高晶晶，劉紅梅，楊殿林，李睿穎，朱 平，高洪軍，李 靜，張秀芝，彭 暢

（1農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護科研監(jiān)測所，天津300191；2吉林省農(nóng)業(yè)科學院，長春130033）

0 引言

東北平原是中國重要的糧食產(chǎn)區(qū)，黑土是東北地區(qū)主要的農(nóng)業(yè)土壤。近年來由于盲目追求高產(chǎn)，大量施用化肥、頻繁耕作等不合理的管理方式，導致黑土有機質下降、土壤質量退化日益嚴重。秸稈全量還田和秸稈肥料化利用是促進農(nóng)作物秸稈綜合利用的有效途徑，可以改善土壤理化性狀，增加土壤有機質、氮、磷、鉀和各種微量元素的含量，增強土壤肥力。土壤是微生物的“天然培養(yǎng)基”，是最豐富的菌種資源庫，土壤微生物在土壤生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著至關重要的作用[1]，其在土壤中參與土壤的氨化、硝化、固氮、硫化等生物化學反應過程，促進秸稈的腐解、土壤有機質的分解合成和養(yǎng)分的轉化[2]。前人研究發(fā)現(xiàn)，耕作方式[3]、施肥處理[4]、降水變化[5]、植被類型[6]的不同都會導致土壤微生物群落結構和群落代謝功能多樣性發(fā)生改變。耕作方式對土壤微生物群落的影響較為復雜，因耕作模式、秸稈類型、秸稈還田時間長短、土壤本底、土壤類型和研究方法等不同，不同的研究者得出的研究結果不盡一致。有待于針對不同區(qū)域、耕作方式和土壤類型等進一步開展研究。

耕作方式不僅對土壤結構的穩(wěn)定性和土壤潛在肥力有顯著影響，還會進一步影響土壤微生物群落的數(shù)量和微生物種類。劉淑梅等[7]在山東省砂姜黑土玉米田不同耕作方式試驗發(fā)現(xiàn)，在免耕模式下土壤微生物生物量碳最高，高于傳統(tǒng)旋耕模式84.3%；真菌數(shù)量是傳統(tǒng)旋耕模式的1.5倍。劉琪等[8]通過對小麥生育期內(nèi)所采取的免耕、深耕、深松3種耕作方式試驗發(fā)現(xiàn)，免耕模式下微生物群落較為穩(wěn)定，且在收獲期微生物總量最高；深耕和深松模式下的土壤細菌、放線菌、真菌數(shù)量呈現(xiàn)播種前升高，后期下降的趨勢。姬艷艷等[3]在華北典型小麥-玉米輪作農(nóng)田玉米季不同耕作方式試驗發(fā)現(xiàn)，免耕、翻耕和旋耕對土壤微生物群落代謝和功能多樣性產(chǎn)生顯著影響，且免耕處理shannon指數(shù)顯著高于旋耕和翻耕處理。Carpenter-Boggs等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在免耕處理的土壤微生物活性和數(shù)量都顯著高于翻耕土壤。Nivelle等[10]在法國進行5年不同耕作方式和覆蓋作物試驗發(fā)現(xiàn)，免耕模式下有更高微生物功能活性。合理的耕作措施對土壤微生物生物量、微生物群落結構和土壤微生物活性等產(chǎn)生積極的影響，可有效提高土壤質量。目前秸稈還田與腐解菌及耕作方式相結合對黑土土壤微生物群落功能多樣性的影響尚不明確。為揭示不同耕作方式對中國東北地區(qū)黑土土壤微生物功能多樣性的影響，本研究以位于吉林省公主嶺市的不同耕作方式與秸稈還田長期試驗為平臺，通過利用Biolog生態(tài)板法，分析比較不同耕作方式下土壤微生物功能多樣性變化規(guī)律，旨在構建玉米秸稈原位還田模式下的土壤保護性耕作技術新模式，提高東北黑土區(qū)土壤質量，促進該區(qū)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗于2015—2019年在吉林省公主嶺市吉林省農(nóng)業(yè)科學院試驗田進行，位于北緯43°30'24″，東經(jīng)124°48'36″。該區(qū)域屬溫帶大陸性季風氣候，年平均氣溫5.5℃，年降水量450～650 mm。試驗地采用1年1熟制玉米連作種植方案。土壤類型為黑鈣土。2015年播前耕層土壤(0～20 cm)理化性質：有機質含量為25.32g/kg，全氮含量為1.54g/kg，全磷含量為0.51mg/kg，速效磷含量為11.45 mg/kg，pH 7.8。

