細胞核內(nèi)的遺傳物質(zhì)，它在腫瘤的形成和發(fā)展過程中起著重要的作用。核外的線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）是在具有DNA基因組的細胞中存在的唯一的核外遺傳物質(zhì)。這種遺傳物質(zhì)具有DNA基因組，能夠自主復(fù)制。因線粒體內(nèi)氧濃度較高，長期暴露于這種高濃度氧環(huán)境下的mtDNA容易發(fā)生突變。其中mtDNA的1 120 bp（16025-576）組成的D環(huán)區(qū)是突變的熱點所在，其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用正備受關(guān)注，在胃癌、腸癌、鼻咽癌等實體惡性腫瘤中，已見到針對該區(qū)域相關(guān)突變位點的相關(guān)報道，但這些報道均未涉及mtDNA在惡性腫瘤發(fā)生和演變中的作用和機制。本研究于2017年1月至2019年6月將肺癌細胞突變mtDNA片段轉(zhuǎn)染小鼠胚胎成纖維細胞NIH3T3，觀察mtDNA片段在成纖維細胞核內(nèi)的整合情況，并觀察轉(zhuǎn)染細胞的生物學行為變化，以探討變異的mtDNA在腫瘤發(fā)病機制中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠胚胎成纖維細胞NIH3T3及肺癌細胞A549、H226購于上海福祥生物科技有限公司。G480、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染Lipofection2000轉(zhuǎn)染試劑均購自英韋創(chuàng)津（Invintrogen）公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶購自Gibco公司；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT），二甲基亞砜（DMSO）、姬姆素染料（Giemsa stain）購自Sigma-Aldrich公司。本課題組將突變的肺癌細胞mtDNA的D環(huán)區(qū)插入到pcDNA3.1（+）載體BamH I，構(gòu)建了XhoⅠ位點間的重組表達載體。分別命名為pcDNA3.1（+）-A549 mtDNA、pcDNA3.1（+）-H226 mtDNA；mtDNA提取試劑盒購自杭州維特潔（V-gene）生物技術(shù)公司；熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）試劑盒購于天津灝洋生物科技公司；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）是從上海碧云天生物科技有限公司購得的。流式細胞儀購自Epics Elite，Coulter Corporation，U.S.A。

1.2 方法

1.2.1

細胞培養(yǎng) 將NIH3T3、A549及H226細胞在含100 mL/L胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)，待生長至對數(shù)生長期時，用適當量的9 g/L胰蛋白酶消化后，培養(yǎng)貼壁生長良好的細胞。

1.2.2

細胞轉(zhuǎn)染與篩選 將胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)處于對數(shù)生長期的NIH3T3細胞，先以計數(shù)板計數(shù)細胞濃度后，細胞濃度進一步調(diào)整到大約1×10個/毫升，將2 mL的細胞懸液接種于6孔板。用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組載體（pcDNA3.1（+）-A549 mtDNA、pcDNA3.1（+）-H226 mtDNA）轉(zhuǎn)染NIH3T3細胞，具體轉(zhuǎn)染操作過程參考英偉創(chuàng)津（Invintrogen）公司的Lipofection2000說明書。將轉(zhuǎn)染了重組載體的6孔板，置入二氧化碳飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，以遺傳霉素418（Geneticin418，G418）行抗性篩選。將轉(zhuǎn)染了重組載體的NIH3T3分別命名為NIH3T3/A549-mtDNA、NIH3T3/H226-mtDNA。

1.2.3

NIH3T3細胞染色體核型分析 將不同組別的細胞分別加入25 mg/L秋水仙素2 h，終止細胞分裂，收集細胞；加入37℃預(yù)熱的0.075 mol/L 8 mL的氯化鉀溶液20 min，加入新鮮配制的固定液，2 000 r/min離心5 min，棄上清，重復(fù)兩次；細胞懸液滴在預(yù)冷的濕片上，烤干，9 g/L胰蛋白酶，不添加乙二胺四乙酸（EDTA）EDTA，2%的Gimsa染色5 min后，油鏡下觀察染色體。

