金華，呂嘉櫪，羅瀟

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，西安 710021)

傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜通過原料中攜帶的微生物進(jìn)行發(fā)酵[1-2]。目前國內(nèi)自然發(fā)酵蔬菜代表性的產(chǎn)品有四川涪陵榨菜、四川泡菜、東北酸菜、貴州辣椒醬以及以甘肅蘭州和陜西陜南為代表的漿水菜等[3-8]。傳統(tǒng)自然發(fā)酵蔬菜中包括乳酸菌、酵母菌、芽孢桿菌以及少量的其他菌群[9-12]。目前的研究報道發(fā)酵過程中發(fā)揮作用的主要是乳酸菌，發(fā)酵后期蔬菜產(chǎn)生乳酸、乙酸等擁有獨特風(fēng)味的物質(zhì)[13-15]。

目前對發(fā)酵蔬菜的研究主要集中在自然發(fā)酵過程中各個階段微生物菌群結(jié)構(gòu)、優(yōu)勢菌群以及產(chǎn)品的感官品質(zhì)等方面[16-18]，通過顯微表征對傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜的研究主要集中在單個樣品或樣品中分離出來的單個菌株等方面[19-20]，其樣本量少，不能全面反映傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜的微生物群落結(jié)構(gòu)，而且結(jié)合泡菜與漿水菜兩者相互對照的研究未見報道。對傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜中微生物的菌群多樣性研究，多是選用分離、純化、鑒定這些傳統(tǒng)的方法，然而環(huán)境中能夠用來培養(yǎng)的微生物只能占到微生物總數(shù)的0.1%～10%[21]，傳統(tǒng)的分離純化培養(yǎng)方法不能真實全面地反映傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜中微生物的菌群多樣性。魏本良等[22]通過高通量測序分析陜西地區(qū)漿水中細(xì)菌多樣性。張安等[23]采用構(gòu)建16S rRNA基因文庫的方法對四川泡菜的微生物多樣性進(jìn)行了分析，但對陜西地區(qū)的傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜中微生物的多樣性缺乏全面分析。

因此，本研究為揭示不同的陜西地區(qū)市售發(fā)酵蔬菜制品中菌群群落結(jié)構(gòu)的差異性，以具有代表性的19種陜西省西安市市售傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜為試驗樣品，采用掃描電子顯微鏡與Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)相結(jié)合，對樣品的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性進(jìn)行研究，研究結(jié)果能夠應(yīng)用到發(fā)酵蔬菜新產(chǎn)品的研制，并且為產(chǎn)品的質(zhì)量控制與品質(zhì)提高提供了依據(jù)。

1 試驗材料與方法

1.1 供試樣品

在陜西西安的不同地區(qū)采集了19種市售傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜制品為供試樣品，其中15個樣品為泡菜(HBZ1、HBZ2、HBZ3、XYL1、LHL1、LHL2、LHL3、LHL4、LHL5、SXC1、SXC2、SXC3、SXC4、LHL6、YTQ2)，4個樣品為漿水菜(YTQ1、YTQ3、GLQ1、GLQ2)。

1.2 主要儀器與試劑

主要儀器與試劑見表1。

表1 主要儀器與試劑Table 1 The main instruments and reagent

1.3 試驗方法

1.3.1 傳統(tǒng)自然發(fā)酵蔬菜樣品的顯微表征分析

選取19份發(fā)酵蔬菜樣品，通過掃描電鏡觀察其發(fā)酵液中細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)和附著在菜體上細(xì)菌的形態(tài)數(shù)量。

1.3.1.1 發(fā)酵液的顯微表征分析

顯微表征采用掃描電子顯微鏡觀察，方法如下[24]：

首先，對發(fā)酵蔬菜樣品進(jìn)行前處理：將發(fā)酵液用離心機(jī)離心10 min，離心機(jī)轉(zhuǎn)速調(diào)至6000 r/min，只取沉淀物，然后繼續(xù)倒入發(fā)酵液離心(條件與上述相同)，經(jīng)過數(shù)次離心使得離心管底剩余更多的細(xì)菌沉淀物。

續(xù) 表

隨后進(jìn)行固定：將上一步操作的管底沉淀用已經(jīng)配制好的戊二醛溶液(2.5%)固定至少2 h，固定操作后再繼續(xù)離心10 min(6000 r/min)，只取沉淀物。