1.2 試驗設計與樣品采集

實驗開始于2015年5月，試驗設3個處理，分別為秸稈粉碎深翻還田(CK)、玉米高留茬寬窄行栽培＋秸稈覆蓋＋快速腐解菌劑處理(KZF)、秸稈粉碎深翻＋快速腐解劑(SF)。小區(qū)面積80 m2，3次重復。秸稈粉碎深翻還田，在玉米收獲后，利用秸稈粉碎機粉碎秸稈，然后翻埋于土壤中，翻耕深度25～30 cm。玉米高留茬寬窄行栽培＋秸稈覆蓋＋快速腐解菌劑處理，玉米寬窄行栽培改壟作為平作，改均勻壟為寬窄行。在平整的玉米田上進行寬窄行劃分，窄行40 cm，寬行80～90 cm，第一年種植窄行，第二年種植寬行，以此類推形成窄行、寬行交替種植模式；第二年苗帶窄行留高茬（40 cm左右），在上一年寬行之間種植窄行。在玉米收獲時采用具有秸稈粉碎裝置的玉米聯(lián)合收獲機收獲果穗或籽粒，隨后將秸稈和殘茬原位留置耕地表面越冬，秸稈覆蓋還田，每公頃施用快速腐解菌劑22.5 L。秸稈粉碎深翻＋快速腐解劑(SF)處理，收獲后將粉碎的農(nóng)作物秸稈原位保留在地表并噴施1.5 L秸稈快速腐解菌劑，然后將秸稈翻耕至25～30 cm土層下，將秸稈翻壓入土可加快秸稈腐熟分解，可以向土壤中補充大量的有機物料，提高土壤養(yǎng)分，增加土壤有機質，促進農(nóng)作物生長，有效減少來年雜草和病蟲害的發(fā)生。

玉米品種為‘先玉335’，播種時間為4月下旬，9月下旬收獲。施肥量為：N 180 kg/hm2，P2O570 kg/hm2，K2O 85 kg/hm2。氮肥為尿素(N，46.4%)，磷肥為過磷酸鈣(P2O5，12%)，鉀肥為硫酸鉀(K2O，50%)。3種處理施肥量相同，有機肥和磷鉀肥作基肥，氮肥50%作基肥，50%在玉米小喇叭口期作追肥施入。秸稈腐解菌由吉林省吉林地富肥業(yè)科技有限責任公司生產(chǎn)，快速腐解菌劑的有效菌種為枯草芽孢桿菌和長枝木霉菌，有效活菌數(shù)≥1.0億/mL，可有效作用在秸稈和畜禽糞便等有機物料上使其腐解，穩(wěn)定性高，菌株間協(xié)同性強。各處理管理方式同一般大田生產(chǎn)。

2019年9月底在玉米收獲期采樣，用直徑為5 cm土鉆，在每個小區(qū)內(nèi)按照S型取樣法選取5個點，采取0～20 cm土壤樣品，去除根系和石礫，分成兩份，一份放在冰盒中帶回實驗室，放入4℃冰箱保存，用于測定速效養(yǎng)分和土壤微生物多樣性，另一份土樣放在室內(nèi)自然風干，用于其他土壤理化指標測定。

1.3 測定方法

土壤有機碳含量采用水合熱重鉻酸鉀-比色法測定，土壤全氮含量測定采用開氏消煮法凱式定氮儀測定，土壤全磷含量采用鉬銻抗比色法測定，土壤硝態(tài)氮、銨態(tài)氮采用氯化鉀溶液提取-流動分析儀（AA3，德國）測定，土壤速效磷采用碳酸氫鈉提取-鉬銻抗比色法[11]。

