肝癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，它是全球 導(dǎo)致癌癥死亡的第二大原因。全球每年新增肝癌病例782 500例，死亡745 500例，僅中國就占總病例和死亡人數(shù)的50%左右。其中肝細胞癌占原發(fā)性肝癌的85%～90%。目前，手術(shù)切除和肝移植是唯一可能治愈的策略，但在根治性切除后，尤其是在殘余肝中，復(fù)發(fā)率仍然很高，約80%病人在診斷時已為腫瘤晚期，中位生存期約為8個月，其預(yù)后普遍令人沮喪。近年來，人們對其侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機制進行了大量的研究，但有關(guān)肝細胞癌惡性和轉(zhuǎn)移的詳細機制尚不明確，因此，識別肝細胞癌可靠的腫瘤分子生物標記物對于個性化治療和評估預(yù)后至關(guān)重要。神經(jīng)纖毛蛋白1（neuropilin-1，NRP-1）最初被描述為對神經(jīng)元發(fā)育具有重要作用的信號受體，同時很多研究發(fā)現(xiàn)，NRP-1在許多癌癥的血管生成和惡性進展中起重要作用，如：乳腺癌、非小細胞肺癌、前列腺癌、黑素瘤和胰腺癌等。但它在肝細胞癌方面的相關(guān)研究鮮見報道，因此，本研究通過應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測肝細胞癌組織及癌周正常肝組織的NRP-1、血管內(nèi)皮生長因子受體2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2）表達情況，探討NRP-l、VEGFR2在肝細胞癌的表達與臨床病理特征、預(yù)后的關(guān)系，為肝細胞癌的診治、預(yù)后評估提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年11月至2018年11月徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院肝膽外科行手術(shù)切除并經(jīng)病理學(xué)確診為肝細胞癌的石蠟包埋標本共40例，并獲得20例癌旁正常肝組織標本，均有完整的臨床資料。所有病人術(shù)前未接受任何抗腫瘤治療，且經(jīng)影像學(xué)檢查排除遠處轉(zhuǎn)移。男性25例，女性15例；中位年齡60歲；有慢性肝炎病毒感染26例，無慢性肝炎病毒感染14例；合并肝硬化26例，未合并肝硬化14例；Child-Pugh分級A級29例、B級11例。病理分級高分化8例，中分化21例，低分化11例；TNM分期Ⅰ期22例，Ⅱ期6例，Ⅲ期12例。對所有病人進行至少為期1年的隨訪，記錄病人術(shù)后1年復(fù)發(fā)情況，末次隨訪時間為2019年11月。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 方法

主要試劑包括購自美國的affinity公司的兔抗人NRP-1單克隆抗體，購自美國的proteintech公司的兔抗人VEGFR2單克隆抗體，購自福州邁新生物科技有限公司的兔SP免疫組化檢測試劑盒和DAB顯色劑。將40例肝細胞癌組織及20例正常肝組織標本蠟塊制備成4μm厚連續(xù)切片，60℃烤片2 h，行NRP-1和VEGFR2免疫組化染色。

1.3 判定標準

顯微鏡下觀察組織細胞中NRP-1和VEGFR2蛋白的表達情況，選取3個高表達區(qū)域拍照保存（所有圖片均400×拍攝），使用Image-Pro Plus圖像分析軟件對免疫組化圖片進行處理，計算平均光密度（average optical density，AOD）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS Statistics 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，使用Shapiro-Wilk（W檢驗）判斷數(shù)據(jù)是否服從正態(tài)分布。NRP-1和VEGFR2在肝細胞癌和癌旁正常肝組織的表達及與各臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系采用兩獨立樣本

t

檢驗。NRP-1和VEGFR2的表達的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析。NRP-1和VEGFR2的表達高低與病人術(shù)后復(fù)發(fā)關(guān)系采用

χ

檢驗。檢驗水準

α

＝0.05。

2 結(jié)果

2.1 肝細胞癌組織及正常肝組織的NRP

-

1、VEGFR2的表達情況

免疫組化結(jié)果顯示，NRP-1和VEGFR2主要表達在腫瘤細胞和血管內(nèi)皮細胞的細胞質(zhì)和細胞膜上（圖1）。NRP-1、VEGFR2在肝細胞癌組織中AOD分別為（0.398±0.051）、（0.454±0.058），在正常肝組織中的AOD分別為（0.244±0.095）、（0.337±0.064），經(jīng)

t

檢驗分析NRP-1、VEGFR2在肝細胞癌組織和正常肝組織中的表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義（

t

=6.815，

P

＜0.001；

t

=7.155，

P

＜0.001）。

2.2 NRP

-

1、VEGFR2的表達與肝細胞癌臨床病理特征的關(guān)系

肝細胞癌組織的NRP-1、VEGFR2的表達水平與病人性別、年齡、有無慢性肝炎病毒感染、甲胎蛋白水平、腫瘤數(shù)目、有無肝硬化、Child-Pugh分級無明顯相關(guān)性（均

P

＞0.0

5

）；而與病人腫瘤的最大徑、有無血管侵犯、分化程度、TNM分期有關(guān)（均

P

＜0.05）。見表1。

2.3 肝細胞癌組織中NRP

-

1與VEGFR2的相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)分析顯示，NRP-1和VEGFR2在肝細胞癌組織中的表達存在正相關(guān)（

r

=0.789，

P

＜0.001）。

2.4 肝細胞癌組織中NRP

-

1、VEGFR2的表達與病人術(shù)后復(fù)發(fā)關(guān)系分析

根據(jù)NRP-1、VEGFR2各自的算術(shù)平均數(shù)分為高、低表達組，肝細胞癌組織中NRP-1、VEGFR2低表達組術(shù)后1年復(fù)發(fā)率［5.56%（1/18）、20.00%（4/20）］明顯低于NRP-1、VEGFR2高表達組［63.64%（14/22）、55.00%（11/20）］（