然后清洗：用現(xiàn)配的磷酸緩沖液(pH 7.2，0.1 mol/L)間隔20 min洗滌3次。每次洗滌完成后對其離心(離心條件同上)，只保留管內(nèi)沉淀物。

后續(xù)對其脫水：選取的方法為乙醇梯度脫水，對離心物按照濃度由小到大(30%、70%、100%)進(jìn)行脫水，將其在每種濃度中間隔20 min脫水3次，每次脫水操作后都要進(jìn)行離心，離心條件不變。

干燥：將管內(nèi)沉淀物置于干燥箱，50 ℃烘干。

噴金：通過真空鍍膜設(shè)備對干燥后的樣品鍍金以便于后續(xù)在掃描電鏡下觀察。

最后進(jìn)行觀察分析：將經(jīng)過一系列處理后的樣品置于掃描電鏡下觀察。

1.3.1.2 發(fā)酵菜體的顯微表征分析

發(fā)酵蔬菜樣品前處理：使用消毒鉗取少量待測樣品。后續(xù)步驟同上述發(fā)酵液的顯微表征分析步驟。

1.3.2 傳統(tǒng)自然發(fā)酵蔬菜樣品的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性分析

上述對19個樣品進(jìn)行顯微表征的觀察分析，得出觀察分析結(jié)果，從中選5個細(xì)菌群落多樣的發(fā)酵蔬菜制品，并對其進(jìn)行群落多樣性分析。對5個樣品的總基因組進(jìn)行提取，并針對16S rRNA V3+V4 區(qū)基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過Illumina MiSeq高通量測序分析研究各個樣品中細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 19種傳統(tǒng)自然發(fā)酵蔬菜的顯微表征

2.1.1 發(fā)酵液的顯微表征

對19個發(fā)酵蔬菜的發(fā)酵液進(jìn)行顯微表征觀察，蔬菜中的營養(yǎng)成分與其中的微生物菌群相互作用，從而使得發(fā)酵蔬菜產(chǎn)生各種功能性成分并且還會產(chǎn)生各種風(fēng)味物質(zhì)。各樣品發(fā)酵液中的菌體形態(tài)見圖1。

圖1 19個傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜發(fā)酵液中菌群的顯微表征

19個傳統(tǒng)自然發(fā)酵蔬菜樣品中有15個泡菜樣品和4個漿水菜樣品，泡菜樣品中樣本號HBZ1發(fā)酵液中的優(yōu)勢菌群為球菌，根據(jù)形態(tài)初步判斷是雙球菌，而發(fā)酵液中也存在少量形態(tài)不同的桿菌，總體而言，菌群不復(fù)雜。樣本號HBZ2、HBZ3發(fā)酵液中優(yōu)勢菌群為桿菌，其中樣本號HBZ2發(fā)酵液中優(yōu)勢菌群為桿菌，而樣本號HBZ3發(fā)酵液中菌群相對復(fù)雜，有桿菌且有球菌，但桿菌所占比例要高于球菌。樣本號XYL1、YTQ2發(fā)酵液中不僅有桿菌還觀察到了酵母菌，因此菌群相對較復(fù)雜。樣本號LHL1、LHL2發(fā)酵液中比較前幾個樣品更為復(fù)雜，菌群包括了球菌、桿菌以及酵母菌，球菌在數(shù)量上要多于桿菌和酵母菌。樣本號 LHL3、SXC4發(fā)酵液中包括球菌和酵母菌，球菌多于酵母菌，根據(jù)查閱相關(guān)圖片資料以及對這兩個樣品中酵母菌的形態(tài)描述進(jìn)行分析，其與釀酒酵母的形態(tài)比較符合，其中樣本號SXC4發(fā)酵液中只觀察到了球菌，由菌體形態(tài)判斷其為雙球菌。樣本號LHL4發(fā)酵液中菌群以球菌為主，由菌體形態(tài)判斷其為四聯(lián)球菌。樣本號SXC1發(fā)酵液中優(yōu)勢菌群為球菌，除了球菌還觀察到了數(shù)量較多的酵母菌，樣本號SXC2發(fā)酵液中包括球菌、桿菌和酵母菌，球菌所占比例大于桿菌和酵母菌。樣本號SXC3發(fā)酵液中優(yōu)勢菌群為球菌，但是菌群較為復(fù)雜，通過觀察形態(tài)，發(fā)現(xiàn)其中包括單球菌、雙球菌以及四聯(lián)球菌，還觀察到數(shù)量較少的桿菌。樣本號LHL5、LHL6發(fā)酵液中優(yōu)勢菌群為酵母菌，其中球菌所占比例相對較高。漿水菜樣品中樣本號YTQ1、YTQ3發(fā)酵液中優(yōu)勢菌群為桿菌，樣本號GLQ1、GLQ2發(fā)酵液中優(yōu)勢菌群則為酵母菌。19個傳統(tǒng)自然發(fā)酵蔬菜樣品中漿水菜發(fā)酵液中的菌群較泡菜樣品復(fù)雜。主要以球菌和桿菌數(shù)量居多，但大多數(shù)樣品發(fā)酵液中都存在酵母菌?？偟膩碚f，不同樣品中的菌體種類、形態(tài)各不相同。