1.2.4

FISH mtDNA探針由天津灝洋生物制品科技有限公司設(shè)計，通過PCR法合成。探針3"端標記地高辛，5"端標記熒光素。探針1：A aactccaccattagcaccc；A"ggtggctggcagtaatgta，產(chǎn)物大小144；探針2：B ctgccagccaccatgaatat；B"gggacgagaagggatttg，產(chǎn)物大小262。將探針稀釋成終濃度為5 mg/L，當在75℃恒溫水浴中孵育5 min，并立即放置在0℃5 min以變性mtDNA探針，用70%甲酰胺/2×檸檬酸鈉緩沖液（SSC）在75℃下變性2～3 min。將樣品用70%、90%和100%的冰乙醇梯度脫水5 min，然后干燥空氣。標本加100μL含變性的mtDNA探針的雜交液［雜交液里含50%去離子甲酰胺、5×SSC、10%硫酸葡聚糖、5×Denhardt液、2%十二烷基磺酸鈉（SDS）100μg/mL，硅精魚DNA］，42℃雜交過夜。用50%甲酰胺/2×SSC洗滌3次，5分鐘/次，1×SSC洗滌3次，5分鐘/次，室溫干燥玻片。滴加抗地高辛熒光抗體免疫球蛋白G（IgG）液（0.2 g/L）與小牛血清（終濃度為5%）的混合液，37℃避光溫育20 min以放大信號，經(jīng)封片，在激光顯微鏡下觀察染色體間期細胞核上的黃綠色熒光。

1.2.5

四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法（MTT法）測定細胞增殖 以每孔1.5×10的單細胞懸液種植于96孔板，加入200μL的DMEM PRMI-1640高糖培養(yǎng)基，每組設(shè)3個復(fù)孔，在不同的時間點，添加MTT溶液30μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，并丟棄上清液，加入DMSO 200μL，30 min后在570 nm波長下，通過酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）測定孔光的吸收值，并記錄結(jié)果。實驗重復(fù)3次，記錄不同組細胞0 h、24 h、48 h、72 h 570 nm所測吸光度的數(shù)據(jù)。

1.2.6

流式細胞儀檢測細胞凋亡 棄培養(yǎng)基，細胞與1μL與Annexin V-FITC混合2 min后，加入5μL碘化丙啶。細胞在室溫下培養(yǎng)5 min。流式細胞儀檢測細胞凋亡。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染前較轉(zhuǎn)染后NIH3T3細胞染色體核型分析

NIH3T3是小鼠胚胎成纖維細胞，正常小鼠染色體數(shù)目為40條，20對（包括性染色體）。圖1示：NIH3T3/A549-mtDNA、NIH3T3/H226-mtDNA的染色體出現(xiàn)了易位（箭頭1所示）、斷裂（箭頭2所示）的染色體結(jié)構(gòu)畸形。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染肺癌細胞mtDNA的NIH3T3細胞具有惡性轉(zhuǎn)化的趨勢。不同視野下畸變的多倍體數(shù)目和染色體數(shù)目占全部染色體數(shù)目百分比具體見表1。

圖1 轉(zhuǎn)染前后小鼠胚胎成纖維細胞NIH3T3染色體核型（×1 000）：A為NIH3T3/A549-線粒體DNA（mtDNA）的核型；B為NIH3T3/H226-mtDNA的核型；C為NIH3T3的核型

表1 不同視野小鼠胚胎成纖維細胞NIH3T3的畸形的多倍體數(shù)目和染色體數(shù)目占全部染色體數(shù)目百分比/（%，±s）

2.2 熒光原位雜交結(jié)果

MtDNA探針是一種分離重排探針，針對處于有絲分裂間期細胞核，此期細胞核因未進行有絲分裂而處于無絲狀結(jié)構(gòu)的狀態(tài)，根據(jù)堿基互補配對原則，有熒光物質(zhì)的探針與目標DNA結(jié)合后，融合成黃色的陽性雜交信號。本實驗中，通過熒光顯微鏡觀察到2條mtDNA探針在NIH3T3/A549-mtDNA、NIH3T3/H226-mtDNA的細胞染色體間期核中均出現(xiàn)黃色的陽性雜交信號；在未轉(zhuǎn)染重組載體的NIH3T3細胞染色體間期核中無陽性雜交信號。說明突變的mtDNA能夠整合在處于有絲分裂間期的NIH3T3細胞核中。

2.3 轉(zhuǎn)染后NIH3T3細胞的增殖率較轉(zhuǎn)染前NIH3T3增加

用MTT法檢測不同組別NIH3T3細胞在570 nm波長下的吸光度，發(fā)現(xiàn)經(jīng)轉(zhuǎn)染了不同重組載體的NIH3T3，經(jīng)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h的吸光度高于未轉(zhuǎn)染的NIH3T3細胞；且同一組別NIH3T3細胞隨著培養(yǎng)時間的增加，吸光度逐漸增加。進一步反映出，隨時間增加轉(zhuǎn)染后NIH3T3細胞的增殖率高于轉(zhuǎn)染前NIH3T3細胞。見表2。

2.4 轉(zhuǎn)染后NIH3T3細胞的凋亡率較轉(zhuǎn)染前NIH3T3降低

流式細胞儀檢測不同組別NIH3T3細胞的凋亡率，NIH3T3/A549-mtDNA組（5.20±0.20）%、NIH3T3/H226-mtDNA組（7.75±0.11）%較NIH3T3組（19.04±0.08）%細胞的凋亡率明顯下降（

