謝彩連 陳錦國 蔡小娟 鐘玉杭

【摘要】 目的：運(yùn)用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)分析東莞地區(qū)早產(chǎn)兒氨基酸代謝水平的變化特點(diǎn)。方法：選取2019年1-12月于東莞市出生的3 381例早產(chǎn)兒（早產(chǎn)兒組）和3 845例正常足月兒（正常足月兒組），并將早產(chǎn)兒組按不同出生體質(zhì)量分為極低出生體重兒、低出生體重兒和單純早產(chǎn)兒。采用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)檢測濾紙干血斑中9種氨基酸的濃度。比較早產(chǎn)兒與正常足月兒的氨基酸代謝水平的差異，分析三組不同出生體質(zhì)量早產(chǎn)兒氨基酸代謝水平的變化特點(diǎn)。結(jié)果：早產(chǎn)兒組丙氨酸（Ala）、甘氨酸（Gly）、脯氨酸（Pro）、纈氨酸（Val）濃度均明顯低于正常足月兒組，而瓜氨酸（Cit）、甲硫氨酸（Met）、苯丙氨酸（Phe）、酪氨酸（Tyr）濃度均明顯高于正常足月兒組（P<0.05）。早產(chǎn)兒組中不同出生體質(zhì)量早產(chǎn)兒9種氨基酸代謝水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。其中Ala、Gly、Tyr濃度隨著出生體質(zhì)量的增加而升高，Cit、Phe濃度隨著出生體質(zhì)量的增加而降低。采用百分位數(shù)法，選擇雙側(cè)限值的可信區(qū)間（P2.5～P97.5）建立早產(chǎn)兒的氨基酸參考范圍。結(jié)論：早產(chǎn)兒氨基酸代謝水平與正常足月兒存在明顯差異，早產(chǎn)兒不同出生體質(zhì)量可影響其體內(nèi)氨基酸代謝濃度的分布。建議新生兒篩查實(shí)驗(yàn)室根據(jù)不同出生體質(zhì)量建立早產(chǎn)兒氨基酸的參考范圍，同時(shí)為臨床早產(chǎn)兒合理的營養(yǎng)補(bǔ)充提供參考依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】 早產(chǎn)兒 氨基酸 串聯(lián)質(zhì)譜 代謝水平

Analysis of Amino Acid Metabolism Level of Premature Infants in Dongguan Area/XIE Cailian， CHEN Jinguo， CAI Xiaojuan， ZHONG Yuhang. //Medical Innovation of China， 2021， 18（33）： 0-086

[Abstract] Objective： To analyze the changes in amino acid metabolism of preterm infants in Dongguan by tandem mass spectrometry. Method： A total of 3 381 preterm infants （preterm infants group） and 3 845 normal term infants （normal term infants group） who born in Dongguan City from January to December 2019 were selected， the preterm infants group was divided into very low birth weight infant， low birth weight infant and simple premature infant according to different birth weights. The concentration of 9 amino acids in dried blood spots on filter paper was detected by tandem mass spectrometry. The amino acid differences between preterm infants group and normal term infants group were compared， and the amino acid metabolism characteristics of three groups of preterm infants with different birth weights were analyzed. Result： The concentrations of alanine （Ala）， glycine （Gly）， proline （Pro） and valine （Val） in preterm infants group were significantly lower than those in normal term infants group， while the concentrations of citrulline （Cit）， methionine （Met）， phenylalanine （Phe） and tyrosine （Tyr） were significantly higher than those in normal term infants group （P<0.05）. The comparison of 9 amino acid metabolism levels of preterm infants with different birth weights in preterm infants group were statistically significant （P<0.05）. Among them， the concentrations of Ala， Gly， and Tyr increased with the increase of birth weight， while the concentrations of Cit and Phe decreased with the increase of birth weight. The percentile method was used to select confidence interval （P2.5-P97.5） of the two-sided limit to establish the amino acid reference range for preterm infants. Conclusion： The amino acid metabolism level of preterm infants is significantly different from that of normal term infants， different birth weights of preterm infants can affect the amino acid metabolism concentration in their bodies. It is recommended that newborn screening laboratories establish a reference range for preterm infants based on different birth weights， and provide a reference for reasonable nutritional supplementation for clinical preterm infants.