2.1.2 菜體表面顯微表征

環(huán)境中的一些微生物具有一定的粘附力，而發(fā)酵蔬菜的菌群包括發(fā)酵液中存在的和附著在菜體表面的菌群。顯微表征19個樣品菌群在菜體表面的存在情況見圖2。

圖2 19個市售傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜在菜體表面的顯微表征

由圖2可知，發(fā)酵蔬菜樣品中的泡菜樣品樣本號HBZ1、LHL3、LHL4的菜體上能明顯看到附著一些球菌。其中觀察樣本號HBZ1菜體上的球菌鑲嵌在菜體表面，通過形態(tài)分析其應(yīng)為單球菌。而樣本號LHL3在菜體表面上可看到許多球菌，通過形態(tài)學(xué)分析其包括單球菌和雙球菌，其中在樣本號LHL4的菜體表面觀察到許多堆積在一起的球菌，通過形態(tài)學(xué)分析其應(yīng)為四聯(lián)球菌。樣本號SXC3、YTQ2菜體表面看到一些桿菌，樣本號SXC4菜體表面能夠觀察到球菌，包括單球菌與四聯(lián)球菌。樣本號LHL6菜體表面則附著了大量的酵母菌，剩余的樣品(樣本號XYL1、HBZ2、HBZ3、SXC1、SXC2、LHL1、LHL2、LHL5)菜體表面很少觀察到附著的菌體。而漿水菜樣品中樣本號GLQ1、GLQ2菜體表面也可以觀察到附著的一些酵母菌，樣本號YTQ1、YTQ3菜體表面則很少能看到附著的菌體?？傮w而言，19個傳統(tǒng)自然發(fā)酵蔬菜樣品中發(fā)酵液中的菌群相對較菜體表面的豐富，而漿水菜中的菌群較泡菜中的菌群豐富，通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)，傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜中存在一些球菌和酵母菌具有一定的粘附力，因此可以附著在菜體表面[25]。

2.2 細(xì)菌群落多樣性

以上述19個樣品進(jìn)行顯微表征的觀察分析結(jié)果中選擇5個細(xì)菌群落多樣的發(fā)酵蔬菜制品，分別為樣本號HBZ1、HBZ2、LHL2、LHL5、LHL6，通過Illumina MiSeq高通量測序分析研究各個樣品中細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)。

2.2.1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

分別提取5個細(xì)菌群落多樣的發(fā)酵蔬菜制品的總基因組，然后利用PCR擴(kuò)增其16 S rRNA V3+V4 區(qū)基因片段，其中瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果見圖3。

圖3 5個傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜樣品細(xì)菌基因組PCR產(chǎn)物電泳圖

由圖3可知，PCR擴(kuò)增的目的是為了保證合適的濃度，使得后續(xù)的試驗結(jié)果準(zhǔn)確。在250～500 bp之間所對應(yīng)的位置可以看到5個發(fā)酵蔬菜制品都有明顯的條帶，說明PCR產(chǎn)物目的條帶大小正確，濃度合適，可以繼續(xù)試驗。

