較高水平，GA3、IAA、ZR 與ABA 比值逐漸降低，種子中抑制型激素含量占優(yōu)勢(shì)，萌發(fā)過(guò)程相關(guān)代謝活動(dòng)受阻。

本文僅研究了不同溫度下種子萌發(fā)過(guò)程中的呼吸代謝特點(diǎn)和內(nèi)源激素含量變化，沒有對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝啟動(dòng)情況進(jìn)行探究。今后可從萌發(fā)過(guò)程中的代謝組學(xué)、蛋白組學(xué)及基因表達(dá)等方面進(jìn)一步研究，深入考察種子萌發(fā)的熱抑制機(jī)理。