郭彩慧，朱毅*，馬雪穎，邵萌萌，于夢淇，王永剛

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100089；2.解放軍總醫(yī)院，北京 100039)

花椒(ZanthoxylumschinifoliumSieb.et Zucc)屬于蕓香科，是一種常見的香料和油料作物，富含多種生物活性成分[1]，且具有較強(qiáng)的抗氧化能力，生活中還可用于抗菌、止痛等[2]?；ń酚星?、紅兩種顏色，青花椒主要產(chǎn)于南方，而紅花椒在北方居多。兩種花椒除外觀上有較大差異外，在風(fēng)味和組分方面也有一定差別[3-4]。本實(shí)驗(yàn)選用青花椒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，相較于紅花椒，青花椒個(gè)頭更大，麻味更濃。如今，花椒的選種和栽培已取得較大的進(jìn)展，但在深加工產(chǎn)業(yè)技術(shù)方面有所欠缺，需進(jìn)一步研究[5-7]。

植物多酚，又稱植物單寧，具有很強(qiáng)的抗氧化能力和抗菌活性[8-9]，可以減少細(xì)胞和組織中的氧化損傷[10]，因此可以作為天然抗氧化劑應(yīng)用在不同領(lǐng)域中[11]。目前國內(nèi)對植物多酚的提取和抗氧化性的研究臻于完善，花椒多酚的相關(guān)研究也多基于紅花椒，但是對于青花椒多酚的研究未見報(bào)道，因此，本實(shí)驗(yàn)選用優(yōu)質(zhì)青花椒為實(shí)驗(yàn)原料，利用有機(jī)溶劑浸提法提取多酚類物質(zhì)，研究A，B，C，D 4個(gè)因素對花椒多酚提取率的影響，采用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化花椒多酚的提取條件；采用柱層分析法純化青花椒多酚粗提液，進(jìn)行成分和抗氧化能力測定?；ń繁粡V泛用作調(diào)味品，但在其他方面應(yīng)用較少，所以本文旨在增加花椒的綜合利用，為花椒深加工技術(shù)的發(fā)展提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青花椒：魯?shù)榭h明德農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司。將青花椒在45 ℃下干燥24 h，用粉碎機(jī)粉碎成花椒粉，常溫避光儲(chǔ)藏。

抗壞血酸(Vc)、福林酚、2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基、2,2′-聯(lián)氨-雙二胺鹽：北京索萊寶科技有限公司；過硫酸鉀：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；以上試劑均為分析純。沒食子酸、兒茶素、綠原酸、咖啡酸、對香豆酸、槲皮素、表兒茶素、山奈酚、阿魏酸、表兒茶素沒食子酸酯：北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司；以上試劑均為標(biāo)準(zhǔn)品。聚酰胺粉(規(guī)格100～200目)：上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ZBRTD-211數(shù)顯恒溫水浴鍋；UV5300紫外可見分光光度計(jì)；SHB循環(huán)水式多用真空泵；BYB-300A高速多功能粉碎機(jī)；XMTD-8222電熱恒溫水槽；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；FD-1B-50冷凍干燥機(jī)；BT-200B數(shù)顯恒流泵；2XZ(S)-2旋片式真空泵：以上儀器均為國產(chǎn)；5430R冷凍離心機(jī)：德國Eppendorf公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法與內(nèi)容

1.3.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將0.1 g沒食子酸溶于蒸餾水中，定容至100 mL，得1.0 mg/mL的沒食子酸溶液，50 mL容量瓶中分別移入0，0.05，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30 mL，加25 mL蒸餾水和2 mL Folin-Ciocalteu試劑，混合均勻后靜置4～5 min，加入4 mL 10% Na2CO3試劑并用少量蒸餾水稀釋，在30 ℃下恒溫水浴2 h，在765 nm處測量樣品的吸光值[12-14]，繪制樣品標(biāo)準(zhǔn)吸光曲線。

