吳 凡，李惠杰，楊光宇，郭亞?wèn)|，胡秋芬，梁夢(mèng)潔

(1.云南民族大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院，昆明 650504；2.云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，昆明 650106；3.昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，昆明 650504；4.云南云天化股份有限公司研發(fā)中心，昆明 650228)

眾所周知，吸煙可導(dǎo)致肺癌、呼吸系統(tǒng)疾病和心腦血管疾病等多種疾病，這是由于香煙煙霧是一種豐富的自由基來(lái)源，它通過(guò)活性氧(ROS)的直接傳遞和炎癥細(xì)胞的激活促進(jìn)ROS的內(nèi)源性生成，產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷。8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷(8-OHdG)和8-羥基鳥(niǎo)苷(8-OHG)分別對(duì)應(yīng)脫氧核糖核酸和核糖核酸的氧化損傷[1]，而且這兩種化合物在體內(nèi)化學(xué)穩(wěn)定性好，其含量的測(cè)定可為有效評(píng)價(jià)機(jī)體的氧化損傷提供幫助，在疾病病理研究過(guò)程中常作為氧化應(yīng)激的生物標(biāo)記物[2-3]。

尿液可通過(guò)無(wú)創(chuàng)取樣，因此樣品易得。尿液中8-OHdG 和8-OHG 的測(cè)定可為有效，評(píng)價(jià)機(jī)體各種因素引起的氧化損傷提供關(guān)鍵數(shù)據(jù)，尿液中8-OHd G 和8-OHG 的測(cè)定在國(guó)內(nèi)外引起了廣泛的關(guān)注[4-5]。目前測(cè)定8-OHd G 和8-OHG 的方法有酶聯(lián)免疫法、氣相色譜-質(zhì)譜法、電化學(xué)方法、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等[6-8]。其中，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)選擇性好、靈敏度高，在8-OHd G 和8-OHG 測(cè)定中得到了廣泛應(yīng)用[9-14]。但尿液樣品基質(zhì)復(fù)雜，樣品前處理需用固相萃取、液液萃取、柱層析等方法進(jìn)行凈化，而且尿液樣品取樣后需超低溫冷凍保存，試驗(yàn)前需解凍后才能進(jìn)行前處理。尿液樣品的前處理不但操作繁瑣，而且引入誤差的因素較多。因此，尋找高效、簡(jiǎn)便的8-OHdG和8-OHG 測(cè)定方法十分必要。

本工作自主設(shè)計(jì)了樣品離心分離和過(guò)濾裝置對(duì)尿液樣品進(jìn)行前處理，并結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分別測(cè)定不同吸煙者尿液樣品中的8-OHd G和8-OHG，兩種化合物在4.5 min內(nèi)可達(dá)到完全分離。方法用于實(shí)際尿液樣品中8-OHdG 和8-OHG的測(cè)定，取得滿意結(jié)果。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，包括Waters Acquity型超高效液相系統(tǒng)、API-5500型三重四極桿質(zhì)譜檢測(cè)器和Analyst色譜工作站。

8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷和8-羥基鳥(niǎo)苷的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:1.00 g·L－1，分別稱取8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷和8-羥基鳥(niǎo)苷的標(biāo)準(zhǔn)品100 mg于100 mL容量瓶中，用甲醇定容，于4 ℃冰箱保存，有效期為3個(gè)月。

內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備溶液:10 mg·L－1，稱取15N5-8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷(15N5-8-OHd G)標(biāo)準(zhǔn)品1 mg于100 mL容量瓶中，用甲醇定容。

內(nèi)標(biāo)溶液:5μg·L－1，移取50μL 的10 mg·L－1內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備溶液至100 mL容量瓶中，用適量水溶解并定容。

8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷和8-羥基鳥(niǎo)苷標(biāo)準(zhǔn)品的純度均不小于98%；15N5-8-OHd G 標(biāo)準(zhǔn)品的純度不小于98%；其余試劑均為色譜純；試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

