顱內(nèi)動脈瘤是臨床上常見的腦血管疾病之一，其具有極高的致死率和致殘率，顱內(nèi)動脈瘤也是自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下腔出血發(fā)生的重要原因。大量研究顯示，顱內(nèi)動脈瘤的發(fā)生與血流動力學、后天退行性病變、遺傳學等多種因素有關，血管平滑肌細胞凋亡是后天退行性病變中引發(fā)顱內(nèi)動脈瘤的關鍵之一。血管平滑肌細胞具有維持血管平衡及穩(wěn)定的作用，而血管平滑肌細胞過度凋亡導致血管壁的張力下降，誘導顱內(nèi)動脈瘤發(fā)生。微小RNA（miRNA）是在真核生命體內(nèi)存在、具有多種生物學作用的調(diào)控子，其在人類正常生理進程以及疾病發(fā)生中發(fā)揮諸多功能。miRNA參與心腦血管疾病發(fā)生，與腦缺血再灌注、高血壓、動脈粥樣硬化等有關，miRNA有望成為治療和診斷心腦血管疾病的小分子標志物。微小RNA-211（miR-211）參與腫瘤細胞、缺氧心肌細胞等多種細胞的凋亡過程，miR-211在不同的組織或疾病進展中的調(diào)控作用不同。本次實驗初步探討miR-211在顱內(nèi)動脈瘤中的表達變化及其對血管平滑肌細胞凋亡的影響，以期為顱內(nèi)動脈瘤的治療提供資料。

1 材料與方法

1.1 材料

選取2017年5月至2019年1月成都醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院手術切除的顱內(nèi)動脈瘤組織50例，同時選取同期該院20例正常顱內(nèi)動脈血管組織，正常顱內(nèi)動脈血管組織采集自顱腦外傷病人。標本采集均經(jīng)過病人和近親屬同意。本研究符合《世界醫(yī)學協(xié)會赫爾辛基宣言》相關要求。miRNA熒光定量PCR試劑盒miScript SYBR Green PCR Kit、miRNA逆轉錄試劑盒miScript Reverse Transcription Kit購自德國QIAGEN；互補DNA（cDNA）合成試劑盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit購自美國Thermo；熒光定量PCR試劑盒SYBR Real-Time PCR Kit購自上海吉瑪制藥技術有限公司；模擬物陰性對照（mimics control）、miR-211模擬物（miR-211 mimics）由紐赫生物科技（上海）有限公司合成；B細胞淋巴瘤-2相關X蛋白（Bax）抗體購自北京義翹神州科技有限公司。

1.2 實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRTPCR）方法測定顱內(nèi)動脈瘤中miR

-

211、Bax表達差異

取動脈瘤組織和正常顱內(nèi)動脈血管組織，添加Trizol試劑提取細胞中的總RNA，取1μL的RNA用于檢測濃度和純度。分別用miScript Reverse Transcription Kit、RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit逆轉錄合成cDNA，用miScript SYBR Green PCR Kit、SYBR Real-Time PCR Kit進行定量PCR。miR-211內(nèi)參為U6，Bax內(nèi)參為β-肌動蛋白（β-actin）。引物序列如下：miR-211正向5，-CTGCTTGGACCTGTGACCTGT-3"，反向5，-TCTGCAGTAGAGGTGACCA-3"；U6正向5，-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3"，反 向5，-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3"；Bax正向5，-GGCCCACCAGCTCTGAGCAGA-3"，反向5，-GCCACGTGGGCGTCCCAAAGT-3"；β-actin正向5，-GGACCTGACTGACTACCTC-3"，反向5，-TACTCCTGCTTGCTGAT-3"。根據(jù)反應的Ct值分析目的基因表達變化，計算方法為2法。

1.3 動脈瘤血管平滑肌細胞分離培養(yǎng)

