黃愛(ài)華 王 旸

敗血癥是重癥監(jiān)護(hù)病房入院的主要原因，其死亡率和發(fā)病率均極高。在敗血病患者中，內(nèi)皮細(xì)胞活化和功能障礙繼發(fā)的彌漫性血管滲漏和炎癥反應(yīng)是多器官衰竭的主要原因[1-3]。膿毒癥中的內(nèi)皮激活導(dǎo)致多種促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生以及粘附分子選擇素（E/P-selectins）和細(xì)胞間粘附分子-1（ICAM-1）的上調(diào)，導(dǎo)致多形核中性粒細(xì)胞大量浸潤(rùn)，過(guò)度炎癥，組織損傷，并最終導(dǎo)致器官功能障礙[4-5]。Yes 相關(guān)蛋白（YAP）是Hippo 信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子，在多種腫瘤中發(fā)揮著促癌作用[6]。此前研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥模型中，內(nèi)皮細(xì)胞YAP 表達(dá)量增加，而內(nèi)皮特異性缺失YAP 小鼠加重膿毒癥中血管功能障礙和彌漫性炎癥反應(yīng)，提示YAP 在膿毒癥內(nèi)皮細(xì)胞活化過(guò)程中起到負(fù)反饋調(diào)節(jié)的作用[7]。然而膿毒癥中YAP 表達(dá)量增加的原因尚未明確。研究表明，多種MicroRNA 在膿毒癥的多種細(xì)胞中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[8-9]。因此本研究擬探討膿毒癥小鼠miRNA 對(duì)YAP 的調(diào)控機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng) 物 40 只SPF 級(jí)C57BL/6 小鼠（雄性，6～8周齡，體質(zhì)量20～25g）購(gòu)買并飼養(yǎng)于杭州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（浙）2019-0002，使用許可證號(hào)SYXK（浙）2019-0011。飼養(yǎng)條件：SPF 級(jí)屏障中，白天黑夜各12h，給予充足食物和無(wú)菌水。所有操作均符合杭州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查要求（倫理批號(hào)：20200126）。

1.2 試 劑 小鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基（批號(hào)025646）購(gòu)自武漢普諾賽生物科技有限公司；腫瘤壞死因子-α（TNF-α，批號(hào)1321）、白介素-6（IL-6，批號(hào)03216、85165）等炎癥因子檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D Systems。抗體：YAP 兔單抗（批號(hào)16651）、ICAM 兔單抗（批號(hào)a2365）、選擇素（E-selectin）兔單抗（批號(hào)a32356）、磷酸化核因子激活的B 細(xì)胞的κ-輕鏈增強(qiáng)p65 亞基（p-p65）兔單抗（批號(hào)a21320）、核因子激活的B 細(xì)胞的κ-輕鏈增強(qiáng)p65 亞基（p65）兔單抗（批號(hào)a15135）均購(gòu)自美國(guó)CST 公司。甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內(nèi)參。mimic NC 及miR-27b-3p mimic（批號(hào)15461）購(gòu)自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司。

1.3 儀 器 酶標(biāo)儀SpectraMax 5 購(gòu)自美谷分子儀器（上海）有限公司；CFX96 Touch 熒光定量PCR 儀，Trans-Blot Turbo 全能型蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)均購(gòu)自伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司；Odyssey TMLi-COR 檢測(cè)系統(tǒng)購(gòu)自上?；蛴邢薰荆?80℃超低溫冰箱購(gòu)自美國(guó)Thermo fisher。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 小鼠CLP 模型構(gòu)建 盲腸結(jié)扎穿孔（CLP）模型構(gòu)建參考文獻(xiàn)[10]進(jìn)行操作。將40 只SPF 級(jí)C57BL/6 小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、CLP 組、miRNA 類似物（mimic NC）組、miR-27b-3p 類似物（miR-27b-3p mimic）組，每組10 只。CLP 組、mimic NC 組、miR-27b-3p 組使用三棱針穿刺盲腸輕輕地壓縮擠出少量盲腸內(nèi)容物誘導(dǎo)小鼠膿毒癥發(fā)生，對(duì)照組進(jìn)行假手術(shù)。術(shù)后miR-27b-3p 組小鼠予尾靜脈注射miR-27b-3p mimic（1×108/mL，200μL/只），mimic NC 組小鼠予尾靜脈注射mimic NC 陰性對(duì)照物（1×108/mL，200μL/只）。24h 后取小鼠肺組織分離小鼠原代肺內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 小鼠原代肺內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)及處理 將上述四組小鼠原代肺內(nèi)皮細(xì)胞提取出來(lái)后進(jìn)行體外培養(yǎng)及后續(xù)實(shí)驗(yàn)。小鼠原代肺內(nèi)皮細(xì)胞利用小鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞長(zhǎng)至90%時(shí)傳代或鋪板。取2～4 代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 小鼠肺內(nèi)皮上清TNF-α、IL-6 含量測(cè)定 上述四組細(xì)胞體外鋪板培養(yǎng)24h 后，取上清經(jīng)過(guò)離心，過(guò)0.22μm 濾膜，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒檢測(cè)上清TNF-α、IL-6 含量，應(yīng)用SpectraMax 5檢測(cè)450nm 處吸光度值，取3 次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.4 qRT-PCR 檢測(cè)miR-27b-3p、YAP、ICAM、Eselectin mRNA 水平 將上述四組細(xì)胞鋪板于6 孔板中，24h 后提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)為cDNA后，進(jìn)行qRT-PCR（熒光定量PCR），qRT-PCR 引物如下：miR-27b-3p（Forward：5' ATGACACCAAGGACCAGAGC 3'，Reverse：5' GTGTAAGGACCCATCGGAGA 3'）；YAP（Forward：5' CAAGAAAGCAGGCTCACAGAA 3'，Reverse：5' GCTGGGTGTTAGGGCTTCG 3'）；ICAM（Forward：5' GAAATGCCACCTTTTGACAGTG 3'，Reverse：5' CTGGATGCTCTCATCAGGACA 3'）；E-selectin（Forward：5' GGCGTTAGAAAGCATCCTTCC 3'，Reverse：5' GCAGAGGGCACACTCAAAGT 3'）。所有引物均購(gòu)自南京金斯瑞生物科技有限公司。