χ

=14.249，

P

＜0.001；

χ

=5.227，

P

=0.022）。

3 討論

肝細胞癌是一種富血供腫瘤，它的發(fā)生、進展與新生腫瘤血管的生成有密切關(guān)系。血管生成是腫瘤進展的重要組成部分。新血管的生成為細胞增殖提供氧氣和營養(yǎng)，同時去除二氧化碳和代謝廢物。不僅支持了惡性腫瘤的快速生長，而且通過提供一條逃逸到身體中遠部位的路徑，增加腫瘤的轉(zhuǎn)移潛力。血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGF-A）是其中一個關(guān)鍵的促血管生成信號分子，它主要通過與VEGFR2的相互作用來促進細胞增殖、遷移、骨架重組、分化和新脈管系統(tǒng)的形成及動員內(nèi)皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）從骨髓進入外周循環(huán)。VEGF的過度表達與多種腫瘤的進展和預(yù)后不良有關(guān)，包括乳腺癌、肺癌、胃癌、大腸癌、胰腺癌、前列腺癌和黑色素瘤。本研究檢測了肝細胞癌組織中VEGFR2的表達情況，結(jié)果顯示與正常肝組織細胞相比，肝細胞癌組織中VEGFR2的表達明顯升高，這與在其他惡性腫瘤的表達相符。同時我們進一步分析了VEGFR2的表達與肝細胞癌病人的臨床病理特征及復(fù)發(fā)情況的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)它與腫瘤組織的最大徑、有無血管侵犯、分化程度、TNM分期明顯相關(guān)，VEGFR2高表達的肝細胞癌病人組術(shù)后1年復(fù)發(fā)率明顯高于VEGFR2低表達的肝細胞癌病人組，這表明VEGFR2的表達與腫瘤的增殖、侵襲性有關(guān)，并可作為臨床判斷肝細胞癌預(yù)后的指標之一。

表1 NRP-1、VEGFR2的表達與40例肝細胞癌病人臨床病理參數(shù)的關(guān)系/±s

NRP-1是I型跨膜糖蛋白，可以促進腫瘤發(fā)生的各個方面，如血管生成、細胞存活、遷移、侵襲和化療耐藥。NRP-1參與腫瘤進展的機制，主要與腫瘤血管生成有關(guān)，這與其通過表達在腫瘤內(nèi)皮細胞中的VEGFR2增強VEGF介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)的相關(guān)。NRP-1還被證明介導(dǎo)了依賴血小板衍生生長因子B（platelet derived growth factor B，PDGF-B）的間充質(zhì)干細胞-周細胞的轉(zhuǎn)變和募集。這兩個事件在腫瘤血管重構(gòu)和轉(zhuǎn)移擴散中起著重要作用。此外，NRP-1能結(jié)合幾種促血管生成細胞因子，并能放大肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）誘導(dǎo)的促血管生成的刺激信號，而且已經(jīng)在膠質(zhì)瘤、胰腺癌和前列腺癌等中得到證實。本研究結(jié)果顯示NRP-1在肝細胞癌組織中高表達，在正常肝組織中低表達或不表達，這與其他研究相一致，這些結(jié)果提示NRP-1表達與正常組織的惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)。更重要的是，我們還發(fā)現(xiàn)它與腫瘤組織的最大徑、分化程度、TNM分期明顯相關(guān)。與NRP-1低表達的病人相比，NRP-1高表達的病人的顯示不良的預(yù)后，這表明NRP-1可以作為肝細胞癌病人的一種新的預(yù)后生物標志物。本研究結(jié)果與前期王金爽、楊麗報告的其在NSCLC的作用相類似。

我們還檢測了肝細胞癌中NRP-1與VEGFR2的相關(guān)性，兩者成正相關(guān)（

r

=0.789，

P

＜0.001），而VEGFR2對腫瘤血管生成、促進內(nèi)皮細胞增殖和增加血管通透性至關(guān)重要，因此，NRP-1可能通過促進肝細胞癌中的VEGFR2表達來促進血管生成。有研究發(fā)現(xiàn)NRP-1是一種共受體來介導(dǎo)VEGFR2的活性，可增強VEGF與VEGFR2的結(jié)合，從而促進內(nèi)皮細胞中的VEGF介導(dǎo)的下游信號通路。也有研究表明NRP-1不僅促進VEGFR2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、內(nèi)吞作用、信號輸出，還可促進VEGFR2非依賴性的VEGF-A信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、整合素介導(dǎo)的纖維連接蛋白組裝和基質(zhì)黏附。本研究進一步地支持了他們的觀點。

目前，阻斷血管生成已成為一種突出的策略，以補充化療方法來治療癌癥。雖然兩項大型國際多中心Ⅲ期臨床試驗均充分證明了索拉非尼對晚期肝細胞癌有一定的生成獲益，但仍不能令人滿意。最近，一種人IgG單克隆抗體被開發(fā)出來，阻斷位于VEGF結(jié)合位點的NRP-1 B1B2結(jié)構(gòu)域，值得注意的是，該抗體阻斷了血管生成和血管重塑。因此，NRP-1可以作為潛在的血管生成靶點。

總之，本研究結(jié)果提示NRP-1、VEGFR2的高表達與肝細胞癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，可以作為判斷肝細胞癌病人預(yù)后的分子標志。同時針對NRP-1的靶向藥物正在研制中，NRP-1有望成為一個新的治療靶點。由于本研究的樣本量較少，隨訪時間較短，無法得出NPR-1、VEGFR2的表達與總生存期的關(guān)系，因此需要繼續(xù)隨訪病例，并進一步擴大樣本量進行驗證。