楊林子，盧云浩，何強(qiáng)

(四川大學(xué) 輕工科學(xué)與工程學(xué)院，成都 610065)

郫縣豆瓣是中國傳統(tǒng)發(fā)酵調(diào)味品，迄今已有三百多年歷史，以其醬香濃郁、味辣香醇、紅棕油亮等特點(diǎn)，被譽(yù)為“川菜之魂”[1]。郫縣豆瓣在自然條件下，由多種類型的微生物與原料經(jīng)長達(dá)半年的協(xié)同發(fā)酵而成，其獨(dú)特風(fēng)味的形成主要來源于微生物在相對封閉的混合發(fā)酵環(huán)境中產(chǎn)生的各種呈香物質(zhì)[2]。酯類物質(zhì)是郫縣豆瓣等發(fā)酵食品中常見的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)[3]，尤其是乙酯類和乙酸酯類物質(zhì)，其閾值較低，在低濃度時可以呈現(xiàn)出令人愉悅的香氣，平衡產(chǎn)品整體風(fēng)味；濃度較高時，則會使食品中缺少果香風(fēng)味，影響產(chǎn)品質(zhì)量[4]。發(fā)酵食品中的酯類物質(zhì)主要通過微生物途徑產(chǎn)生，化學(xué)合成途徑反應(yīng)時間長且緩慢[5]，因此，探究微生物的酯合成途徑和能力對于控制發(fā)酵食品整體風(fēng)味具有重要意義。

本研究采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，通過建立化

學(xué)反應(yīng)體系探究郫縣豆瓣中地衣芽孢桿菌和埃切假絲酵母的酯合成途徑和能力，以期進(jìn)一步加深對發(fā)酵過程中酯合成機(jī)制的認(rèn)識，為加速和改善郫縣豆瓣酯類風(fēng)味物質(zhì)的形成提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

地衣芽孢桿菌(NCBI登記號：MK063711)、埃切假絲酵母(NCBI登記號：MK063704):四川大學(xué)食品系實(shí)驗(yàn)室保藏菌株，分離自郫縣豆瓣。

1.2 材料與試劑

營養(yǎng)肉湯、YPD液體培養(yǎng)基：1%酵母膏、2%葡萄糖、2%蛋白胨，購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

己酸乙酯、乙酸己酯等標(biāo)準(zhǔn)品：購自Sigma公司；己醇、三乙酸甘油酯及其他化學(xué)試劑：均為分析純，購自阿拉丁公司。

1.3 儀器與設(shè)備

SPME手動進(jìn)樣手柄、DVB/CAR/PDMS(50/30 μm)萃取頭 美國Supelco公司；QP2010 GC-MS 日本島津公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 胞外提取液的制備

地衣芽孢桿菌接種至營養(yǎng)肉湯，埃切假絲酵母接種至YPD液體培養(yǎng)基，分別于28 ℃和37 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)至對數(shù)生長期末期，取活化2次后的菌液在10000 g、4 ℃的條件下離心10 min，取其上清液作為胞外提取液，保存于-18 ℃?zhèn)溆?，采用Bradford法測定其蛋白含量[6]。

1.4.2 建立化學(xué)反應(yīng)體系

酯合成反應(yīng)體系的建立參照Liu等[7]的方法。各體系包括菌株胞外提取液、磷酸鈉鹽緩沖液以及反應(yīng)底物，在酯化體系中，反應(yīng)底物為100 mmol/L己酸(乙酸)和100 mmol/L乙醇(己醇)；醇解體系為100 mmol/L己醇與33 mmol/L三乙酸甘油酯。反應(yīng)體系pH均調(diào)整為5.5，接近郫縣豆瓣發(fā)酵pH值。各體系建立后立即靜置于30 ℃恒溫水浴鍋中進(jìn)行反應(yīng)，每隔20 min檢測一次。

1.4.3 pH值對菌株酯合成活力的影響

酯合成反應(yīng)體系的建立參照1.4.2，利用緩沖液調(diào)節(jié)各體系的pH值分別為4，5，6，在30 ℃條件下靜置反應(yīng)1 h后檢測其產(chǎn)酯情況。

