章碧靜 呂偉旗 陳健苗

絡石藤系夾竹桃科藤本植物絡石Trachelospermum jasminoides（Lindl.）Lem.的干燥帶葉藤莖，性苦，微寒，歸心、肝、腎經，具有祛風通絡，涼血消腫的功效，臨床多用于治療風濕熱痹，筋脈拘攣，腰膝酸痛，喉痹，癰腫，跌撲損傷等癥[1-2]。研究表明，絡石藤干燥藤莖中富含木脂素、黃酮、萜類、甾醇、生物堿等多種化學成分[2-4]，具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗氧化、降血脂等藥理活性[5-6]。絡石藤在我國安徽、浙江、陜西、江西、云南、廣西等省均有分布，南北跨度較大，而現(xiàn)有報道多集中在化學成分[7]、藥理作用[8]、偽品鑒別[9]、臨床應用[10]等方面，針對不同產地絡石藤木脂素含量測定的研究鮮有報道，已有的含量測定也僅集中在少數產地[11]。木脂素類（絡石苷、去甲絡石苷）是絡石藤的主要有效成分，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抑菌等藥理活性，絡石苷是2020 年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定的質量評價標準之一[1]。本研究收集安徽、浙江、陜西、江西、云南等絡石藤主分布區(qū)種質資源19 份，建立高效液相色譜法（HPLC）對其干燥藤莖中絡石苷與去甲絡石苷進行含量測定，分析其與原植物生長性狀、產地生境因子（經緯度、海拔）間的相關性，以期為絡石藤藥材質量控制提供試驗依據。

1 材 料

1.1 絡石藤種質資源 2019 年11 月—2019 年12月，采集浙江、安徽、陜西、江西、云南、廣西、湖南、河南等省絡石藤種質資源19 份，經浙江省麗水市人民醫(yī)院藥學部陳健苗主任藥師鑒定為夾竹桃科絡石T.jasminoides 的干燥帶葉藤莖，見表1。

1.2 儀器與試劑 2695 型高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；FRQ-1008HT 小型超聲波清洗機（杭州法蘭特超聲波科技有限公司）；ESJ120-4A 型電子分析天平（沈陽龍騰電子有限公司）；DHG-9053A 型臺式鼓風干燥箱（無錫瑪瑞特科技有限公司）；小型多功能粉碎機（拜杰儀器有限公司）；SHB-IIIG 型臺式循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿有限公司）；絡石苷（B20810，上海源葉生物科技有限公司）；去甲絡石苷（PR3275，信陽市中檢計量生物科技有限公司）；色譜乙腈、色譜甲醇（上海耀勘化工有限公司）；其他甲醇等試劑為分析純（國藥集團化學試劑有限公司）。

表1 絡石藤樣品信息

2 方 法

2.1 生長性狀測定 取絡石藤新鮮藤莖，用卷尺測量藤莖長，用游標卡尺測量藤莖粗、葉片中脈長（葉長）與葉寬，計算葉長寬比=葉長/葉寬，n=15。

2.2 木脂素含量測定

2.2.1 色譜條件 Agilent Extend-C18 色譜柱（4.6×250mm，5μm），流動相乙腈-0.2%冰醋酸溶液，體積流速1.0mL/min，檢測波長λ=280nm，柱溫28℃，進樣量10μL，HPLC 色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.2.2 線性關系考察 配制濃度分別為0.612、1.224、1.836、2.448、3.060、6.120mg/L 的絡石苷標準品溶液，及濃度為0.128、0.256、0.384、0.512、0.640、1.280mg/L的去甲絡石苷標準品溶液，過0.45μm 微孔濾膜，在“2.2.1”色譜條件下進樣，以峰面積Y 為縱坐標，標準品濃度X 為橫坐標，得絡石苷線性方程為Y1=3537.1X1－67273，R2=0.9995，在61.2～612μg/mL 范圍內線性關系良好，得去甲絡石苷線性方程為Y2=4218.8X1－16603，R2=0.9996，在12.8～128μg/mL 范圍內線性關系良好。

2.2.3 樣品溶液制備 將絡石藤切片，60℃烘箱烘至恒重，粉碎過60 目篩，置于干燥器中保存待用。精密稱取粉末2g，置具塞錐形瓶中，加入甲醇80mL，稱重，浸泡過夜，室溫超聲處理（功率250W，頻率35kHz）30min，冷卻至室溫，甲醇補足失重，抽濾，濾液定容至100mL 容量瓶。吸取樣品溶液適量，過0.45μm 微孔濾膜，在“2.2.1”色譜條件下進樣，測定峰面積（n=3）。