1)色譜條件 Synergi Polar-RP 色譜柱(50 mm×2.0 mm，2.5μm)，Synergi Polar-RP保護(hù)柱(5 mm×2.0 mm，2.5μm)，柱溫30 ℃；流量10μL·min－1；進(jìn)樣體積5.0μL；進(jìn)樣針距瓶底2.0 mm。流動(dòng)相:A 為10 g·L－1乙酸銨溶液，B 為甲醇。梯度洗脫程序:0～1.0 min 時(shí)，A 為80%；1.0～2.0 min時(shí)，A 由80%降至60%；2.0～4.5 min時(shí)，A 由60%降至10%；4.5～5.0 min時(shí)，A 由10%升至80%，保持3.0 min。

2)質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI)，正離子模式；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式；霧化氣壓力410 kPa，氣簾氣壓力240 kPa，輔助加熱氣壓力275 kPa；碰撞電壓20 V，去簇電壓45 V，電噴霧電壓5 500 V；駐留時(shí)間150 ms。其余質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 MS parameters

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品離心分離和過(guò)濾裝置

自主設(shè)計(jì)的樣品離心分離和過(guò)濾裝置見(jiàn)圖1。

圖1 樣品離心分離和過(guò)濾裝置Fig.1 Device for centrifugation and filtration of the sample

由圖1可知:該裝置由離心管(a)和帶0.45μm過(guò)濾篩板和密封圈的內(nèi)套管(b)組成。尿液樣品離心完成后，在離心管中插入帶過(guò)濾篩板的內(nèi)套管，并向下壓(c)，樣品溶液即可從內(nèi)套管的細(xì)管中流出，用色譜進(jìn)樣瓶收集流出的過(guò)濾液用于分析。

1.3.2 8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷和8-羥基鳥(niǎo)苷的測(cè)定

將招募的志愿者分為3組:非吸煙者、輕度吸煙者(每天5～15支)、中度吸煙者(每天15～25支)、重度吸煙者(每天25～50支)。分別收集每位志愿者的尿液于容器中，待處理。

移取2.5 mL采集的尿液樣品于10 mL離心管中，加入250μL 的5μg·L－1內(nèi)標(biāo)溶液，然后用甲醇定容到5.0 mL(控制樣品介質(zhì)中甲醇的體積分?jǐn)?shù)約為50%)。樣品充分搖勻后于－4 ℃保存。分析時(shí)，將離心管以12 000 r·min－1轉(zhuǎn)速離心10 min，取下離心管，在離心管中插入帶有過(guò)濾篩板和密封圈的內(nèi)套管，并向下按壓，用色譜進(jìn)樣瓶收集流出的過(guò)濾液，按儀器工作條件進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜行為

按儀器工作條件對(duì)8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷和8-羥基鳥(niǎo)苷的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(含5μg·L－1的內(nèi)標(biāo))進(jìn)行測(cè)定，其多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖見(jiàn)圖2。

由圖2可知:8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷和8-羥基鳥(niǎo)苷在4.5 min內(nèi)可達(dá)到完全分離。梯度洗脫運(yùn)行完成回到起始點(diǎn)僅需3.0 min就可達(dá)到平衡，可繼續(xù)進(jìn)行下一個(gè)樣品分析。和常規(guī)液相色譜法相比，本方法有效縮短了分析時(shí)間。

2.2 樣品穩(wěn)定劑的選擇

圖2 8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷和8-羥基鳥(niǎo)苷混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖Fig.2 MRM chromatograms of mixed standard solution of 8-OHdG and 8-OHG