取動脈瘤組織，用眼科剪小心將組織剪碎成1 cm×1 cm×1 cm的組織塊，添加Ⅱ型膠原酶（0.1%），置于37℃充分消化，觀察組織塊表面有白色絮狀物出現(xiàn)時將組織塊取出，再用眼科剪將組織塊剪成1 mm×1 mm×1 mm大小，轉移到細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，組織塊之間間隔4 cm，置于37℃，5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。8 h后，取出培養(yǎng)瓶，添加10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。觀察細胞爬出組織塊后的第5天，將組織塊棄掉，繼續(xù)加入細胞培養(yǎng)液3 mL，細胞生長密度為90%時進行傳代培養(yǎng)，期間每隔1天換液1次，傳代培養(yǎng)細胞消化液用0.25%的胰蛋白酶。分離培養(yǎng)的細胞經(jīng)過免疫熒光鑒定為血管平滑肌細胞。

1.4 細胞轉染

血管平滑肌細胞分成Control、miRNC、miR-211共3組，其中miR-NC、miR-211組分別為轉染mimics control、miR-211 mimics后的血管平滑肌細胞，Control為空白對照細胞。細胞轉染方法簡述如下：取生長狀態(tài)較好的血管平滑肌細胞，接種到6孔板中，每孔接種2×10個細胞，觀察細胞融合度為70%時可以進行細胞轉染。吸取250μL的DMEM將mimics control、miR-211 mimics以及5μL的Lipofectamin 2000轉染試劑稀釋，然后將上述兩種稀釋溶液混合，總體積一共為500μL，置于室溫中靜置20 min。添加上述混合溶液加入到6孔板中，輕輕晃動培養(yǎng)板，培養(yǎng)6 h后，更換細胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后收集細胞用于后續(xù)實驗。

1.5 流式細胞術測定細胞凋亡

取培養(yǎng)2 d以后的Control、miR-NC、miR-211組細胞，用0.25%的胰蛋白酶將細胞消化成單細胞懸浮液，加入磷酸緩沖鹽溶液（PBS）溶液將細胞洗滌2次。收集5×10個細胞，添加結合緩沖液溶液400μL，然后加入膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI）溶液5μL，混合均勻以后，放在4℃避光條件孵育15 min；再加入碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）溶液10μL，同樣在4℃避光條件孵育15 min。用流式細胞儀檢測細胞凋亡變化。

1.6 miR

-

211靶基因預測和鑒定

生物信息學數(shù)據(jù)庫TargetScan顯示，miR-211和Bax的3"非翻譯區(qū)（UTR）端有互補結合位點。分別將野生型（wt）-Bax、突變型（mut）-Bax與miR-211 mimics、mimics control共轉染到血管平滑肌細胞中，培養(yǎng)2 d后，用熒光素酶活性檢測試劑盒測定各組細胞熒光素酶活性變化。wt-Bax、mut-Bax分別為含有Bax的3"UTR端、含有突變后Bax的3"UTR端的熒光素酶報告載體，熒光素酶報告載體均由吉滿生物科技（上海）有限公司構建。

1.7 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）測定Bax蛋白表達

收集培養(yǎng)2 d后的Control、miR-NC、miR-211組細胞，在細胞中添加PBS溶液將細胞洗滌2次，加入苯甲基磺酞氟（PMSF）濃度為1 mmol/L的蛋白裂解試劑，以移液槍將細胞反復吹打混合后，用細胞刮刀將細胞從培養(yǎng)皿的底部刮下，放在冰上孵育20 min。14 000 g離心15 min，吸取上清，添加1/4體積的上樣緩沖液，在沸水浴中孵育5 min。分別配制10%的分離膠和5%的濃縮膠，每個孔中添加30μg的蛋白樣品，在濃縮膠中采用75 V的電壓電泳，在分離膠中采用100 V電壓電泳。將聚偏二氟乙烯（PVDF）膜裁剪成合適大小，以恒流300 mA轉膜60 min。把PVDF膜放在配制好的5%脫脂奶粉溶液中浸泡2 h。然后將PVDF膜置于含有1∶600稀釋的二抗反應液中，于4℃環(huán)境中結合過夜。最后把PVDF膜放在1∶2 000稀釋的二抗反應液中，在室溫中孵育2 h。用電化學發(fā)光（Electro-Chemi-Luminescence，ECL）顯色，分析條帶的灰度值。以β-肌動蛋白（β-actin）作為內(nèi)參，分析Bax蛋白表達水平。