土壤微生物群落功能多樣性測定：應用Biolog生態(tài)平板(ECO Micro Plate)對土壤微生物碳源代謝能力進行分析。根據(jù)劉紅梅等[12]研究中所使用的Biolog試驗方法，稱取新鮮土壤樣品10 g，加入90 mL經(jīng)滅菌處理后的NaCl溶液(0.85%)，用封口膜密封三角瓶瓶口，固定于水平搖床上，以250 r/min均勻震蕩30 min，取出搖勻，靜置10 min，然后依次稀釋至10-2、10-3的懸浮液。向Biolog-Eco板的每個孔中加入150 μL的10-3懸浮液。在生化恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)27℃培養(yǎng)Eco生態(tài)板9天，每隔24 h用Biolog微孔板自動讀數(shù)裝置(BIOLOGInc.，USA)讀取590 nm和750 nm波長下的數(shù)值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用平均顏色變化率(AWCD)來表示土壤微生物代謝各類碳源的能力[13]。對培養(yǎng)144 h時的Biolog-Eco平板孔中吸光值進行統(tǒng)計分析，用Shannon指數(shù)(H)、Simpson 指數(shù)(D)和Shannon-Wiener均勻度指數(shù)(E)表征土壤微生物群落碳源代謝多樣性。計算方法見公式(1)～(4)。

式中：Ci為每個有培養(yǎng)基孔的吸光度值，為各反應孔在590 nm與750 nm的吸光值差；R為空白對照孔的吸光度值；n為Biolog生態(tài)板上培養(yǎng)基孔數(shù)，實驗中取值為31，進行3次重復。Pi為第i孔吸光值與空白對照孔吸光值之差和所有反應孔吸光值之差總和的比值，S是Biolog-Eco平板中有顏色孔的數(shù)量。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010軟件對實驗數(shù)據(jù)進行數(shù)據(jù)整理，使用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析和主成分分析。

2 結果與分析

2.1 不同耕作方式下Eco板平均顏色變化率動態(tài)特征

平均顏色變化率(AWCD)反映了微生物群落對底物碳源的利用水平，是判定土壤微生物群落代謝碳源能力的重要指標[13]。從圖1可知，不同秸稈還田耕作方式處理下的AWCD值均呈現(xiàn)隨時間增加而不斷上升的趨勢，培養(yǎng)進行的24 h內(nèi)AWCD變化不明顯，48 h至144 h增長快速，144 h后增速緩慢。表明隨著接種時間的增加，不同耕作處理下的AWCD值均呈現(xiàn)顯著上升趨勢，說明土壤微生物活性逐漸提高，代謝碳源能力也逐漸增強。培養(yǎng)開始的24 h內(nèi)AWCD值變化不明顯，表明微生物幾乎未利用土壤碳源；48 h至144 h增長快速，表明微生物活性顯著增強；144 h后增速緩慢，表明AWCD值在144 h時處于“拐點”處，因此采用第144 h的光密度值進行方差分析，更能反映不同耕作處理之間土壤微生物利用碳源能力的差異。培養(yǎng)第144 h時，AWCD值順序為KZF＞SF＞CK，方差分析表明KZF和SF處理AWCD值顯著高于CK。培養(yǎng)第216 h時，KZF與SF處理的AWCD值分別是CK處理的115.84%、123.82%。在144 h后，3種模式之間土壤微生物群落代謝碳源能力的差距在逐漸縮小，這可能是由于腐解菌劑接種作用的消失。整體來看，CK模式下的AWCD值在觀測期間內(nèi)均最小，而KZF和SF處理下的AWCD值在觀測期內(nèi)均高于CK組，表明KZF和SF處理下微生物的代謝活性較高。

圖1 不同耕作方式下的AWCD值隨培養(yǎng)時間變化

2.2 不同耕作方式下土壤微生物多樣性指數(shù)

土壤微生物Shannon多樣性指數(shù)、優(yōu)勢度指數(shù)D和均勻度指數(shù)E反映土壤微生物群落功能多樣性。不同耕作方式下土壤微生物群落的功能多樣性指數(shù)見表1。KZF與SF處理的Shannon指數(shù)H和優(yōu)勢度指數(shù)D均高于對照，但不同處理間均無顯著差異(P＞0.05)。KZF與SF處理的均勻度指數(shù)E低于對照CK處理，不同處理間無顯著差異。在連續(xù)進行5年不同耕作方式處理下，3種不同耕作方式的Shannon多樣性指數(shù)、優(yōu)勢度指數(shù)D和均勻度指數(shù)E無顯著差異。表明連續(xù)5年不同耕作方式處理，并未對土壤微生物功能多樣性指數(shù)產(chǎn)生顯著影響。