2.2.2 細(xì)菌群落α-群落結(jié)構(gòu)多樣性分析

5個菌群豐富的樣品細(xì)菌α-群落結(jié)構(gòu)多樣性分析見表2。

表2 5個傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜樣品中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性指數(shù)Table 2 The diversity indexes of bacterial community structure of 5 traditional fermented vegetable samples

由表2可知，所選擇測試的5個菌群豐富的樣品，其中樣本號HBZ2菌群豐度指數(shù)在所有測試的5個樣品中最高，菌群豐度指數(shù)由高到低依次為樣本號HBZ2、HBZ1、LHL2、LHL6和LHL5。為反映每個樣品中細(xì)菌群落的真實情況，本次測序深度均不低于0.997。測試結(jié)果反映出細(xì)菌群落豐富，多項指數(shù)對比表現(xiàn)出明顯的差異。

圖4 5個傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜樣品在屬的水平上的細(xì)菌組成

5個傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜樣品在屬水平上的細(xì)菌組成有65個屬，此外，還存在4株無法培養(yǎng)的菌株。在這65個屬中主要為乳桿菌屬(Lactobacillus)和片球菌屬(Pediococcus)菌群豐度指數(shù)比較高。乳桿菌屬在樣本號HBZ1中的豐度為35.70%，在樣本號HBZ2中的豐度為83.36%，在樣本號LHL2中的豐度為89.24%，在樣本號LHL5中的豐度為95.03%，在樣本號LHL6中的豐度為94.83%，片球菌屬在樣本號HBZ1中的豐度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其余4個樣品，豐度為59.59%，其余樣品的豐度：樣本號HBZ2中的豐度為1.60%，樣本號LHL2中的豐度為2.19%，樣本號LHL6中的豐度為2.94%，其中樣本號LHL5中的豐度最低，為1.04%。此外，還在樣本號HBZ2中檢測出了豐度相對較高的假單胞菌屬(Pseudomonas，豐度為2.04%)、擬桿菌屬(Bacteroides，豐度為1.54%)和泛生菌屬(Pantoea，豐度為1.44%)。在樣本號LHL5中檢測出豐度相對較高的海細(xì)菌屬(Marinobacterium)，豐度為2.67%。在樣本號LHL6中檢測出豐度相對較高的水螺菌屬(Aquaspirillum)，豐度為1.05%。此外，還檢測到豐度較低的弓形菌屬、硫桿菌屬、食堿菌屬、棒狀桿菌屬、類芽孢桿菌屬、雙歧桿菌屬、希瓦氏菌屬、硝化螺旋菌屬、鹽單胞菌屬、魏斯氏菌屬、羅氏菌屬等。

由圖5可知，5個樣品細(xì)菌各屬的豐度存在明顯差異，圖中右側(cè)是屬名，表示不同的屬，隨著豐度指數(shù)不斷增加，其顏色由藍(lán)色逐漸過渡到紅色，顏色不同表示豐度不同。不同屬在不同的樣品中所占的比例各不相同。其中乳桿菌屬在5個樣品中所占的比例都較高，而樣本HBZ1中片球菌屬的顏色要略深于乳桿菌屬，在其余4個樣本中乳桿菌屬的顏色最深，為優(yōu)勢菌屬。而且通過顏色塊分析乳桿菌屬在樣本LHL5中占絕對優(yōu)勢。

圖5 5個傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜樣品細(xì)菌核心屬及其分類水平熱圖Fig.5 The heat map of bacterial core genera and their classification level in 5 traditional fermented vegetable samples

由圖6可知，在屬水平，樣本的聚類樹由兩個分枝組成，其中一枝由樣本HBZ1與LHL6組成，而另一枝由樣本HBZ2、LHL2、LHL5組成，處于同一枝的樣本，說明其菌群構(gòu)成在屬分類水平上相似，所以樣本HBZ1和LHL6的菌群構(gòu)成相似，而樣本HBZ2、LHL2、LHL5的菌群構(gòu)成相似。

圖6 屬水平下樣本聚類樹與柱狀圖組合分析圖

圖7 5個傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜樣品在種的水平上的細(xì)菌組成Fig.7 The bacterial composition of 5 traditional fermented vegetable samples at the species level