2.2.4 精密度試驗 取絡石苷與去甲絡石苷對照品，過0.45μm 微孔濾膜，在“2.2.1”色譜條件下進樣6 次，測定絡石苷與去甲絡石苷峰面積RSD 分別為0.22%與0.18%，表明儀器精密度良好。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗 取浙江仙居樣品，在“2.2.3”條件下制備樣品溶液，在“2.2.1”色譜條件下分別于2、4、8、12、16、20、24h 進樣，測得絡石苷與去甲絡石苷峰面積RSD 分別為1.06%與1.78%，表明樣品溶液在24h 穩(wěn)定性良好。

2.2.6 重復性試驗 取浙江仙居樣品，連續(xù)稱樣6次，在“2.2.3”條件下制備樣品溶液，在“2.2.1”色譜條件下進樣，測得該樣品絡石苷與去甲絡石苷平均含量分別為2.43mg/g 與8.39mg/g，RSD 為2.01%與1.66%，表明方法重復性良好。

2.2.7 加樣回收率試驗 精密稱取絡石苷與去甲絡石苷含量已知的浙江仙居樣品適量，加入適量標準品，在“2.2.3”條件下制備樣品溶液，在“2.2.1”色譜條件下進樣，測定峰面積，計算加樣回收率，試驗平行6次，見表2。

表2 加樣回收率試驗（n=6）

2.3 統(tǒng)計學方法 不同產地間絡石藤生長性狀、木脂素類成分含量比較應用SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件單因素ANOVA 方差分析，木脂素類成分含量與生境因子間相關性分析應用Excel 2010 數據分析中相關系數工具包，絡石藤聚類分析應用SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件組間聯(lián)接法[12]，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 生長性狀比較 19 個產地絡石藤生長性狀存在差異（P＜0.05 或P＜0.01），藤莖長與藤莖粗的變幅分別為3.45～9.32m 與1.78～4.56mm，其中云南大姚絡石藤藤莖長、藤莖粗、葉長指標數值最大，分別為9.32m、4.56mm 與8.26cm，云南巧家絡石藤葉片最寬，葉寬數值為3.21cm，廣西西林絡石藤葉片最為狹長，葉長寬比數值為2.76，而陜西漢陰絡石藤葉片最為寬鈍，葉長寬比數值最小，僅為1.47，見表3。

3.2 木脂素類成分含量比較 19 個產地絡石藤中去甲絡石苷與絡石苷含量存在差異（P＜0.01），平均含量分別為2.05mg/g 與6.84mg/g，變幅為1.19～2.89mg/g 與4.75～10.02mg/g。從絡石苷含量看，供試19 個產地絡石藤中絡石苷含量均滿足2020 年版《中華人民共和國藥典》[1]規(guī)定不低于4.5mg/g 的標準，表明供試絡石藤藥材質量良好。19 個產地中，浙江與河南樣品中去甲絡石苷與絡石苷含量較高，湖南樣品次之，安徽、陜西、江西、云南與廣西樣品含量較低，其中浙江縉云樣品去甲絡石苷含量最高，為2.89mg/g，是其他樣品的1.05～2.43 倍，浙江磐安樣品絡石苷含量最高，為10.02mg/g，是其他樣品的1.07～2.11 倍，見表3。

3.3 相關性分析 供試絡石藤中絡石苷、去甲絡石苷與生長性狀、生境因子關系密切（見表4）。絡石苷與藤莖長、藤莖粗、葉長、葉長寬比、經度、緯度呈正相關關系，其中與經度正相關性最高，相關系數為0.6835，與葉長寬比正相關性次之，相關系數為0.3317，與海拔呈唯一負相關關系，相關系數為-0.4216，而與葉寬相關性較低，相關系數僅為0.0167；去甲絡石苷與葉長寬比、經度、緯度呈正相關關系，其中與經度正相關性最高，相關系數為0.5224，與葉長寬比正相關性次高，相關系數為0.1801，與葉寬、海拔呈負相關關系，其中與海拔負相關關系最高，相關系數為-0.2914，而與葉長相關性較低，相關系數僅為0.0503。相關性分析結果表明，在供試經緯度與海拔范圍內，高經緯度、低海拔地區(qū)種植絡石藤有利于其藤莖中絡石苷與去甲絡石苷成分含量積累。