1.4.4 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的提取

各體系反應(yīng)結(jié)束后，立即放置于60 ℃水浴鍋中，插入萃取頭，采用頂空固相微萃取的方法吸附30 min后，將萃取頭插入GC-MS進(jìn)樣口，250 ℃解吸3 min。

1.4.5 GC-MS分析

1.4.5.1 氣相色譜條件

DB-5MS毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，載氣為氦氣，流速為1.0 mL/min；不分流進(jìn)樣；升溫程序：初始溫度40 ℃，保持2 min，以5 ℃/min的速度升至60 ℃，再以8 ℃/min升至140 ℃，最后以12 ℃/min升至250 ℃保持8 min。

1.4.5.2 質(zhì)譜條件

電子電離源，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，接口溫度250 ℃，質(zhì)量掃描范圍30～500 m/z，溶劑延遲時間1 min。

1.4.5.3 揮發(fā)性物質(zhì)的定性

主要采用譜庫檢索和保留指數(shù)兩種方法對各體系中酯類和前體物質(zhì)進(jìn)行定性。譜庫檢索主要依據(jù)所檢測物質(zhì)的質(zhì)譜信息與NIST 14譜庫作比較，根據(jù)相似度進(jìn)行取舍，一般大于80%時對該物質(zhì)予以確認(rèn)；保留指數(shù)鑒定法是以C8～C12的正構(gòu)烷烴為標(biāo)準(zhǔn)，計算樣品中揮發(fā)性物質(zhì)的保留指數(shù)，與其他文獻(xiàn)中相同物質(zhì)的保留物質(zhì)進(jìn)行比較。

1.4.5.4 揮發(fā)性物質(zhì)的定量

采用外標(biāo)法進(jìn)行定量(μg/mL)，并定義1個酯合成酶活力單位(1 U)為1 h內(nèi)體系合成1 nmol對應(yīng)的酯，酯合成比活力為U/μg蛋白。

1.5 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3個平行，并采用SPSS 25.0對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析和顯著性分析(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 酯化途徑

微生物合成酯類物質(zhì)的常見途徑主要包括酯化、醇解、酸解和酯交換途徑，酯化途徑是指一種酸和一種醇在酯酶的作用下合成相應(yīng)酯類的過程，酯酶是能夠催化酯鍵水解和形成的酶的總稱[8]；醇解途徑是指一種醇與甘油酯類物質(zhì)在酯酶或?；D(zhuǎn)移酶的作用下合成相應(yīng)酯的過程，?；D(zhuǎn)移酶可以將甘油酯上的酰基直接轉(zhuǎn)移給醇，且酯酶在水環(huán)境下也可以發(fā)揮?；D(zhuǎn)移酶的作用[9-10]；酸解和酯交換途徑通常用于合成具有營養(yǎng)功能的結(jié)構(gòu)化油脂，與食品風(fēng)味關(guān)系不大，本次實(shí)驗(yàn)中未考察。

在酯化反應(yīng)體系中，地衣芽孢桿菌和埃切假絲酵母能夠合成己酸乙酯和乙酸己酯，且產(chǎn)量隨時間的增加而不斷增長，由圖1可知，實(shí)驗(yàn)菌株可以通過酯化途徑合成酯類物質(zhì)。隨著反應(yīng)時間的增加，各體系中的酯合成速率不斷變化，但總體呈減緩趨勢，表明在微生物酯酶的作用下，酯化反應(yīng)作為可逆反應(yīng)，逐漸趨向于平衡的狀態(tài)。在反應(yīng)60 min時，埃切假絲酵母合成己酸乙酯和乙酸己酯產(chǎn)量分別為101.546 μg/mL和1.573 μg/mL，均顯著高于地衣芽孢桿菌，表明埃切假絲酵母的酯化能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于地衣芽孢桿菌。在整個反應(yīng)過程中，各菌株合成己酸乙酯的產(chǎn)量始終比乙酸己酯高，說明實(shí)驗(yàn)菌株通過酯化途徑合成乙酯類物質(zhì)的能力相對較強(qiáng)，這與Lu等[11]在郫縣豆瓣中檢測到大量乙酯類物質(zhì)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