1.8 上調(diào)Bax對miR

-

211影響血管平滑肌細胞凋亡作用

將miR-211 mimics分別與Bax過表達載體（pcDNA3.1-Bax）、陰性對照載體（pcDNA3.1）共轉染到血管平滑肌細胞中，記為miR-211+Bax、miR-211+NC組，按照上述流式細胞術、Western blotting測定細胞凋亡率、Bax蛋白表達水平。pcDNA3.1-Bax為Bax過表達載體，由基爾頓生物科技（上海）有限公司構建合成。

2 結果

2.1 顱內(nèi)動脈瘤中miR

-

211、Bax表達水平呈負相關

顱內(nèi)動脈瘤中miR-211表達水平低于正常顱內(nèi)動脈血管［（0.59±0.03）比（1.74±0.10），

t

=14.13，

P

＜0.001］；顱內(nèi)動脈瘤中Bax mRNA表達水平高于正常顱內(nèi)動脈血管［（1.25±0.05）比（0.45±0.04），

t

=9.77，

P

＜0.001］；顱內(nèi)動脈瘤中miR-211表達水平與Bax mRNA表達水平呈負相關（

r

=-0.646，

P

＜0.001）。miR-211在顱內(nèi)動脈瘤中低表達，Bax在顱內(nèi)動脈瘤中高表達。

2.2 miR

-

211 mimics抑制血管平滑肌細胞凋亡影響

與miR-NC組比較，miR-211組血管平滑肌細胞中miR-211表達水平升高，細胞凋亡率降低（

P

＜0.05，圖1、表1）。miR-211 mimics抑制血管平滑肌細胞凋亡。

2.3 miR

-

211和Bax靶向調(diào)控作用

miR-211和Bax的3"UTR端有互補結合位點，并且miR-211 mimics和wt-Bax共轉染后細胞熒光素酶活性降低（

P

＜0.05，圖2、表2）。miR-211和Bax互為靶向關系。

圖2 miR-211和B細胞淋巴瘤-2相關X蛋白（Bax）的3"非翻譯區(qū)（UTR）端結合位點

表1 miR-211 mimics轉染后顱內(nèi)動脈瘤血管平滑肌細胞中miR-211水平和細胞凋亡率比較/±s

表2 野生型（wt）、突變型（mut）轉染后顱內(nèi)動脈瘤血管平滑肌細胞熒光素酶活性比較/±s

2.4 上調(diào)miR

-

211抑制血管平滑肌細胞中Bax表達

miR-211 mimics轉染后顱內(nèi)動脈瘤血管平滑肌細胞中Bax蛋白表達水平分別為Control組（0.86±0.09）、miR-NC組（0.88±0.07）、miR-211組（0.45±0.06）（