表1 土壤微生物群落多樣性指數(shù)變化

2.3 不同耕作方式下土壤微生物利用全部碳源能力的動態(tài)分析

Biolog-Eco微孔中的31種碳源根據(jù)特異性官能團分為6大類，分別為碳水類、氨基酸類、羧酸類、酚酸類、多聚物類、多胺類。本研究中，土壤微生物對這6大類碳源的利用率大小為碳水類＞羧酸類＞氨基酸類＞酚酸類＞多聚物類＞多胺類（圖2）。不同耕作方式下，6大類碳源利用能力存在差異。KZF與SF處理對碳水類、氨基酸類、酚酸類利用能力均顯著高于對照CK(P＜0.05)。KZF處理對羧酸類的利用能力低于CK處理對羧酸類的利用能力，但無顯著差異(P＞0.05)；SF處理對羧酸類的利用能力顯著低于對照CK(P＜0.05)。KZF處理對多聚物類的利用能力高于CK處理對多聚物類的利用能力，但無顯著差異(P＞0.05)；SF處理對多聚物類的利用能力顯著高于對照CK(P＜0.05)。KZF處理對多胺類的利用能力顯著高于CK處理對多胺類的利用能力(P＜0.05)；SF處理對多胺類利用能力高于對照CK，但無顯著差異(P＞0.05)。

圖2 不同秸稈還田耕作措施下土壤微生物代謝6大類碳源的能力

2.4 不同耕作方式下土壤微生物的主成分分析

對各樣品培養(yǎng)144 h后的平均顏色變化率做主成分分析，分析不同耕作方式下土壤微生物碳源利用的差異。共提取了3個主成分(PC)可以解釋95.17%以上的原變量特征。第1主成分和第2主成分的貢獻分別為52.95%和37.98%（圖3）。圖3表明，3種秸稈還田耕作方式下的PC值在空間分布上存在明顯差異。KZF位于PC1和PC2正端。SF位于主成分PC1正端和PC2負端。CK位于PC1和PC2負端。主成分分析結果進一步表明，秸稈還田條件下，不同耕作處理下的土壤微生物碳源利用種類和利用強度存在顯著差異。不同耕作方式處理對碳源利用情況存在明顯差異，說明連續(xù)5年進行不同耕作方式處理下對某些特定的土壤微生物進行了富集和馴化，從而導致土壤微生物對不同碳源的代謝活性產(chǎn)生影響。

圖3 不同處理下土壤微生物碳源利用類型的主成分分析

31種碳源主成分分析中的載荷因子反映碳源利用的差異性，載荷因子負荷量的大小和它前面的正負號直接反映了主成分與相應變量之間關系的密切程度和方向。由表2可見，第1主成分PC1載荷絕對值＞0.5的有21種碳源，0.8以上的有15種，其中碳水類6種，氨基酸類2種，羧酸類2種，多聚物類2種，酚酸類1種。第2主成分PC2載荷因子絕對值＞0.5的有15種碳源，其中碳水類5種，氨基酸類2種，羧酸類5種，酚酸類1種，胺類2種。根據(jù)影響第1，2主成分主要變量得分可知（表3），影響第1主成分的碳源主要有碳水類、氨基酸類、羧酸類，影響第2主成分的碳源主要有碳水類、羧酸類、氨基酸類。綜合分析表明，碳水類、氨基酸類和羧酸類是研究區(qū)微生物利用的主要碳源。碳水類的D-木糖D-Xylose、D,L-α-磷酸甘油，氨基酸類的L-精氨酸，羧酸類的D-半乳糖醛酸、α-丁酮酸、γ-羥丁酸，在PC1和PC2載荷均達到0.5以上，6者為研究區(qū)31種碳源中的最敏感類型。

