食管癌是臨床常見惡性腫瘤之一，其主要病理類型為食管鱗癌、食管腺癌，近年來，隨著生活方式的改變，我國食管癌發(fā)病率逐年升高。由于食管癌早期發(fā)生遷移及侵襲導(dǎo)致病人術(shù)后生存率較低。鈣激活的氯離子通道A4（Calcium-Activated Chloride Channel A4，CLCA4）在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中呈低表達(dá)，其低表達(dá)量與病人預(yù)后不良有關(guān)。相關(guān)報道指出CLCA4在結(jié)直腸癌中呈低表達(dá)并可能發(fā)揮抑癌基因作用。但CLCA4在食管癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移過程中的調(diào)控機(jī)制尚未可知。JAK激酶2/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3（JAK2/STAT3）信號通路可參與細(xì)胞增殖、凋亡、等生物學(xué)過程，腫瘤發(fā)生過程中該信號通路處于活化狀態(tài)并可促進(jìn)腫瘤發(fā)展進(jìn)程。但CLCA4是否可通過調(diào)控JAK2/STAT3信號通路影響食管癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移過程尚未可知。本研究于2019年1月至2019年8月首先檢測CLCA4在食管癌細(xì)胞系中的表達(dá)，選擇表達(dá)最低的細(xì)胞系進(jìn)行后續(xù)研究，探討CLCA4過表達(dá)對食管癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

正常人食管鱗狀上皮細(xì)胞Het-1A與人食管癌細(xì)胞KYSE170、Eca109、TE10均購自美國ATCC細(xì)胞庫。結(jié)晶紫均購自陜西碧云天生物；BCA蛋白定量檢測試劑盒、化學(xué)發(fā)光試劑ECL、十二烷基硫酸鈉（SDS）購自美國Pierce；pcDNA3.1購自上?？吕咨铮籎AK2/STAT3信號通路激活劑磷酸化JAK激酶2（p-JAK2）多肽購自上海吉爾；Lipofectamine2000與Trizol試劑購自美國Invitrogen；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Promega；熒光定量PCR試劑盒購自美國ABI；Transwell小室購自美國Chemicon；Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）購自齊一生物科技（上海）有限公司；兔抗人細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）、依賴性激酶抑制因子（P21）抗體購自美國Santa Cruz；兔抗人基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）抗體購自廈門慧嘉生物科技有限公司；兔抗人JAK2、STAT3，p-JAK2、磷酸化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3（p-STAT3）抗體購自美國CST；二抗購自北京中杉金橋生物。

1.2 方法

1.2.1

實驗處理與分組 分別將pcDNA-CLCA4、pcDNA-NC轉(zhuǎn)染至Eca109細(xì)胞，分別記作CLCA4過表達(dá)（pcDNA-CLCA4）組、CLCA4陰性對照（pcDNANC）組，轉(zhuǎn)染前1 d將培養(yǎng)液更換為Opti-MEM減血清培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染6 h后將培養(yǎng)液更換為含有10%胎牛血清的DMEM新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。將正常培養(yǎng)的Eca109細(xì)胞記作陰性對照（NC）組。后續(xù)實驗分組：pcDNA-CLCA4組、p-JAK2多肽組（含有5μmol/L的p-JAK2多肽培養(yǎng)液培養(yǎng)Eca109細(xì)胞48 h）、pcDNA-CLCA4+p-JAK2多肽組（pcDNA-CLCA4轉(zhuǎn)染至Eca109細(xì)胞48 h后，用含有5μmol/L的p-JAK2多肽培養(yǎng)液培養(yǎng)Eca109細(xì)胞48 h）。

1.2.2

實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRTPCR）檢測細(xì)胞中CLCA4 mRNA表達(dá)水平 收集各組細(xì)胞，加入適量Trizol，室溫靜置5 min，依次加入氯仿與異丙醇，提取細(xì)胞總RNA。取2μg RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，按照試劑盒說明書配置反應(yīng)體系，置于-20℃保存cDNA。RT-PCR反應(yīng)擴(kuò)增體系為20μL，按照試劑盒說明書配置反應(yīng)體系，用2法計算CLCA4 mRNA相對表達(dá)量。

1.2.3

四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法（MTT法）檢測細(xì)胞增殖 收集各組轉(zhuǎn)染后食管癌Eca109細(xì)胞（3×10個/毫升）接種于96孔板（100微升/孔），每孔加入20μL MTT溶液，培養(yǎng)4 h后棄上清，每孔加入150μL DMSO，放入振蕩儀勻速振蕩10 min，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測各孔相對吸光度（490 nm）。