新鮮尿液樣品穩(wěn)定性差，在室溫下樣品中的目標(biāo)物會(huì)在活性酶的作用下繼續(xù)代謝而發(fā)生變化，也有可能會(huì)在微生物的作用下發(fā)生變質(zhì)。在傳統(tǒng)方法中，樣品需用超低溫冰箱冷凍保存，樣品分析時(shí)，需解凍并平衡到室溫才能進(jìn)行樣品前處理，操作繁瑣且處理周期長(zhǎng)。為了簡(jiǎn)化樣品前處理流程，試驗(yàn)采用在尿液樣品中加入甲醇穩(wěn)定樣品后直接于－4 ℃保存的方法。一方面，甲醇的加入可讓樣品中的活性酶失活，阻止目標(biāo)物繼續(xù)代謝分解；另一方面，甲醇的加入還能抑制樣品中微生物的繁殖，限制了因微生物繁殖而引起的樣品變質(zhì)和目標(biāo)物變化。

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn):采集尿液樣品后立即進(jìn)行分析，測(cè)得8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷、8-羥基鳥(niǎo)苷的質(zhì)量濃度依次為4.28，8.22μg·L－1。在采集的尿液樣品中加入甲醇(控制樣品介質(zhì)中甲醇的體積分?jǐn)?shù)約為50%)于－4 ℃放置一周后再進(jìn)行分析，測(cè)得8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷、8-羥基鳥(niǎo)苷的質(zhì)量濃度依次為4.15，8.01μg·L－1。8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷、8-羥基鳥(niǎo)苷在1周內(nèi)的降解率不超過(guò)5%，即當(dāng)樣品介質(zhì)中甲醇的體積分?jǐn)?shù)約為50%時(shí)，尿液樣品中的8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷和8-羥基鳥(niǎo)苷可保持穩(wěn)定。試驗(yàn)選擇樣品穩(wěn)定劑為甲醇，控制樣品介質(zhì)中甲醇的體積分?jǐn)?shù)約為50%。

2.3 樣品凈化方法的選擇

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的測(cè)定靈敏度能達(dá)到尿液樣品中8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷和8-羥基鳥(niǎo)苷直接測(cè)定的要求，但在傳統(tǒng)方法中，一般還需通過(guò)固相萃取凈化樣品，以消除基質(zhì)效應(yīng)對(duì)樣品測(cè)定的干擾。為了簡(jiǎn)化樣品凈化步驟，試驗(yàn)采用在實(shí)際尿液樣品中加入8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷和8-羥基鳥(niǎo)苷的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，讓標(biāo)準(zhǔn)曲線的基質(zhì)和樣品基質(zhì)基本保持一致，扣除了基質(zhì)效應(yīng)干擾，這樣樣品可不經(jīng)固相萃取凈化直接進(jìn)樣分析。

尿液樣品需經(jīng)離心分離、濾膜過(guò)濾后才可進(jìn)樣分析。為了更簡(jiǎn)便地實(shí)現(xiàn)樣品過(guò)濾，試驗(yàn)自主設(shè)計(jì)了樣品離心分離和過(guò)濾的裝置(圖1)。此裝置可不經(jīng)過(guò)樣品轉(zhuǎn)移就能實(shí)現(xiàn)樣品過(guò)濾。和常規(guī)方法中把離心后的樣品轉(zhuǎn)移出來(lái)再用針頭過(guò)濾器過(guò)濾相比，此裝置簡(jiǎn)化了凈化步驟。

2.4 色譜柱的選擇

由于8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷和8-羥基鳥(niǎo)苷的反相保留效果較差，因此需要通過(guò)提高流動(dòng)相中水相比例或增加色譜柱長(zhǎng)度來(lái)增強(qiáng)保留作用，但持續(xù)的高比例水相會(huì)影響常規(guī)C18色譜柱的使用壽命。Synergi Polar-RP液相色譜柱(50 mm×2.0 mm，2.5μm)為極性端基封尾的醚連接苯基相色譜柱，特別適合大極性及芳香族化合物的分離，可用于分離8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷和8-羥基鳥(niǎo)苷。為了獲得更好的色譜分離效果，試驗(yàn)選用Synergi Polar-RP 液相色譜柱(50 mm×2.0 mm，2.5μm)。

