楊 穎，康 蘭，耿 新，陳玉珍，盧存福

（北京林業(yè)大學生物科學與技術學院，北京100083）

0 引言

細胞壁是植物細胞的重要特征，若沒有細胞壁，植物將是一堆柔韌的原生質體[1]。同時，作為植物區(qū)別于動物的一個進化特征，細胞壁形成和調控的分子機制一直是有待研究的基礎科學問題。2005年，《Science》在其創(chuàng)刊125周年時就提出把“植物如何形成細胞壁”作為接下來25年需要解決的重要科學問題之一[2]。

植物細胞在去除細胞壁后能迅速地重新合成新的細胞壁[3-4]，因此植物原生質體是研究細胞壁再生的良好材料[5-6]。過去對植物細胞壁的研究多從生化角度出發(fā)，主要集中在細胞壁結構與功能、化學組分和物理特性及應用上[7-9]。從細胞學的角度更能整體把控細胞壁代謝的全過程，原生質體為單細胞且具有全能性，非常適合用于研究植物生物學的基本問題，如膜生理學、細胞壁代謝和應激反應[10-11]。細胞壁的生物合成是非常動態(tài)、復雜的網(wǎng)絡架構，借助原生質體可再生壁這一特性，人們逐漸揭開了細胞壁合成的面紗[11]。1967年，Pojnar等[12]利用光學顯微鏡及電子顯微鏡觀察到番茄果實原生質體細胞壁再生過程。之后越來越多物種的原生質體經(jīng)培養(yǎng)觀察到新生細胞壁，推動了可視化細胞壁再生動力學研究的發(fā)展。每個植物基因組都包含數(shù)千個與細胞壁形成相關的基因[13-15]，隨著第二、三代測序技術的興起，原生質體再生細胞壁的過程結合組學成為新的研究方向，可解釋原先無法解釋的植物細胞壁形成的機理和調控的分子機制，并鑒定出細胞壁合成關鍵基因[16]，為后續(xù)基因功能特性分析奠定基礎。因此，研究原生質體再生細胞壁，將有助于更加深入地了解細胞壁合成及修飾的過程，對于定向改良細胞壁、指導林木培育、發(fā)展生物能源均具有重要意義。

1 原生質體再生細胞壁培養(yǎng)

1.1 原生質體再生壁材料的選擇

一般來說，單子葉植物例如水稻、玉米、小麥的原生質體再生壁過程較雙子葉植物更為困難，所以取材上也更加精細。對于單子葉植株，選取幼嫩的葉片及根部游離原生質體很難再生出細胞壁，研究者開始選擇分裂能力強、生長旺盛的組織如分生組織用來再生植株，后續(xù)逐漸選用胚性愈傷、懸浮細胞系等作為實驗材料，并成為主流。例如Mujahid等[17]利用水稻懸浮細胞系(NB2P cells)成功培養(yǎng)得到水稻原生質體再生的細胞壁，并利用新生壁為后續(xù)的轉錄組相關實驗奠定基礎。岳晉軍[18]同樣選取毛竹胚性懸浮細胞構建毛竹原生質體再生體系，再生效率最高。但選用胚性愈傷、懸浮細胞系也存在弊端，因為懸浮培養(yǎng)的建立和維持往往費時費力，從而增大研究成本。雙子葉植物的原生質體再生較為簡單，一般選取幼嫩葉片即可獲得原生質體的再生壁。番石榴[19]、擬南芥[20]、矮牽牛[21]、豆科植物[22]均可利用幼嫩的葉片游離原生質體進行細胞壁再生。與雙子葉植物等維管植物相比，苔蘚植物和蕨類植物具有相對簡單的細胞結構，因此細胞壁再生過程更加容易[23-24]。