1.3.2 青花椒多酚的提取及測定

將2.00 g花椒粉溶解在60%的乙醇中，料液比為1∶20 (g/mL)，40 ℃下恒溫水浴60 min,在7000 r/min、4 ℃下離心20 min。將提取物在50 ℃下濃縮至25%，以便從花椒中獲得多酚的粗提取物。按1.3.1方法測量吸光度后，根據(jù)下式計(jì)算多酚含量[15]：

W=C×V×N/M×1000。

式中：W為多酚含量(mg/g);C為沒食子酸的濃度(μg/mL);V為粗提液的體積(mL);N為稀釋的倍數(shù);M為取樣量(g)。

1.3.3 青花椒多酚提取單因素實(shí)驗(yàn)[16]

根據(jù)1.3.2的方法，將乙醇提取青花椒多酚濃度(20%、30%、40%、60%、80%)、提取溫度(30，40，50，60，70 ℃)、提取時(shí)間(30，50，60，70，90 min)、料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，g/mL)作為單因素條件，探究其對青花椒多酚提取量的影響，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4 青花椒多酚的分離純化[17-19]

取適量的聚酰胺粉溶于95%的乙醇溶液，反復(fù)攪拌直至除去白色氣泡后倒入裝柱，用95%乙醇洗脫，洗脫液透明后用5% NaOH、蒸餾水、10%醋酸洗脫，最后用蒸餾水洗脫至中性。將濃縮的青花椒多酚粗提液(1.5 BV)進(jìn)行上樣，保留30 min，分別用蒸餾水(1.5 BV)、70%乙醇洗脫，收集2，3 BV洗脫液，用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后得到青花椒多酚純化物。

1.3.5 高效液相色譜法測定青花椒多酚成分[20-23]

1.3.5.1 供試品溶液的準(zhǔn)備

用色譜級甲醇溶解1 mg青花椒多酚純化物，得到1 mg/mL的樣品溶液，用0.45 μm微孔濾膜進(jìn)行過濾后置于棕色進(jìn)樣瓶中。

1.3.5.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的準(zhǔn)備

分別稱量兒茶素等10種標(biāo)準(zhǔn)品20 mg，溶解于色譜級甲醇中，得1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，保存在棕色容量瓶中，隨后將其配制成濃度為1，5，10，20，40，60 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用0.45 μm微孔濾膜過濾后置于一個(gè)棕色進(jìn)樣瓶中。

1.3.5.3 色譜條件

色譜柱：Inert Sustain C18柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)；流動(dòng)相A：0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B：色譜甲醇，柱溫：40 ℃，流速：1 mL/min，進(jìn)樣量：10 μL，檢測波長：280 nm，檢測器：Agilent 1200，DAD檢測器。

HPLC色譜梯度洗脫條件見表1。

表1 HPLC色譜梯度洗脫條件Table 1 The gradient elution conditions of HPLC

1.3.6 青花椒多酚與Vc對DPPH、ABTS+自由基的清除作用

用無水乙醇分別溶解10 mg的青花椒多酚粗提物、純化物和Vc，定容至10 mL，保存到棕色容量瓶中，濃度為1 mg/mL，用無水乙醇分別稀釋，得到濃度為0.001，0.002，0.004，0.006，0.008，0.10，0.20，0.40 mg/mL的樣品溶液[24]。取2 mL DPPH乙醇溶液和2 mL樣品溶液混合，并在常溫、黑暗條件下保存30 min，測量517 nm處的吸光度，并使用無水乙醇作為對照和空白；將4.0 mL ABTS+測定液和0.4 mL樣品溶液混合，振蕩30 s后靜置5 min，在734 nm處測量吸光度，無水乙醇溶液作為對照和空白。

DPPH 自由基清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%。

公式(1)

式中：Ai為吸光值(2 mL DPPH+2 mL樣品溶液)；Aj為吸光值(2 mL無水乙醇+2 mL樣品溶液)；A0為吸光值(2 mL DPPH+2 mL無水乙醇)。

ABTS+自由基清除率(%)=(1-A1/A0)×100%。

公式(2)