2.5 質(zhì)譜條件的選擇

為了獲取較好的穩(wěn)定性和靈敏度，將5.0μg·L－1的8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷和8-羥基鳥(niǎo)苷的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(含5μg·L－1的內(nèi)標(biāo))注入ESI中，在正離子模式下對(duì)8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷和8-羥基鳥(niǎo)苷及內(nèi)標(biāo)進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜掃描，得到它們的準(zhǔn)分子離子[M＋H]＋，然后對(duì)準(zhǔn)分子離子進(jìn)行子離子掃描，得到離子碎片信息，定性離子對(duì)和定量離子對(duì)見(jiàn)表1。試驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)碰撞能量、去簇能量等參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，試驗(yàn)選擇的質(zhì)譜條件見(jiàn)1.2節(jié)。

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和測(cè)定下限

用含50%(體積分?jǐn)?shù))甲醇的空白尿液樣品(含5μg·L－1的內(nèi)標(biāo))稀釋混合1.00 g·L－1的8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷和8-羥基鳥(niǎo)苷的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液得到0.5，1.0，2.5，5.0，10，20，40μg·L－1的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，按試驗(yàn)方法對(duì)其進(jìn)行測(cè)定，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷和8-羥基鳥(niǎo)苷的線性范圍均為0.2～40μg·L－1，線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表2。

根據(jù)3倍信噪比計(jì)算方法的檢出限(3S/N)，根據(jù)10倍信噪比計(jì)算方法的測(cè)定下限(10S/N)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和測(cè)定下限Tab.2 Linear regression equations，correlation coefficients，detection limits and lower limits of determination

2.7 精密度和回收試驗(yàn)

隨機(jī)選取一份中度吸煙者的尿液樣品，按試驗(yàn)方法進(jìn)行分析，并進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，平行測(cè)定7次，連續(xù)測(cè)定7 d，計(jì)算日內(nèi)、日間的回收率及測(cè)定值的日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)、日間RSD，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝7)Tab.3 Results of tests for precision and recovery(n＝7)

由表3可知:日內(nèi)回收率、日間回收率分別為92.3%～96.3%，93.4%～96.3%，日內(nèi)RSD 和日間RSD 分別為1.6%～3.0%，2.8%～3.4%。這說(shuō)明方法具有較好的回收率和精密度。

2.8 樣品分析

按試驗(yàn)方法分析12名志愿者(包括非吸煙者、輕度吸煙者、中度吸煙者、重度吸煙者)的尿液樣品，樣品分析結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 樣品分析結(jié)果Tab.4 Analytical results of the samples μg·L－1

由表4可知:非吸煙者尿液中8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷和8-羥基鳥(niǎo)苷含量較吸煙者尿液中8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷和8-羥基鳥(niǎo)苷含量低；不同吸煙者尿液中的8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷和8-羥基鳥(niǎo)苷含量和吸煙量有一定相關(guān)性。

采用Spearman Rank Correlation 方法[15]，對(duì)吸煙者的不同吸煙水平與尿液中8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷和8-羥基鳥(niǎo)苷含量間的相關(guān)性進(jìn)行分析。結(jié)果表明:吸煙者尿液中8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷含量和8-羥基鳥(niǎo)苷含量均與吸煙水平呈正相關(guān)(相關(guān)系數(shù)均為0.972 0，概率均小于0.000 1)。吸煙者吸煙程度越大，其尿液中的8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷和8-羥基鳥(niǎo)苷含量越高。因此，吸煙者尿液中8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷和8-羥基鳥(niǎo)苷含量均與吸煙水平相關(guān)。通過(guò)8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷和8-羥基鳥(niǎo)苷的測(cè)定可初步判斷人體卷煙煙氣暴露水平。

本工作采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測(cè)定吸煙者尿液中8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷和8-羥基鳥(niǎo)苷的含量。方法操作簡(jiǎn)單，簡(jiǎn)化了前處理步驟，同時(shí)能夠獲得較好的回收率和精密度，可用于大批量尿液樣品的分析，為評(píng)估吸煙行為對(duì)氧化應(yīng)激損傷的影響提供了科學(xué)的依據(jù)。