圖1 酯化體系中地衣芽孢桿菌(A)與埃切假絲酵母(B)合成酯類物質(zhì)的產(chǎn)量Fig.1 The yield of esters synthesized by Bacillus licheniformis (A) and Candida etchellsii (B) in esterification systems

2.2 醇解途徑

由圖2可知，地衣芽孢桿菌和埃切假絲酵母均可在醇解體系中合成乙酸己酯，但其合成的途徑存在兩種可能：一是醇解途徑，三乙酸甘油酯上的乙酰基在微生物酯酶或?；D(zhuǎn)移酶的作用下，被直接轉(zhuǎn)移至己醇而形成乙酸己酯；二是“兩步”反應(yīng)，即三乙酸甘油酯上的乙?；淮罅克馍梢宜?，隨后乙酸與己醇反應(yīng)形成乙酸己酯，這個過程的反應(yīng)結(jié)果與醇解途徑類似，但實(shí)為酯化途徑[12]。因此，地衣芽孢桿菌和埃切假絲酵母是否可以通過醇解途徑合成乙酸己酯還需要進(jìn)一步分析。

圖2 醇解體系中地衣芽孢桿菌(A)和埃切假絲酵母(B)合成乙酸己酯和乙酸的含量Fig.2 The content of hexyl acetate and acetic acid synthesized by Bacillus licheniformis (A) and Candida etchellsii (B) in alcoholysis systems

在反應(yīng)前期(0～20 min)，乙酸己酯和乙酸的含量隨時間的增長不斷增加，其中乙酸己酯的增長速率和含量均高于乙酸，表明在地衣芽孢桿菌和埃切假絲酵母的作用下，三乙酸甘油酯上的乙酰基在反應(yīng)前期被同時轉(zhuǎn)移到己醇和水中，且轉(zhuǎn)移至己醇合成乙酸己酯的速率大于其水解形成乙酸的速率，即在這個過程中有醇解反應(yīng)的發(fā)生，表明這兩株菌可以通過醇解途徑合成酯類物質(zhì)。Liu等[13]的研究中有類似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，酯合成速率及產(chǎn)量遠(yuǎn)高于脂肪酸的釋放，相對于水分子，乙?；赡芨鼉A向于選擇己醇作為目標(biāo)底物，但也不能完全排除酯化反應(yīng)的存在。反應(yīng)20 min時，圖2中A的乙酸含量達(dá)到最大值9.61 μg/mL，隨后乙酸大幅度下降，乙酸己酯含量出現(xiàn)波動且在60 min時達(dá)到11.17 μg/mL，這可能是由于在地衣芽孢桿菌還原酶的作用下，乙酸形成的速率遠(yuǎn)低于被還原形成乙醇的速率，導(dǎo)致乙醇的大量增長(數(shù)據(jù)未顯示)，打破了體系的平衡狀態(tài)，使乙酸己酯在反應(yīng)40 min后發(fā)生了水解。由圖2中B可知，乙酸己酯在20 min后以較低的速率繼續(xù)增長，而乙酸含量下降，表明三乙酸甘油酯水解形成乙酸的速率遠(yuǎn)低于參與酯化反應(yīng)消耗乙酸的速率；在反應(yīng)40 min后，乙酸己酯發(fā)生水解，其含量小幅度下降，最終達(dá)到26.52 μg/mL，導(dǎo)致乙酸含量的適度增長，故在該體系的反應(yīng)中后期有酯化反應(yīng)的存在。

綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，埃切假絲酵母和地衣芽孢桿菌可以通過酯化和醇解兩種途徑合成酯類物質(zhì)，具有較強(qiáng)的酯合成能力，不僅是郫縣豆瓣中的優(yōu)勢產(chǎn)酯菌株，還廣泛應(yīng)用于醬油、白酒等發(fā)酵食品中發(fā)揮增香作用[14]，相對來說，埃切假絲酵母的酯合成能力遠(yuǎn)高于地衣芽孢桿菌。此外，實(shí)驗(yàn)菌株通過酯化途徑合成乙酸己酯的產(chǎn)量遠(yuǎn)低于醇解途徑，這可能是由于水分子作為酯化反應(yīng)的產(chǎn)物，相對于醇解反應(yīng)來說，酯化反應(yīng)在水環(huán)境中受到了一定程度的抑制，導(dǎo)致其產(chǎn)量相對較低[15]。