式中：A1為吸光值(4.0 mL ABTS+測定液+0.4 mL樣品溶液)；A0為吸光值(4.0 mL ABTS+測定液+0.4 mL無水乙醇)。

1.3.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)使用SPSS 25.0進(jìn)行分析，Origin 9.0進(jìn)行作圖，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 青花椒多酚提取單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

橫坐標(biāo)為沒食子酸濃度，縱坐標(biāo)為765 nm處的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：y=0.1027x+0.0151，R2=0.9981。

2.1.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖2中(a)可知，青花椒多酚含量隨著提取溫度的升高呈先上升后下降的趨勢，60 ℃時(shí)達(dá)到峰值，較高的加工溫度提高了細(xì)胞壁的滲透性，如果適當(dāng)?shù)厣邷囟龋瑒t原料中的蛋白質(zhì)可以被固化，且酶可以被破壞以增加提取溶液的穩(wěn)定性，從而使多酚的提取量增加[25-27]；但是溫度過高，一些耐熱的活性成分反而會(huì)被破壞，同時(shí)引起多酚類物質(zhì)發(fā)生氧化反應(yīng)及聚合反應(yīng)，其分子結(jié)構(gòu)受到影響，同時(shí)容易引起溶劑蒸發(fā)損失和其他組分的溶解度增加，多酚提取量下降[28-29]。因此，提取溫度為60 ℃最適宜。

圖2 溫度、時(shí)間、料液比、乙醇濃度對青花椒多酚提取量的影響Fig.2 Effects of temperature, time, solid-liquid ratio, ethanol concentration on the extraction amount of polyphenols from Zanthoxylum schinifolium Sieb. et Zucc

由圖2中(b)可知，在多酚提取的初始階段，多酚提取含量增加較快。提取時(shí)間在30～60 min階段變化時(shí)，曲線的斜率較大，當(dāng)時(shí)間達(dá)到60 min時(shí)，多酚提取含量最高，隨后逐漸減小，最后多酚含量的增加率趨于平穩(wěn)，原因可能是提取時(shí)間越長，提取物和被提取物的作用時(shí)間越長，有利于多酚的釋放，但時(shí)間過長時(shí)，由于缺乏穩(wěn)定的多酚，在萃取過程中氧氣會(huì)進(jìn)入，會(huì)導(dǎo)致多酚的氧化分解，多酚的提取量降低[30]。因此，選取最優(yōu)提取時(shí)間為60 min。

由圖2中(c)可知，隨著乙醇用量的增加，青花椒多酚提取含量先快速升高后趨于平緩，料液比為1∶10～1∶30時(shí)，多酚提取速度增加較快，料液比為1∶30～1∶50時(shí)，多酚提取量的增速逐漸緩慢，這是因?yàn)槎喾宇愇镔|(zhì)會(huì)通過氫鍵、疏水鍵結(jié)合其他物質(zhì)，而有機(jī)溶劑可以破壞這些結(jié)合鍵，因而在一定范圍內(nèi)，可通過增加溶劑量來促進(jìn)多酚的溶解[31]。但基于降低實(shí)驗(yàn)成本等角度的考慮，有機(jī)溶劑乙醇用量不宜過多，選取1∶30為最適宜的料液比。

由圖2中(d)可知，隨著乙醇濃度的增加，青花椒多酚提取含量呈先升高后下降的趨勢，乙醇濃度達(dá)到40%時(shí)提取含量最高，之后明顯下降。當(dāng)溶劑濃度低時(shí)，極性強(qiáng)，導(dǎo)致水溶性物質(zhì)(如糖)的浸出增加，糖和多酚結(jié)合降低了多酚提取量，從而影響了多酚的提取。根據(jù)相似相溶原理，隨著乙醇濃度的增加，多酚和乙醇的極性越來越近，使多酚的提取量增加，但乙醇濃度過高可使組織中蛋白質(zhì)變性，而且乙醇濃度過高更加容易揮發(fā)，這些都影響多酚類物質(zhì)的提取效果[32]。考慮到環(huán)保問題，選取40%為最適宜的乙醇濃度。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)