[Key words] Premature infants Amino acids Tandem mass spectrometry Metabolic level

First-author’s address： Dongguan Maternal and Child Health Hospital， Dongguan 523000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.33.021

遺傳代謝病是指由于基因突變導(dǎo)致維持機(jī)體正常代謝所必需的某些酶、受體或載體等的缺乏，從而導(dǎo)致機(jī)體代謝紊亂繼而出現(xiàn)相應(yīng)臨床癥狀的一類疾病[1]。新生兒遺傳代謝病的篩查主要通過串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)檢測干血片的氨基酸和肉堿的濃度，根據(jù)其代謝水平來判斷是否存在代謝障礙，能在患兒未出現(xiàn)臨床癥狀或癥狀早期及時(shí)發(fā)現(xiàn)、及早診斷和治療。與傳統(tǒng)篩查方法相比，串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)具有快速、靈敏、高通量、高特異性等特點(diǎn)，隨著篩查技術(shù)的普及和篩查人群的擴(kuò)大，該方法的假陽性率也在增加[2]，另有研究表明由于早產(chǎn)兒或低體重兒參與代謝的重要器官發(fā)育還尚未成熟與完善，體內(nèi)多種氨基酸和肉堿存在代謝異常，從而導(dǎo)致篩查假陽性率亦升高[3]。本研究運(yùn)用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)了解東莞地區(qū)早產(chǎn)兒的氨基酸代謝水平，探討早產(chǎn)兒與足月兒氨基酸代謝水平的差異，研究不同出生體質(zhì)量對(duì)早產(chǎn)兒的氨基酸代謝水平的影響，并初步建立早產(chǎn)兒的特異性參考范圍，提高篩查準(zhǔn)確性，降低假陽性率，同時(shí)為臨床醫(yī)生在早產(chǎn)兒的個(gè)性化營養(yǎng)支持策略提供參考依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 從2019年1-12月在東莞市出生并接受遺傳代謝病串聯(lián)質(zhì)譜篩查的56 438例新生兒中，選取3 381例活產(chǎn)早產(chǎn)兒作為早產(chǎn)兒組，將早產(chǎn)兒組按不同出生體質(zhì)量分為極低出生體重兒（<1 500 g）179例、低出生體重兒（1 500～2 499 g）1 588 例、單純早產(chǎn)兒（≥2 500 g）1 614例。同時(shí)隨機(jī)選取同期的正常足月新生兒3 845例作為正常足月兒組。早產(chǎn)兒組納入標(biāo)準(zhǔn)：妊娠不滿37周的活產(chǎn)新生兒;出生后一般情況良好;無嚴(yán)重的先天缺陷和遺傳代謝疾病;無圍生期窒息史。早產(chǎn)兒組排除標(biāo)準(zhǔn)：篩查基本資料不全。正常足月兒組納入標(biāo)準(zhǔn)：同期出生的健康活產(chǎn)新生兒（孕周≥37周且體重≥2 500 g）;無嚴(yán)重出生缺陷和遺傳代謝疾病。正常足月兒組排除標(biāo)準(zhǔn)：篩查基本資料不全。本研究已獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，所有標(biāo)本的采集和檢測均由新生兒監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書。

1.2 標(biāo)本的采集與遞送 新生兒出生48～72 h后并充分哺乳8次以上，特殊原因（提前出院、早產(chǎn)、疾病等）未及時(shí)采血者可延遲采血，但最遲不宜超過生后20 d。采血部位選擇足跟內(nèi)、外側(cè)緣，血滴于S&S903專用采血濾紙的篩查卡片上。要求采集4個(gè)血斑，每個(gè)血斑直徑不小于8 mm、背面滲透完好。血片在室溫自然晾干后密封保存于2～8 ℃冰箱，由本中心派專員每周上門兩次收取標(biāo)本，全程冷鏈遞送。

1.3 儀器和檢測方法

1.3.1 儀器 采用美國ABI公司的API3200串聯(lián)質(zhì)譜儀、日本島津公司LC-20AD高效液相色譜儀。

1.3.2 檢測方法 使用手動(dòng)打孔器取直徑3 mm的血斑于96孔聚丙烯板中，每孔加入100 μL含氨基酸和酰基肉堿同位素內(nèi)標(biāo)液的日常工作液，用黏性封膜覆蓋微孔板以減少揮發(fā)，置于溫度為45 ℃、振蕩速度為650 r/min的孵育器中振蕩45 min。然后取出75 μL溶液至96孔V型底、耐熱微孔板內(nèi)，用鋁箔封套好后置入自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)行檢測。

1.4 數(shù)據(jù)分析 采用美國ABI公司ChemoView 2.0軟件，根據(jù)已知濃度的內(nèi)標(biāo)物和目標(biāo)分析物的離子峰強(qiáng)度，可直接換算得出待測標(biāo)本氨基酸的濃度及相應(yīng)的比值。氨基酸參考范圍的建立采用百分位數(shù)法，取雙側(cè)限值P2.5～P97.5的值作為參考區(qū)間，用“P2.5～P97.5”表示。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 23.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較 兩組平均胎齡和平均出生體質(zhì)量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1。