1.2 培養(yǎng)基的選擇

植物原生質體經(jīng)提取、純化的步驟后進入培養(yǎng)階段。盡管Pilet等[25]在1984年提出植物原生質體不能再生出正常的細胞壁，但之后又有報道表明其在合適的培養(yǎng)基中也可生成正常的細胞壁[24]。因此不同物種的培養(yǎng)基可能存在差異，選擇合適的培養(yǎng)基十分關鍵。使用頻率較高的基本培養(yǎng)基為MS、KM8P、B5，培養(yǎng)基中常輔以碳源、滲透壓穩(wěn)定劑、少量植物激素和小分子營養(yǎng)素等[26]。其中，KM8P培養(yǎng)基營養(yǎng)最豐富，接受度最高，影響最為廣泛。

KM8P培養(yǎng)基最早是由Kao and Michayluk于1975年提出，它使蠶豆原生質體細胞能夠以極低的初始種群密度（25～50個細胞/mL）生長，同時證明了單個原生質體能夠形成細胞壁[27]。首次闡明添加氨基酸和椰子水能夠幫助原生質體細胞在低密度條件下存活，因其提供了許多代謝的中間產物，同時具有解毒作用。

但并非所有的物種都適用于KM8P培養(yǎng)基，多數(shù)研究者會根據(jù)自己的材料以及研究意圖選擇最為合適的培養(yǎng)基。作為典型的單子葉植物，毛竹懸浮細胞原生質體培養(yǎng)采用以MS為基礎的培養(yǎng)基，并添加各類維生素及氨基酸等增加原生質體活性[18]。作為雙子葉植物的草香豌豆和黃羽扇豆則不需要過于豐富的培養(yǎng)基，Wiszniewska等[22]發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基越豐富，原生質體保持活性的能力越差，他們改良原有AS培養(yǎng)基，加速了原生質體表面纖維素的合成。因此，對于剛失去細胞壁保護的原生質體來說，選擇合適的培養(yǎng)基對長出新生細胞壁至關重要，并且一般來說單子葉植物較雙子葉植物再生壁過程困難，所以單子葉植物的培養(yǎng)基更加豐富。

1.3 培養(yǎng)方式的選擇

原生質體培養(yǎng)存在多種新舊方式，因不涉及后續(xù)細胞團生成和植株再生，原生質體再生細胞壁培養(yǎng)通常選用液體淺層培養(yǎng)(liquid thin culture)。Wiszniewska等[22]在直徑為4 cm的塑料培養(yǎng)皿里使用液體淺層培養(yǎng)的方法，成功再生出豆類植物原生質體細胞壁。相較于固體培養(yǎng)或固液結合培養(yǎng)，液體淺層培養(yǎng)方法簡單、損害小，對于再生細胞壁這一階段十分適用。但是這種方法也存在不足，如原生質體分布不均，長壁的原生質體易粘黏成細胞團，不利于觀察單個細胞且影響進一步的細胞壁發(fā)育等。

原生質體植板密度也影響著其存活率。密度過高時，由于缺乏營養(yǎng)元素或有害的代謝中間產物增多，原生質體無法正常生長；密度過低時，不利于尋找長出細胞壁的原生質體。在原生質體再生細胞壁這一階段，植板密度一般控制在1×105個/mL較為適宜。

因此，培養(yǎng)條件的好壞決定直接影響著原生質體的存活率，它作為關鍵的一環(huán)甚至決定整個實驗的成敗。為高效再生出原生質體新生細胞壁，應注意以下幾個方面：（1）根據(jù)前人研究，多嘗試幾種培養(yǎng)基，不同的物種對培養(yǎng)基的營養(yǎng)程度喜好不一；（2）原生質體十分脆弱，操作過程中應盡量減少機械性損傷；（3）若原生質體長時間沒有長壁，還應考慮取材部位是否正確。

2 細胞壁再生的細胞生物學證據(jù)