F

=8 381.21，

P＜

0.001）。說明轉(zhuǎn)染了重組表達載體后，在一定程度上抑制了NIH3T3細胞的凋亡。

3 討論

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和人類對腫瘤的易感性、基因突變，遺傳物質(zhì)的改變等多因素密切相關(guān)。核DNA（cDNA）是細胞核內(nèi)的重要遺傳物質(zhì)，具有一定的穩(wěn)定性，但突變的cDNA通過影響細胞的轉(zhuǎn)錄、翻譯及蛋白表達變化從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。MtDNA具有更加脆弱、突變率高的特點，因而，在近年來，突變的mtDNA與腫瘤的發(fā)生關(guān)系越來越得到國內(nèi)外學者的關(guān)注。Altafi等也報道了mtDNA D-環(huán)區(qū)幾乎全是外顯子，長期持續(xù)暴露于線粒體高氧濃度的環(huán)境中，由于缺乏組蛋白保護和完整的修復(fù)系統(tǒng)，mtDNA容易與化學致癌物質(zhì)結(jié)合，造成損傷和突變，同時釋放大量活性氧自由基，從而引起腫瘤的發(fā)生。人們在鼻咽癌、大腸癌、肝癌、血液系統(tǒng)等多種惡性腫瘤中，在mtDNA D-Loop均檢測到的突變或多態(tài)性變化位點。雖然先前的文獻報道在多種腫瘤細胞或腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)的mtDNA D-環(huán)區(qū)的突變，但在具體涉及到腫瘤發(fā)生過程中的可能機制則為少見。NIH3T3是研究惡性轉(zhuǎn)化的靶細胞，當腫瘤細胞中提取的DNA導(dǎo)入到該細胞中，能夠通過將其惡性轉(zhuǎn)化，從而形成惡性轉(zhuǎn)化灶。在本研究中，為探討突變的mtDNA D環(huán)在腫瘤發(fā)生過程中的初步機制，我們通過選取NIH3T3細胞，將突變的肺癌A549、H226細胞的mtDNA的D環(huán)區(qū)導(dǎo)入其中，通過研究其在細胞中的整合、被轉(zhuǎn)染的NIH3T3細胞染色體核型、增殖率及凋亡率的變化，以期初步探明mtDNA在腫瘤發(fā)生演變中的作用。

表2 轉(zhuǎn)染前后小鼠胚胎成纖維細胞NIH3T3的570 nm處吸光度變化/±s

有研究報道，在物理、化學及某些生物因素的作用下，mtDNA常會發(fā)生缺失和重組，而線粒體膜也可發(fā)生破碎、裂解，從而導(dǎo)致胞質(zhì)中的mtDNA碎片的形成。細胞質(zhì)中含有大量游離mtDNA及其片段，核酸降解酶活性高，線粒體RNA反轉(zhuǎn)錄多。此外，在細胞核中還有核孔和DNA連接酶，當細胞質(zhì)中DNA酶和DNA酶樣物質(zhì)的數(shù)量和質(zhì)量受到影響時，游離mtDNA或mtDNA片段有機會整合到核DNA中，像一些腫瘤病毒一樣，這些核孔會隨機整合到核DNA中。Ju發(fā)現(xiàn)突變的mtDNA片斷隨機整合入核基因組可能在腫瘤發(fā)生過程中起重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，通過FISH法檢測到外源性的突變的mtDNA能夠隨機整合到NIH3T3細胞的核基因組內(nèi)，引起導(dǎo)致NIH3T3細胞染色體核型發(fā)生了突變和斷裂，呈多倍體表現(xiàn)。染色體核型部分缺失或者異位異常，可能激活或滅活該部位基因的功能的改變，常引起一些染色體異常相關(guān)性疾病。Ardern-Holmes等研究發(fā)現(xiàn)2型神經(jīng)纖維瘤?。∟F2）是由于22q12號染色體上NF2基因的突變而形成了中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤。但染色體核型異常與腫瘤的發(fā)生關(guān)系尚不明確。本研究進一步研究發(fā)現(xiàn)外源性突變mtDNA誘導(dǎo)NIH3T3細胞的生物學行為發(fā)生變化，具有惡性轉(zhuǎn)化的傾向。主要體現(xiàn)在空NIH3T3和轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1（+）-A549 mtDNA、pcDNA3.1（+）-H226 mtDNA的NIH3T3細胞的增殖率升高，而凋亡率則下降。

肺癌細胞突變的mtDNA導(dǎo)入NIH3T3細胞能夠?qū)е缕渖飳W行為發(fā)生一系列改變，初步具有惡性傾向，表明高突變肺癌mtDNA D環(huán)區(qū)可誘導(dǎo)NIH3T3細胞惡性轉(zhuǎn)化。