2.2 兩組氨基酸代謝水平比較 早產(chǎn)兒組丙氨酸（Ala）、甘氨酸（Gly）、脯氨酸（Pro）、纈氨酸（Val）濃度均低于正常足月兒組，而瓜氨酸（Cit）、甲硫氨酸（Met）、苯丙氨酸（Phe）、酪氨酸（Tyr）濃度均高于正常足月兒組（P<0.05）;兩組亮氨酸（Leu）濃度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

2.3 早產(chǎn)兒組不同出生體質(zhì)量早產(chǎn)兒氨基酸代謝水平比較 早產(chǎn)兒組不同出生體質(zhì)量早產(chǎn)兒9種氨基酸代謝水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。Ala、Gly、Tyr濃度隨著出生體質(zhì)量的增加而升高，Cit、Phe濃度隨著出生體質(zhì)量的增加而降低，Leu、Met、Pro、Val濃度在極低出生體重兒組明顯降低。見表3。

2.4 不同出生體質(zhì)量早產(chǎn)兒氨基酸參考范圍 不同出生體質(zhì)量早產(chǎn)兒氨基酸參考范圍，見表4。

3 討論

近年來，國家對(duì)出生缺陷的防控愈加重視，而新生兒疾病篩查是預(yù)防出生缺陷的第三道防線，是降低出生缺陷和提高出生人口素質(zhì)的有力舉措。串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)應(yīng)用于新生兒遺傳代謝病篩查以來，大大擴(kuò)展了疾病的篩查譜，實(shí)現(xiàn)了遺傳代謝病篩查領(lǐng)域的重大突破，一次實(shí)驗(yàn)即可檢測多達(dá)40余種遺傳代謝病，包括氨基酸代謝病、有機(jī)酸代謝病和脂肪酸氧化障礙等，大幅度提高了篩查效率。隨著串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)的日益成熟和不斷的推廣普及，近年來已成為生物、醫(yī)學(xué)、制藥等領(lǐng)域的重要分析方法，特別在新生兒遺傳代謝病篩查的應(yīng)用得到業(yè)界的一致認(rèn)可。該技術(shù)能在遺傳代謝性疾病的早期診斷和正確治療提供可靠的依據(jù)，大大降低了患兒的致殘率和病死率，減輕家庭和社會(huì)的負(fù)擔(dān)[4]。

氨基酸作為蛋白質(zhì)的基本組成單位，是新生兒營養(yǎng)的重要成分之一，其在蛋白合成、能量供給、生理功能的調(diào)節(jié)以及促進(jìn)生長發(fā)育等方面都發(fā)揮著不可或缺的作用。近些年，隨著經(jīng)濟(jì)水平的不斷提高和醫(yī)療技術(shù)的飛速發(fā)展，早產(chǎn)兒的存活率逐漸提高[5]，關(guān)注早產(chǎn)兒的早期生存質(zhì)量及遠(yuǎn)期健康發(fā)展已成為新生兒領(lǐng)域的重點(diǎn)方向，越來越多的專家學(xué)者對(duì)早產(chǎn)兒氨基酸代謝方面進(jìn)行研究[6-7]。本研究運(yùn)用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對(duì)早產(chǎn)兒和足月兒氨基酸代謝水平進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)早產(chǎn)兒的氨基酸代謝水平與足月兒存在顯著差異，早產(chǎn)兒組丙氨酸（Ala）、甘氨酸（Gly）、脯氨酸（Pro）、纈氨酸（Val）濃度均低于正常足月兒組（P<0.05）。氨基酸的代謝水平在一定程度上揭示了體內(nèi)的營養(yǎng)代謝狀態(tài)，低濃度的氨基酸水平側(cè)面反映了早產(chǎn)兒氨基酸的合成能力不足及低效率的營養(yǎng)吸收[8]。這可能與早產(chǎn)兒的胎盤氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)功能不成熟有關(guān)[9]。甘氨酸的內(nèi)源性需求很高，特別在病情危重或補(bǔ)充氧氣等應(yīng)激狀態(tài)下需求可能增加，但早產(chǎn)兒可能無法充分合成和吸收這種氨基酸，導(dǎo)致其水平隨著早產(chǎn)的增加而下降;脯氨酸參與細(xì)胞生物化學(xué)及生理功能的調(diào)節(jié)，同時(shí)在腸道免疫系統(tǒng)中起重要作用[10]。