通過單因素實(shí)驗(yàn)，比較了4種不同水平的因素對青花椒多酚提取率的影響，選取最適提取條件，設(shè)計(jì)了四因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)，見表2。

表2 正交實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table 2 The factors and levels of orthogonal experiment

2.3 青花椒多酚提取工藝正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果分析

設(shè)計(jì)L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，通過比較K值和R值，得出各因素對青花椒多酚提取率的影響程度為D>C>B>A；結(jié)合表2和表3和圖2可知，最佳因素水平組合為A1B2C2D2；由表4可知，正交實(shí)驗(yàn)中的A，B，C，D 4個(gè)因素對青椒多酚提取率的影響并不顯著。因此，不再在每個(gè)因子級別之間進(jìn)行多次比較。

表3 正交實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果Table 3 Orthogonal experiment scheme and results

表4 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 4 Analysis of variance of orthogonal experimental results

2.4 青花椒多酚成分測定結(jié)果

對應(yīng)圖3標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間，檢測出圖4青花椒多酚純化物樣品中共含有5種成分：表兒茶素、槲皮素、對香豆酸、山奈酚、阿魏酸，分別將這5種成分在1，5，10，20，40，60 μg/mL濃度下建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)線性回歸方程得出青花椒多酚純化物成分含量檢測結(jié)果，見表5。

圖3 混合標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖

圖4 青花椒多酚純化物HPLC圖

表5 青花椒多酚成分檢測結(jié)果Table 5 The determination results of polyphenols from Zanthoxylum schinifolium Sieb. et Zucc

2.5 青花椒多酚抗氧化性測定

由圖5和圖6可知，青花椒多酚DPPH、ABTS+自由基清除能力較強(qiáng)，不難看出青花椒多酚對ABTS+自由基清除能力優(yōu)于DPPH自由基，當(dāng)濃度為0.2 mg/mL時(shí)，VC、青花椒多酚純化物和青花椒多酚粗提物DPPH自由基清除率分別為93.34%、91.76%、88.11%，ABTS+自由基清除率分別為100%、97.39%、81.47%。無論是青花椒多酚純化物還是粗提物，它們的DPPH自由基清除率略低于Vc，但是，純化物的ABTS+自由基清除率達(dá)到97.39%，接近Vc的清除效果；在濃度為0.40 mg/mL時(shí)，青花椒多酚純化物的清除率高達(dá)99.90%，近似等同于Vc的清除效果，粗提物的清除率為96.91%，接近純化物的清除效果。由此可知，青花椒多酚具有很強(qiáng)的抗氧化能力，并且具有清除ABTS+自由基的強(qiáng)大能力。同樣有研究表明，青、紅花椒提取物抗氧化作用存在差異，其中青花椒提取物脂質(zhì)過氧化的抑制能力較強(qiáng)，紅花椒提取物DPPH自由基清除率較高。

圖5 不同樣品對DPPH自由基的清除率

圖6 不同樣品對ABTS+自由基的清除率

3 結(jié)論

由單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，乙醇濃度對青花椒多酚提取率的影響程度最大，接著是料液比提取時(shí)間和溫度，正交實(shí)驗(yàn)得到青花椒多酚的最佳提取工藝：溫度55 ℃，提取時(shí)間60 min，料液比1∶30 (g/mL)，乙醇濃度40%，得率0.097%。在抗氧化實(shí)驗(yàn)中，DPPH自由基和ABTS+自由基的清除能力依次為Vc>純青椒多酚>粗青椒多酚提取物，隨著樣品濃度的增加，青花椒多酚的DPPH自由基清除能力始終略低于Vc，但青花椒多酚對ABTS+自由基清除能力與Vc相當(dāng)，甚至有超過Vc的趨勢，這表明青花椒多酚的ABTS+自由基清除能力較強(qiáng)?？傊芯勘砻髑嗷ń范喾泳哂泻軓?qiáng)的抗氧化能力，這說明青花椒多酚具有作為天然抗氧化劑的潛力，以便在各領(lǐng)域中得到應(yīng)用。