原生質體再生的細胞壁在普通光學或相差顯微鏡下無法得以觀察，所以需利用化學染料與細胞壁中的物質結合，再借助熒光顯微鏡才能判斷細胞壁生成與否。熒光增白劑卡式白(Calcofluor White)自1970年發(fā)現(xiàn)可使細胞壁在熒光顯微鏡紫外光下呈藍色[28]，直至現(xiàn)在仍是主流應用于細胞壁可視化的經(jīng)典染料。這種熒光染料對纖維素和幾丁質具有很強的親和力，很多物種的原生質體細胞壁再生實驗均使用了該染料檢測。盡管卡式白染料染色過程簡單、快速，但它對纖維素微纖絲的特異性不強且對活細胞有毒害作用。近年來，Pontamine Fast Scarlet 4 BS這種新型細胞壁染料興起，它對纖維素微纖絲有很高的特異性，與卡式白染料相比，其最大的優(yōu)勢在于可使活細胞染色[29-32]，更有利于活體原生質體的實時檢測，便于得到立體的細胞壁再生圖。

通過歷代科研工作者的努力，人們對原生質體再生壁的觀察不再局限在二維層面，而是從三維立體的角度研究再生過程中纖維素微纖絲沉積規(guī)律。Kuki等[33]將傳統(tǒng)的纖維素染色技術與圖像分析相結合，設計出一種新的成像技術來定量評估擬南芥花葉原生質體細胞壁再生過程中的纖維素網(wǎng)絡結構（圖1[33]）。三維成像的方式打破了人們對細胞壁固有的認知，細胞壁的纖維素微纖絲的總長度、分布的密度和平均角度等關鍵指標都可用此方式生動地呈現(xiàn)出來，可直接觀察到擬南芥原生質體再生的早期階段表現(xiàn)為纖維素微纖絲的隨機取向，隨后是部分纖維素微纖絲的定向沉積最后才是有序的纖維素沉積。不僅如此，細胞壁可視化的應用使人們更加形象、立體、全面地觀察到原生質體新生壁。因每種植物細胞壁纖維素微纖絲累積模式不盡相同[34-37]，該技術除了可以比較再生過程中細胞壁的變化，還可為不同植物細胞壁動力學的顯著差異提供新的見解。

圖1 原生質體細胞壁再生的時間進程

3 組學技術研究原生質體再生細胞壁的細胞分子生物學過程

細胞壁再生相關蛋白約占細胞壁質量的10%，通常由大的基因家族編碼[38-39]，這些蛋白質在維持細胞壁結構穩(wěn)定性和功能多樣性上發(fā)揮重要作用。但是目前為止，仍存在大量未被挖掘出來的細胞壁蛋白，因此在原生質體單細胞的基礎上，結合多種組學的系統(tǒng)研究方法[40]，已成為人們深入了解細胞壁再生分子機制的新方向。不同的組學手段適用于解釋原生質體再生細胞壁分子網(wǎng)絡的不同層面，可歸納為以下3點。

3.1 獲得差異表達基因

在細胞壁再生的不同時間點取樣，通過轉錄組或蛋白組獲得再生壁過程中各階段的差異表達基因，分析篩選出關鍵基因，構建細胞壁再生模型。2005年Kwon等[41]通過比較細胞壁再生0、1、3 h后擬南芥原生質體的蛋白組變化情況，發(fā)現(xiàn)細胞壁再生1 h內，AtXTH11(At3g48580)、AtXYL1(At1g68560)等蛋白便開始合成細胞壁再生的結構基礎纖維素/木葡聚糖網(wǎng)絡。Yang等[42]利用轉錄組技術，根據(jù)棉花細胞壁再生的不同時期，把上調表達的210基因標簽分成細胞壁再 生 前 期 (TIP、EXLA2、BIK1)、中 期 (PRP、GRP、ANAC016)、后 期 (CIPK9、FLA2、SUS2)、整 個 階 段(SMADC)4類。由此可見，植物細胞壁分子網(wǎng)絡已初具雛形，為單基因功能驗證以及信號轉導途徑鑒定奠定了基礎。