樣本在種水平上的細(xì)菌組成分為40個種，整體而言，5個樣本中除了樣本HBZ1的優(yōu)勢菌不同于其他4個樣本，其余樣本的優(yōu)勢菌比較統(tǒng)一。不可培養(yǎng)的乳桿菌(unculturedLactobacillussp.)在樣本HBZ2、LHL2、LHL5中的豐度要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于樣本HBZ1、LHL6中的豐度，在樣本HBZ1中菌群豐度指數(shù)為3.57%，在樣本HBZ2中菌群豐度指數(shù)為50.74%，在樣本LHL2中菌群豐度指數(shù)為40.69%，在樣本LHL5中菌群豐度指數(shù)為52.66%，在樣本LHL6中菌群豐度指數(shù)為9.72%。片球菌屬未知種(Pediococcusethanolidurans)在樣本HBZ1中的豐度要明顯高于其余樣本，在樣本HBZ1中菌群豐度指數(shù)為59.59%，在樣本HBZ2中菌群豐度指數(shù)為1.60%，在樣本LHL2中菌群豐度指數(shù)為2.19%，在樣本LHL5中菌群豐度指數(shù)為1.04%，在樣本LHL6中菌群豐度指數(shù)為2.94%。一株未鑒定菌(unidentified)在5個樣本中豐度所占比例都較高，在樣本HBZ1中菌群豐度指數(shù)為30.01%，在樣本HBZ2中菌群豐度指數(shù)為37.03%，在樣本LHL2中菌群豐度指數(shù)為49.00%，在樣本LHL5中菌群豐度指數(shù)為42.85%，在樣本LHL6中菌群豐度指數(shù)為84.64%。除此之外，檢測到的一些希瓦氏菌、紅串紅球菌、奧斯陸莫拉菌、糞產(chǎn)堿菌、Aeromonascaviae、芽孢桿菌、短黃桿菌、短乳桿菌等豐度比較低的菌種。

2.2.3 核心OTU在NCBI數(shù)據(jù)庫中的比對結(jié)果

5個傳統(tǒng)自然發(fā)酵蔬菜樣品一共分出了113個OTU，選擇其中豐度較高的4個OTU ，根據(jù)其在5個樣本中的豐度占比與NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Nucleotide blast 比對及相似性搜索，比對結(jié)果見表3。

表3 OTU1～OTU4 16S V3+V4區(qū)序列比對結(jié)果Table 3 OTU1～OTU4 16S V3+V4 sequence alignment results

由表3可知，最后的比對結(jié)果顯示4個OUT分別為耐酸乳桿菌、乙醇片球菌、布氏乳桿菌和植物乳桿菌，其中耐酸乳桿菌、乙醇片球菌和植物乳桿菌具有100%的相似性，而布氏乳桿菌的相似性也達(dá)到了99%。結(jié)果與顯微表征的分析相符合，鑒定出豐度較高的4個優(yōu)勢菌種，其中只有植物乳桿菌在發(fā)酵蔬菜中比較常見，而這種耐酸桿菌通常出現(xiàn)在酸度較高的發(fā)酵后期。

3 結(jié)論

通過對19個傳統(tǒng)自然發(fā)酵蔬菜樣品的顯微表征和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的多樣性進(jìn)行分析研究，結(jié)果表明：19個樣本的顯微表征形態(tài)各異，具有顯著差異，菌群結(jié)構(gòu)各不相同，泡菜樣品中菌群結(jié)構(gòu)相對單一，而漿水菜樣品中菌群結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜。發(fā)酵液中細(xì)菌菌群的種類和數(shù)量都較菜體上豐富。利用高通量測序技術(shù)對其中5個菌群豐富的發(fā)酵蔬菜樣本進(jìn)行測序，每個樣本中細(xì)菌的屬所占的豐度各不相同，乳桿菌屬的豐度值在除樣本HBZ1之外的4個樣本中遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于豐度值低的菌屬，而在樣本HBZ1中主要為乳桿菌屬和片球菌屬，其中片球菌屬為優(yōu)勢菌屬。與數(shù)據(jù)庫比對鑒定出的4個優(yōu)勢菌中只有植物乳桿菌常見于研究資料中，而且4個優(yōu)勢菌種在5個樣本中的豐度要遠(yuǎn)高于豐度低的菌種。