2.5 Western blot 法檢測(cè)YAP、ICAM、E-selectin 及p-p65 蛋白水平 將上述四組細(xì)胞鋪板24h 后，應(yīng)用蛋白裂解液裂解細(xì)胞蛋白，經(jīng)過(guò)BCA 法測(cè)定蛋白濃度后各取20μg/孔進(jìn)行蛋白免疫印跡（Western blot），經(jīng)過(guò)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，于4℃孵育一抗過(guò)夜，一 抗 包 括YAP、ICAM、E -selectin、p -p65、p65 及GAPDH。洗去一抗后室溫孵育熒光二抗1h。應(yīng)用Odyssey TMLi-COR 檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行熒光定量檢測(cè)。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q 檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 CLP 模型小鼠內(nèi)皮細(xì)胞YAP、ICAM、E-selectin mRNA 表達(dá)水平 應(yīng)用CLP 誘導(dǎo)小鼠膿毒癥模型，取小鼠肺組織進(jìn)行HE 染色，病理觀察顯示，對(duì)照組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)基本完整，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。而CLP 組小鼠肺組織具有嚴(yán)重的組織學(xué)改變，包括肺泡充血、滲出液和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。進(jìn)一步qRT-PCR 結(jié)果顯示，與假手術(shù)組小鼠比較，CLP 組小鼠肺內(nèi)皮細(xì)胞YAP、ICAM、E-selectin mRNA 表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）。見(jiàn)表1，圖1。

表1 各組小鼠肺內(nèi)皮細(xì)胞YAP、ICAM、E-selectin mRNA相對(duì)表達(dá)量（）

表1 各組小鼠肺內(nèi)皮細(xì)胞YAP、ICAM、E-selectin mRNA相對(duì)表達(dá)量（）

注：對(duì)照組小鼠進(jìn)行假手術(shù)操作；CLP 組小鼠通過(guò)CLP 誘導(dǎo)膿毒癥；CLP 為盲腸結(jié)扎穿孔；YAP 為Yes 相關(guān)蛋白；ICAM 為細(xì)胞間粘附分子；E-selectin 為選擇素；與對(duì)照組比較，aP＜0.05

圖1 CLP 模型小鼠肺組織形態(tài)（HE 染色×400）

3.2 CLP 小鼠肺內(nèi)皮細(xì)胞miR-27b-3p 表達(dá)水平miRNA 靶基因數(shù)據(jù)庫(kù)PITA 預(yù)測(cè)調(diào)控YAP 的miRNA 為miR-27b-3p，預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，miR-27b-3p 與YAP mRNA 3' UTR 序列存在6 個(gè)完全互補(bǔ)配對(duì)堿基UGUGAA。進(jìn)一步qRT-PCR 檢測(cè)CPL 組小鼠肺內(nèi)皮細(xì)胞miR-27b-3p 表達(dá)，結(jié)果顯示，與對(duì)照組（1.00±0.11）比較，CLP 組miR-27b-3p（0.31±0.15）表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 miR-328-5p 靶向SPON2 基因3'UTR 序列

3.3 miR-27b-3p 調(diào)控YAP 表達(dá)及內(nèi)皮激活 與對(duì)照組比較，CLP 組YAP、ICAM、E-selectin 表達(dá)水平明顯升高，同時(shí)p-p65 磷酸化活化水平明顯升高；與mimic NC 組比較，miR-27b-3p mimic 組ICAM、Eselectin 表達(dá)水平明顯升高，同時(shí)p-p65 磷酸化活化水平明顯升高。見(jiàn)圖3。