3.4 聚類分析 以木脂素含量與生長性狀為參考指標，根據歐式距離D2=18.05 將19 個產地劃分為4 個類群（見圖2）。第Ⅰ類群共4 個產地，為云南與廣西產地，包括云南大姚、云南巧家、廣西西林與廣西樂業(yè)，該類群絡石藤植株較高，藤莖較粗壯，葉片大而狹長，但絡石苷與去甲絡石苷含量較低；第Ⅱ類群共8 個產地，為浙江、湖南與河南產地，該類群絡石藤植株中等高度，葉片較大或中等大小，葉型多狹長少寬厚，絡石苷與去甲絡石苷含量較高；第Ⅲ類群僅2 個產地，為安徽休寧與安徽祁門，該類群絡石藤植株較矮，藤莖較細，葉片小而多寬厚，絡石苷與去甲絡石苷含量較低；第Ⅳ類群共5 個產地，包括陜西藍田、陜西漢陰、江西永新、陜西柞水與江西婺源，該類群絡石藤植株最矮，藤莖細，葉片小而寬厚，絡石苷與去甲絡石苷含量較低。

表3 絡石藤生長性狀、木脂素類成分含量比較

表4 絡石藤中2 種木脂素含量與生長性狀、生境因子間的相關性

圖2 19 批絡石藤樣品聚類分析圖

4 討論

絡石苷是2020 年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定的絡石藤藥材及其飲片的主要質量評價指標，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抑菌等藥理活性，在已有文獻與2020年版《中華人民共和國藥典》的基礎上[1，11]，本試驗考察了提取溶劑（甲醇、80%甲醇、乙醇）、提取方式（超聲、加熱回流、索式提?。⑻崛r間（20min、30min、40min）、流動相（甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.2%冰醋酸）及檢測波長對絡石藤中絡石苷與去甲絡石苷含量測定的影響，發(fā)現(xiàn)以甲醇為提取溶劑，在室溫超聲（功率250W，頻率35kHz）提取30min 即可提取完全，在Agilent Extend-C18 色譜柱（4.6×250mm，5μm），流動相乙腈-0.2%冰醋酸，流速1.0mL/min，檢測波長280nm，柱溫28℃，進樣量10μL 的色譜條件下，洗脫效果較好，去甲絡石苷與絡石苷的保留時間分別為22.51min 與28.36min，色譜峰分離度均＞1.5，理論塔板數＞4500，定量限分別為2.86μg/mL 與5.28μg/mL，檢測限為2.13μg/mL 與3.95μg/mL。本試驗建立HPLC 測定絡石藤干燥帶葉藤莖中去甲絡石苷與絡石苷含量操作簡單，重復性好，準確度高，可用于絡石藤藥材質量評價與質量控制。

19 個產地絡石藤中去甲絡石苷、絡石苷含量存在差異（P＜0.01），其中浙江與河南樣品含量較高，湖南樣品次之，安徽、陜西、江西、云南與廣西樣品含量較低；經度、緯度、海拔與絡石藤中去甲絡石苷、絡石苷含量積累關系密切，在供試經緯度與海拔范圍內，高經緯度、低海拔地區(qū)種植絡石藤有利于其藤莖中絡石苷與去甲絡石苷成分含量積累；從絡石苷與去甲絡石苷含量看，絡石藤優(yōu)良種質選育可優(yōu)先在高經緯度、低海拔的浙江與河南產地中選擇，而從藤莖產量指標看，可優(yōu)先在云南與廣西產地中選擇。中藥材中有效成分含量受諸多環(huán)境因素影響，這些環(huán)境因素之間往往具有自相關性[13]。本實驗將進一步在絡石藤優(yōu)良種質篩選的基礎上，開展不同種質在同一區(qū)域（不同海拔）條件下種植實驗，以期篩選出高木脂素含量、高產量的絡石藤優(yōu)良種質。同時，因絡石藤在我國分布較廣，課題組將進一步收集其他分布區(qū)如廣東、江蘇、貴州等種質資源，擴充絡石藤種質資源庫，為絡石藤優(yōu)良品種選育提供種質資源。