2.3 pH對菌株酯合成活力的影響

微生物無論通過酯化或醇解途徑合成酯類物質(zhì)，都是由相關(guān)的酶催化反應(yīng)的發(fā)生，而pH是影響酶活力的重要因素，酯化體系和醇解體系中菌株的酯合成比活力受pH變化的影響情況見圖3和圖4。

圖3 不同pH條件下實(shí)驗(yàn)菌株在酯化體系中合成己酸乙酯(A)和乙酸己酯(B)的含量Fig.3 The content of ethyl hexanoate (A) and hexyl acetate (B) synthesized by experimental strains in esterification systems at different pH values

圖4 不同pH條件下實(shí)驗(yàn)菌株在醇解體系中合成乙酸己酯的含量變化Fig.4 The content of hexyl acetate synthesized by experimental strains in alcoholysis systems at different pH values

在酯化體系中，隨著pH值由4增加到6，埃切假絲酵母合成己酸乙酯和乙酸己酯的酯合成比活力不斷降低，分別由16.956 U/μg蛋白降至2.965 U/μg蛋白、0.707 U/μg蛋白降至0.055 U/μg蛋白；此外，埃切假絲酵母在pH為4時通過酯化途徑合成酯類物質(zhì)的能力遠(yuǎn)高于另外兩個pH值，表明埃切假絲酵母所產(chǎn)出的酯酶更傾向于在酸性環(huán)境中進(jìn)行催化反應(yīng)的發(fā)生。地衣芽孢桿菌合成乙酸己酯的酯合成比活力變化與埃切假絲酵母相反，其呈不斷增加的趨勢，由0.014 U/μg蛋白增至0.016 U/μg蛋白；由圖3 中A可知，地衣芽孢桿菌在pH為4時，無法通過酯化途徑合成己酸乙酯，隨著pH值繼續(xù)增長到6，合成己酸乙酯的酯合成比活力不斷增加至0.318 U/μg蛋白。因此，地衣芽孢桿菌和埃切假絲酵母均更傾向于通過酯化途徑合成己酸乙酯，其酯合成比活力遠(yuǎn)高于乙酸己酯。由圖4可知，在醇解體系中，隨著pH值的增加，地衣芽孢桿菌和埃切假絲酵母合成乙酸己酯的酯合成比活力的變化趨勢與酯化體系類似，分別由0.245 U/μg蛋白增至3.210 U/μg蛋白、19.673 U/μg蛋白降至17.020 U/μg蛋白。因此，在pH值為4～6的范圍內(nèi)，地衣芽孢桿菌更傾向于在偏中性的條件下通過酯化或醇解途徑合成酯類物質(zhì)，而埃切假絲酵母在偏酸性的環(huán)境中酯合成比活力較強(qiáng)；此外，埃切假絲酵母的酯合成比活力在不同pH條件下仍遠(yuǎn)高于地衣芽孢桿菌，與2.1、2.2中的結(jié)果一致。

3 結(jié)論

地衣芽孢桿菌和埃切假絲酵母作為郫縣豆瓣發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌株，可以通過酯化和醇解兩種途徑合成酯類物質(zhì)，其中酯化途徑合成乙酯類物質(zhì)的能力相對較強(qiáng)，而乙酸酯類物質(zhì)傾向于通過醇解途徑合成。在pH為4～6的范圍內(nèi)，地衣芽孢桿菌酯合成活力隨pH值的增加而增強(qiáng)，而埃切假絲酵母在pH為4時酯合成比活力最強(qiáng)。此外，在不同pH條件下，埃切假絲酵母通過酯化或醇解途徑合成酯類物質(zhì)的能力總是高于地衣芽孢桿菌。本研究通過探究地衣芽孢桿菌和埃切假絲酵母的酯合成途徑及能力，為加速積累和改善發(fā)酵過程中的酯類物質(zhì)和平衡郫縣豆瓣的整體風(fēng)味提供了理論依據(jù)。