表2 31種碳源的主成分載荷因子

續(xù)表2

表3 影響PC1、PC2主要變量得分

3 討論與結論

耕作方式是影響土壤微生物群落結構和代謝活性的主要因素之一。本研究運用Biolog生態(tài)板技術，分析比較了不同耕作方式下土壤微生物代謝活性的差異，研究表明秸稈覆蓋還田配施腐解劑免耕耕作和秸稈粉碎深翻還田配施腐解菌劑均可增強土壤微生物活性，提高其碳源代謝能力。分析其原因，其一可能是由于免耕的耕作方式對土壤擾動較小，減少了對土壤表層微生物群落的破壞和水分的流失，增加土壤蓄水量和有機質含量，固土保墑，培肥地力，作物和微生物可以充分汲取土壤中養(yǎng)分進而促進自身生長繁殖[14-15]。其二是由于腐解菌劑的加入提高了玉米秸稈的降解效率并促進腐解殘余物有機碳質量分數(shù)下降[16]，改善了土壤微生物群落結構，增強土壤微生物代謝活性[17-19]。董立國等[20]研究結果表明，秸稈覆蓋下的免耕處理對總體碳源利用率以及不同碳源利用率均高于傳統(tǒng)耕作，土壤微生物活性可顯著增強。于建光等[21]的研究表明，施用秸稈腐熟菌劑后，土壤的微生物群落結構與土壤微生物活性發(fā)生顯著變化，AWCD值、Shannon多樣性指數(shù)(H)和物種豐富度(S)均增大，以上均與本研究的結果一致。通過對研究結果進行分析，可能由以下原因導致，一方面是由于免耕結合秸稈還田可以提高表層土壤活性有機碳組分含量[22]，增加土壤微生物碳源[23]，從而促進土壤微生物碳源利用。另一方面是由于耕作處理中秸稈腐熟菌劑的添加，增加了土壤中微生物種群數(shù)量[24]，加快了秸稈腐熟的速度，為微生物提供了新鮮的碳源，更加促進了土壤微生物碳源代謝功能。

受環(huán)境因子和耕作方式的影響，碳水類、氨基酸類和羧酸類是研究區(qū)微生物利用的主要碳源。在對31種碳源的主成分分析中，載荷因子反映了對不同碳源的代謝差異，載荷因子負荷量的大小直接反映了碳源對主成分的影響程度。碳水類2種碳源和氨基酸類4種碳源在PC1和PC2載荷均達到0.5以上，六者為研究區(qū)31種碳源中的最敏感類型。主成分分析表明，不同耕作方式對第一主成分和第二主成分相關碳源利用能力不同，各處理在PC軸上出現(xiàn)了明顯的分異。傳統(tǒng)深翻還田模式對第一、第二主成分相關碳源的利用能力偏低，玉米高留茬寬窄行栽培＋秸稈覆蓋＋快速腐解菌劑處理和秸稈粉碎深翻＋快速腐解劑耕作模式在PC1和PC2軸上空間分布有明顯的差異，說明連續(xù)5年不同耕作方式處理改變了土壤微生物對碳源的利用特征。與傳統(tǒng)深翻還田模式相比，秸稈覆蓋玉米高留茬配施腐解菌劑可利用碳源種類最多且利用能力最強，其次是秸稈粉碎深翻配施腐解菌劑模式。分析其原因，其一可能是由于施加秸稈腐解菌劑后的秸稈還田模式能夠顯著增加早期土壤中細菌、真菌的數(shù)量[21]，菌劑中的微生物也影響了土壤中原有微生物群落的活性和功能多樣性[19]，從而提升了土壤微生物群落對碳源的利用率，增加了土壤碳源利用種類和利用程度，這與甄靜等[25]的研究結果達到一致。其二，可能是由于免耕秸稈覆蓋還田相比與傳統(tǒng)耕作方式顯著增加了耕層土壤的真菌、細菌、放線菌等主要微生物種群數(shù)量[7,26-27]，促進了土壤中相對應的碳源利用能力，引起微生物群落結構的改變。

該研究比較了連續(xù)5年不同耕作方式下東北黑土區(qū)玉米連作農(nóng)田土壤微生物活性、碳源代謝特征和微生物功能多樣性變化。該研究結果可為東北農(nóng)田耕作方式管理提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。但由于Biolog分析技術和耕作處理時間的局限性，研究結果具有一定的片面性，在未來研究中應結合土壤理化性質、酶活性變化，并結合土壤微生物分析的分子生物學技術，進一步揭示長期不同耕作方式對土壤微生物學特性的影響。

綜上所述，連續(xù)5年對黑土玉米田土壤施以不同耕作方式，并未對土壤微生物功能多樣性產(chǎn)生顯著影響。玉米高留茬寬窄行栽培＋秸稈覆蓋＋快速腐解菌劑處理和秸稈粉碎深翻＋快速腐解劑處理均有利于加快秸稈腐熟速度，改善土壤環(huán)境，增強土壤微生物活性，提高土壤微生物對碳源的利用程度和利用種類，進而提高其對碳源的綜合代謝能力。