1.2.4

Transwell實驗檢測細(xì)胞遷移與侵襲 遷移實驗：取各組Eca109細(xì)胞按照每孔200μL的密度加入上室，含有10%胎牛血清的培養(yǎng)液加入下室（600微升/孔），24 h后甲醛固定20 min，PBS洗滌，0.1%結(jié)晶紫染液染色10 min，顯微鏡下觀察并計數(shù)。侵襲實驗：制備Matrigel基質(zhì)膠稀釋液加入上室（40微升/孔），后續(xù)實驗步驟同遷移實驗。

1.2.5

蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測CLCA4、CyclinD1、P21、MMP-2、MMP-9、JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá) 提取細(xì)胞總蛋白，取50μg蛋白上樣量加入1×SDS緩沖溶液，沸水中煮5 min（蛋白變性），十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，加入目的蛋白一抗稀釋液，4℃孵育24 h，加入相應(yīng)二抗稀釋液，室溫孵育1 h，等滲緩沖鹽溶液（TBST）洗滌，加入ECL化學(xué)發(fā)光劑，顯影，定影，應(yīng)用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 CLCA4在正常人食管鱗狀上皮細(xì)胞與人食管癌細(xì)胞中的表達(dá)

qRT-PCR與Western blotting檢測結(jié)果顯示，相較于正常人食管鱗狀上皮細(xì)胞Het-1A，人食管癌細(xì)胞KYSE170、7E ca1809、TE10中CLCA4 mRNA及蛋白表達(dá)水平均顯著降低（

P

＜0.05），其中CLCA4在食管癌Eca109細(xì)胞中的表達(dá)水平與其他細(xì)胞系比較明顯降低，因而選用食管癌Eca109細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究。見圖1、表1。

圖1 CLCA4蛋白免疫印跡圖

表1 鈣激活的氯離子通道A4（CLCA4）在正常人食管鱗狀上皮細(xì)胞Het-1A與人食管癌細(xì)胞KYSE170、Eca109、TE10中的表達(dá)/±s

2.2 CLCA4過表達(dá)對食管癌Eca109細(xì)胞增殖的影響

Western blotting檢測結(jié)果顯示，pcDNA-CLCA4組食管癌Eca109細(xì)胞中CLCA4蛋白相對表達(dá)量顯著高于pcDNA-NC組（

P

＜0.05）。提示成功上調(diào)CLCA4的表達(dá)。MTT檢測結(jié)果顯示，與pcDNA-NC組相比，pcDNA-CLCA4組食管癌Eca109細(xì)胞存活率顯著降低（

P

＜0.05），NC組與pcDNA-NC組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（

P＞

0.05），見表2。與pcDNA-NC組比較，pcDNA-CLCA4組食管癌Eca109細(xì)胞中CyclinD1蛋白相對表達(dá)量顯著降低（

P

＜0.05），P21蛋白相對表達(dá)量顯著升高（

P

＜0.05）。見圖2、表2。

圖2 CLCA4蛋白與細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白免疫印跡圖

表2 CLCA4過表達(dá)對食管癌Eca109細(xì)胞增殖的影響/±s

2.3 CLCA4過表達(dá)對食管癌Eca109細(xì)胞遷移及侵襲的影響

pcDNA-CLCA4組遷移細(xì)胞數(shù)與侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著少于pcDNA-NC組（

P

＜0.05），MMP-2、MMP-9蛋白相對表達(dá)量均低于pcDNA-NC組（

P

＜0.05），NC組與pcDNA-NC組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（

P＞

0.05）。見表3、圖3。

2.4 CLCA4過表達(dá)對JAK2/STAT3信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)影響

Western blotting檢測結(jié)果顯示，pcDNA-CLCA4組食管癌Eca109細(xì)胞中p-JAK2、p-STAT3蛋白相對表達(dá)量均顯著低于pcDNA-NC組（

P

＜0.05），而各組間JAK2、STAT3蛋白相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（

P＞

0.05）。見圖4、表4。

2.5 激活JAK2/STAT3信號通路可逆轉(zhuǎn)CLCA4過表達(dá)對食管癌Eca109細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的抑制作用