圖3 各組小鼠肺內(nèi)皮YAP、ICAM、E-selectin 表達(dá)及p65 活化水平

3.4 miR-328-5p 直接靶向SPON2 抑制其表達(dá) 與對(duì)照組比較，CLP 組小鼠內(nèi)皮細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6 的含量明顯升高（P＜0.05）；與mimic NC 組比較，miR-27b-3p mimic 組小鼠內(nèi)皮細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6 的含量明顯升高（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組內(nèi)皮細(xì)胞上清液TNF-α、IL-6 水平比較（pg/mL，）

表2 各組內(nèi)皮細(xì)胞上清液TNF-α、IL-6 水平比較（pg/mL，）

注：對(duì)照組小鼠進(jìn)行假手術(shù)操作；CLP 組小鼠通過(guò)CLP 誘導(dǎo)膿毒癥；mimic NC 組小鼠通過(guò)CLP 誘導(dǎo)膿毒癥，同時(shí)術(shù)后尾靜脈注射mimic NC 陰性對(duì)照物；miR-27b-3p mimic 組小鼠通過(guò) CLP 誘導(dǎo)膿毒癥，同時(shí)術(shù)后尾靜脈注射miR-27b-3p mimic；TNF-α 為腫瘤壞死因子-α；IL-6 為白介素-6；CLP 為盲腸結(jié)扎穿孔；與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與mimic NC 組比較，bP＜0.05

4 討論

創(chuàng)傷、休克及感染導(dǎo)致的血管內(nèi)皮功能障礙和炎癥反應(yīng)是膿毒癥發(fā)生的主要機(jī)制[11-12]。調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞異常激活對(duì)防止膿毒癥發(fā)生、降低死亡率具有重要的意義。miRNA 是一類微小RNA，在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用。Essandoh 和Fan[13]通過(guò)芯片篩選發(fā)現(xiàn)，膿毒癥組和健康對(duì)照組人群之間共有22個(gè)差異表達(dá)的miRNA，其中9 個(gè)表達(dá)上調(diào)、13 個(gè)表達(dá)下調(diào)。Qiu 等[14]發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)非編碼RNA TUG1 通過(guò)調(diào)控miR-34b-5p 表達(dá)，參與膿毒癥過(guò)程中內(nèi)皮細(xì)胞的活化和炎癥反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-27b-3p 在膿毒癥內(nèi)皮細(xì)胞中低表達(dá)（P＜0.05），提示miR-27b-3p 在內(nèi)皮細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中可能發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。

YAP 是一種轉(zhuǎn)錄共激活因子，通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡而成為組織生長(zhǎng)和器官大小的關(guān)鍵調(diào)控分子。心臟和血管平滑肌細(xì)胞YAP 在心血管發(fā)育過(guò)程中也起到重要的調(diào)控作用[15-16]。而在膿毒癥研究中發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細(xì)胞缺失YAP 小鼠內(nèi)皮細(xì)胞異常激活，炎癥反應(yīng)異常加劇[17]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，膿毒癥模型小鼠內(nèi)皮細(xì)胞YAP 表達(dá)量明顯升高（P＜0.05），同時(shí)在膿毒癥模型小鼠尾靜脈注射miR-27b-3p mimic 后，內(nèi)皮細(xì)胞YAP 表達(dá)量明顯下調(diào)（P＜0.05）。研究報(bào)道，內(nèi)毒素作用于內(nèi)皮細(xì)胞可以激活打孔蛋白（Gasdermin D），進(jìn)而釋放線粒體DNA 到胞質(zhì)中，后者作為第二形式參與調(diào)控YAP1 信號(hào)來(lái)抑制內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)[18]。然而YAP 調(diào)控的炎癥下游信號(hào)并未明確?；诖?，本研究結(jié)果顯示，miR-27b-3p mimic 組p-p65 亞基磷酸化水平明顯升高，下游激活標(biāo)志物ICAM、E-selectin 表達(dá)明顯上調(diào)，同時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞分泌的炎癥因子TNF-α、IL-6 水平明顯上調(diào)（P＜0.05），表明miR-27b-3p 可能負(fù)向調(diào)控YAP 表達(dá)，參與調(diào)控膿毒癥過(guò)程中內(nèi)皮細(xì)胞的活化以及炎癥反應(yīng)。

綜上所述，膿毒癥內(nèi)皮細(xì)胞miR-27b-3p 表達(dá)下調(diào)，通過(guò)靶向調(diào)控YAP 轉(zhuǎn)錄水平，促進(jìn)炎癥相關(guān)信號(hào)p65 亞基的激活，導(dǎo)致下游內(nèi)皮細(xì)胞活化相關(guān)蛋白ICAM、E-selectin 表達(dá)增加，加劇膿毒癥炎癥反應(yīng)。