3.2 細胞壁再生與細胞內部的關聯(lián)網(wǎng)絡

目前，組學技術已深入至亞細胞水平，有助于系統(tǒng)深入地了解細胞器與細胞壁再生的內部響應機理。眾所周知，細胞壁的酶解對植物細胞而言屬于外界的脅迫刺激，因此細胞核會對該刺激觸發(fā)響應機制，從而參與細胞壁再生的分子網(wǎng)絡構建。有研究利用核蛋白組學技術證實水稻細胞壁去除后染色質中組蛋白H3K23高度乙?；?，組蛋白變體如H3.3等表達量降低。但隨著細胞壁的再生，H3K23乙?；潭攘⒓聪陆?，組蛋白變體表達量上調[43]。由于高爾基體在植物中主要參與細胞壁中多糖的合成、蛋白質糖基化和囊泡形成，與細胞壁再生息息相關[44]。Parsons等[45]根據(jù)擬南芥高爾基體蛋白組發(fā)現(xiàn)，GNT1(AT4G38240.1)、XYLT(AT5G55500.1)和 FUT12(AT1G49710.1)主要參與的N-糖基化途徑和GT65參與的O-巖藻糖基化途徑在細胞壁合成中發(fā)揮重要作用。以上研究表明細胞壁再生過程是一個復雜的生命活動，需要多種細胞器配合完成，但目前其他細胞器對細胞壁合成的分子機制是否有響應尚未明確。

3.3 細胞壁再生網(wǎng)絡的調控樞紐-磷酸化修飾

磷酸化作為一種最常見的翻譯后修飾，具有重要的調節(jié)作用。2014年，Wang等[46]對小立碗蘚原生質體再生的磷蛋白組進行了綜合分析（圖2[46]），鑒定出108個磷酸化蛋白可能參與調控細胞壁生成、細胞結構變化、細胞增生和分化、器官發(fā)生和發(fā)育調節(jié)。雖然該團隊構建出了小立碗蘚原生質體再生的磷酸化蛋白代謝網(wǎng)絡，但并未從分子層面解釋蛋白質的互作關系。后來，劉玉薇和王曉琴[47]在Wang等研究的基礎上構建了小立碗蘚原生質體再生的蛋白互作網(wǎng)絡，發(fā)現(xiàn)轉錄因子AGL21磷酸化可與20個蛋白發(fā)生互作，促進植物的生長發(fā)育；VIP4可與VIP3和ELF8蛋白發(fā)生互作，其中ELF8還和組蛋白甲基化有關，同時表明細胞核與細胞壁再生密切相關。組學技術隨時間不斷發(fā)展，磷蛋白組的應用加深了人們對蛋白相互作用的理解，為進一步闡明原生質體再生過程的分子調控機制提供了理論依據(jù)。

圖2 裸藻原生質體再生過程的分子調控網(wǎng)絡與細胞反應

4 展望

近十幾年來，培養(yǎng)技術的更新及新技術的應用使得植物原生質體細胞壁再生方面的研究取得了長足的進展。細胞壁再生過程中涉及諸多生理生化反應，雖然可通過基因組、蛋白組構建出細胞壁再生的分子網(wǎng)絡，但對于細胞壁再生機理尚處于淺層次認識的階段，可從以下3個方面進一步深入研究：（1）分析得到的關鍵蛋白如何指導細胞壁的發(fā)生、修飾以及它們之間的信號轉導通路的構建仍不清晰；（2）原生質體中細胞壁的再合成和胞質分裂過程中新細胞壁的合成是否遵循相同的調控機制并使用相同的一組催化酶；（3）影響原生質體再生的因素很多，細胞內部中存在多種細胞器及細胞骨架共同指導完成細胞壁再生，目前只有高爾基體、細胞膜、細胞核證實與細胞壁再生有關，但其所描述的分子網(wǎng)絡尚未完善。已有研究表明，外部環(huán)境有多種脅迫應激影響細胞壁合成，例如冷、熱、重金屬脅迫等[48-49]，甚至太空中的微重力環(huán)境也會抑制原生質體的細胞壁再生能力[50]，而外部環(huán)境如何刺激影響細胞壁再生，也是值得研究的問題。