與pcDNA-CLCA4+p-JAK2多肽組比較，pcDNA-CLCA4組細(xì)胞存活率顯著降低（

P

＜0.05），遷移細(xì)胞數(shù)與侵襲細(xì)胞數(shù)減少（

P

＜0.05）；與pcDNACLCA4+p-JAK2多肽組比較，p-JAK2多肽組細(xì)胞存活率升高（

P

＜0.05），遷移細(xì)胞數(shù)與侵襲細(xì)胞數(shù)增多（

P

＜0.05），見表5。與pcDNA-CLCA4+p-JAK2多肽組比較，pcDNA-CLCA4組食管癌Eca109細(xì)胞中p-JAK2、p-STAT3、CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白相對表達(dá)量均降低（

P

＜0.05），P21蛋白水平升高（

P

＜0.05）；與pcDNA-CLCA4+p-JAK2多肽組比較，p-JAK2多肽組p-JAK2、p-STAT3、CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白水平升高（

P

＜0.05），P21蛋白水平降低（

P

＜0.05）。見圖5、表6。

表3 CLCA4過表達(dá)對食管癌Eca109細(xì)胞遷移及侵襲的影響/±s

圖3 細(xì)胞遷移及侵襲相關(guān)蛋白免疫印跡圖

圖4 JAK2/STAT3信號通路相關(guān)蛋白免疫印跡圖

表4 CLCA4過表達(dá)對JAK2/STAT3信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響/±s

表5 激活JAK2/STAT3信號通路可逆轉(zhuǎn)CLCA4過表達(dá)對食管癌Eca109細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的抑制作用/±s

圖5 JAK2/STAT3信號通路相關(guān)蛋白與細(xì)胞增殖、遷移及侵襲相關(guān)蛋白免疫印跡圖

3 討論

目前臨床治療食管癌已取得一定進(jìn)展，但病人預(yù)后仍然很差，探究其根本原因在于食管癌細(xì)胞遷移及侵襲能力增強(qiáng)。既往研究顯示食管癌發(fā)生發(fā)展過程涉及多種miRNA、基因等，但關(guān)于其具體作用機(jī)制尚未闡明。因而本研究積極探尋新型基因為食管癌靶向治療提供潛在靶點。

CLCA4在結(jié)直腸癌、肝細(xì)胞癌、乳腺癌等腫瘤中呈低表達(dá)并可抑制細(xì)胞侵襲及遷移。但CLCA4在食管癌中的表達(dá)尚未可知。本研究結(jié)果顯示CLCA4在食管癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平明顯降低，CLCA4過表達(dá)后可明顯抑制食管癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲。研究表明CyclinD1可促進(jìn)細(xì)胞周期由G1期進(jìn)入S期，促進(jìn)細(xì)胞增殖，而P21可抑制CyclinD1表達(dá)。MMP-2、MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶類重要成員，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移及侵襲。本研究結(jié)果顯示CLCA4過表達(dá)后可抑制食管癌細(xì)胞中CyclinD1、MMP-2、MMP-9的表達(dá)及促進(jìn)P21的表達(dá)，提示CLCA4過表達(dá)可減弱食管癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力。

表6 JAK2/STAT3信號通路相關(guān)蛋白與細(xì)胞增殖、遷移及侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)量/±s

JAK2/STAT3信號通路激活可抑制肝癌細(xì)胞凋亡，抑制該信號通路后肝癌細(xì)胞凋亡能力顯著增強(qiáng)。研究表明吳茱萸堿可能通過抑制JAK2/STAT3信號通路激活從而發(fā)揮抗結(jié)腸癌作用。相關(guān)報道指出抑制JAK2/STAT3信號通路激活可減弱鼻咽癌細(xì)胞遷移及侵襲能力。本研究結(jié)果顯示CLCA4過表達(dá)后食管癌細(xì)胞中JAK2/STAT3信號通路相關(guān)蛋白p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá)水平顯著降低，用p-JAK2多肽激活JAK2/STAT3信號通路后，CLCA4過表達(dá)對食管癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的抑制作用明顯減弱。

綜上所述，CLCA4在食管癌細(xì)胞中呈低表達(dá)，CLCA4過表達(dá)后食管癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力降低，其作用機(jī)制可能與抑制JAK2/STAT3信號通路有關(guān)，為食管癌靶向治療提供新方向。但CLCA4對食管癌其他生物學(xué)特性及相關(guān)分子機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。