F

=31.934，

P

=0.001）；與miR-NC組比較，miR-211組血管平滑肌細胞中Bax蛋白水平降低（

P

＜0.05，圖3）。上調(diào)miR-211抑制血管平滑肌細胞中Bax表達。

圖3 Western blotting檢測miR-211 mimics對顱內(nèi)動脈瘤血管平滑肌細胞中Bax蛋白表達影響

2.5 Bax逆轉miR

-

211對血管平滑肌細胞凋亡影響

與miR-211+NC組比較，miR-211+Bax組血管平滑肌細胞中Bax蛋白表達水平升高，細胞凋亡率升高（

P

＜0.05，圖4、表3）。Bax逆轉miR-211對血管平滑肌細胞凋亡影響。

3 討論

miRNA是真核生物體內(nèi)固有的非編碼小分子RNA，其在生物體中能夠轉錄后調(diào)控靶基因的表達，影響下游信號轉導、蛋白表達。miRNA在進化上高度保守，在數(shù)量、表達、結構、序列上具有多樣性，miRNA在細胞分化、組織代謝、胚胎發(fā)育等過程中發(fā)揮強大功能。研究報道顯示，miRNA參與腫瘤、心腦血管系統(tǒng)疾病、免疫相關疾病等進展，這些miRNA在疾病發(fā)生時表達改變，并且通過調(diào)控細胞凋亡等生物學行為影響疾病進程。miR-211參與腫瘤、心腦血管疾病發(fā)生，miR-211通過不同的作用機制影響細胞凋亡。本次實驗表明，miR-211在顱內(nèi)動脈瘤中表達下調(diào)，miR-211可能參與顱內(nèi)動脈瘤發(fā)生。

表3 pcDNA3.1-Bax和miR-211 mimics共轉染后顱內(nèi)動脈瘤血管平滑肌細胞凋亡率和B細胞淋巴瘤-2相關X蛋白（Bax）蛋白表達水平比較/±s

細胞凋亡是機體經(jīng)過內(nèi)源性DNA內(nèi)切酶激活，通過一系列的調(diào)控作用而誘發(fā)的結束細胞生命的復雜過程。正常情況下，血管平滑肌細胞凋亡是維持血管平衡的重要原因，血管平滑肌細胞過度凋亡能夠降低血管壁承受的張力。研究顯示，在顱內(nèi)動脈瘤組織中發(fā)現(xiàn)血管平滑肌細胞過度凋亡，并且動脈瘤破裂的血管平滑肌細胞凋亡率高于未破裂組，血管平滑肌細胞凋亡水平增加不僅是誘導顱內(nèi)動脈瘤發(fā)生的重要原因，也是誘導顱內(nèi)動脈瘤破裂的重要原因。本次實驗顯示，上調(diào)miR-211后的顱內(nèi)動脈瘤血管平滑肌細胞凋亡水平降低，提示miR-211可能具有抗顱內(nèi)動脈瘤發(fā)生的作用。

miRNA生物學功能多樣與其獨特的調(diào)控機制有關，其可以結合到靶mRNA的3"UTR端而抑制其翻譯，并且miRNA在不同的組織或病理、生理進程中的靶基因可能不同。miR-211作用廣泛，目前已經(jīng)在多種組織中發(fā)現(xiàn)多個靶基因，miR-211參與宮頸癌進展與靶向調(diào)控SPARC有關，miR-211參與胃癌進展與SOX4有關，而miR-211調(diào)控心肌細胞凋亡則與靶向調(diào)控Sirt1有關。本次實驗表明，miR-211可以靶向負調(diào)控血管平滑肌細胞中Bax表達。Bax是一個與細胞凋亡有關的調(diào)控蛋白，其屬于Bcl-2蛋白家族成員，Bax在細胞凋亡過程中發(fā)揮促進作用。本次實驗顯示，Bax在顱內(nèi)動脈瘤組織中的表達水平升高，并且Bax表達水平與miR-211水平負相關，上調(diào)Bax可以逆轉miR-211對血管平滑肌細胞凋亡的抑制作用，這充分證實，miR-211通過靶向調(diào)控Bax表達減少顱內(nèi)動脈瘤血管平滑肌細胞凋亡。

以上表明，miR-211在顱內(nèi)動脈瘤中低表達，上調(diào)其表達可以靶向抑制Bax表達減少血管平滑肌細胞凋亡，miR-211在顱內(nèi)動脈瘤發(fā)生過程中可能發(fā)揮抑制作用，目前對于miR-211靶向Bax通過何種具體調(diào)控機制影響血管平滑肌細胞凋亡機制還不清楚，在以后實驗中會繼續(xù)探討。本次實驗結果為研究顱內(nèi)動脈瘤分子發(fā)生機制提供了參考，為基因治療顱內(nèi)動脈瘤提供了可能。