本研究結(jié)果顯示，早產(chǎn)兒組瓜氨酸（Cit）、甲硫氨酸（Met）、苯丙氨酸（Phe）、酪氨酸（Tyr）濃度均高于正常足月兒組（P<0.05）。這與YANG等[11]的報(bào)道相似，他們發(fā)現(xiàn)早產(chǎn)兒低出生體重組的苯丙氨酸、甲硫氨酸和酪氨酸濃度均高于正常對(duì)照組。另外，易芳等[12]也證實(shí)與正常足月兒相比，小于胎齡兒的甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸的濃度更高。由于早產(chǎn)兒體內(nèi)參與蛋白質(zhì)代謝的重要器官發(fā)展緩慢，其對(duì)應(yīng)的代謝酶不活躍或合成相對(duì)不足，容易造成氨基酸過量或缺乏。苯丙氨酸的濃度升高可能是早產(chǎn)兒肝臟的正常代謝模式尚未完全建立起來，苯丙氨酸羥化酶活性降低或輕度延遲，從而引起的暫時(shí)性升高。而4-羥基苯基丙酮酸氧化酶不成熟可導(dǎo)致早產(chǎn)兒酪氨酸濃度升高，胱硫醚酶活性降低則導(dǎo)致甲硫氨酸濃度的升高[13]。

本研究結(jié)果顯示，早產(chǎn)兒大多數(shù)氨基酸代謝濃度隨著出生體質(zhì)量的變化而發(fā)生相應(yīng)的改變，早產(chǎn)兒組不同出生體質(zhì)量早產(chǎn)兒9種氨基酸代謝水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。Ala、Gly、Tyr濃度隨著出生體質(zhì)量的增加而升高，Cit、Phe濃度隨著出生體質(zhì)量的增加而降低，Leu、Met、Pro、Val濃度在極低出生體重兒組明顯降低。值得注意的是，當(dāng)出生體質(zhì)量越低時(shí)這種差異越明顯，但隨著出生體質(zhì)量的增加，大多數(shù)氨基酸濃度趨向接近于健康足月新生兒的水平，由此推測早產(chǎn)兒出生體質(zhì)量可影響其體內(nèi)氨基酸濃度的分布。YANG等[14]在調(diào)查2 159例早產(chǎn)兒氨基酸值變化的初步研究中也觀察到這一現(xiàn)象;王淮燕等[15]在探討1 992例早產(chǎn)兒的全血氨基酸代謝變化特征的研究中也得出相同結(jié)論：出生體質(zhì)量對(duì)新生兒氨基酸代謝水平的分布具有重要影響。因此，在評(píng)估新生兒氨基酸代謝水平時(shí)，尤其是低出生體重的早產(chǎn)兒，應(yīng)充分考慮出生體質(zhì)量這個(gè)重要的干擾因素[16]。

本研究選取2019年1-12月于東莞地區(qū)出生的3 381例早產(chǎn)兒，根據(jù)不同出生體質(zhì)量初步建立極低出生體重兒、低出生體重兒和單純早產(chǎn)兒的分級(jí)參考范圍，以供臨床評(píng)估參考。臨床對(duì)疾病的診斷、預(yù)后的判斷、治療效果的評(píng)估均取決于可靠的參考范圍[17]。目前，國內(nèi)尚無基于多中心、大數(shù)據(jù)的臨床樣本研究來建立早產(chǎn)兒的氨基酸參考范圍。本研究的標(biāo)本量尚顯不足，今后將進(jìn)一步積累更多的研究樣本數(shù)，并通過長期隨訪進(jìn)行樣本驗(yàn)證，不斷加以優(yōu)化早產(chǎn)兒的參考范圍，以評(píng)估其在臨床的適用性。

眾所周知，腸外營養(yǎng)常用于改善早產(chǎn)兒的營養(yǎng)狀況，以保證其正常生長發(fā)育所需的營養(yǎng)物質(zhì)，是提高早產(chǎn)兒存活率的關(guān)鍵措施。Heimler等[18]發(fā)現(xiàn)，早期接受腸外營養(yǎng)的早產(chǎn)兒氨基酸濃度接近于體重較大的早產(chǎn)兒，這表明早產(chǎn)兒的氨基酸濃度可能受腸外營養(yǎng)補(bǔ)充的影響。這是本研究存在的局限性，未將此因素考慮在內(nèi)，可能存在一小部分早產(chǎn)兒在補(bǔ)充腸外營養(yǎng)后采血進(jìn)行遺傳代謝病的篩查。由于本中心承擔(dān)整個(gè)東莞市的新生兒疾病篩查工作，采血單位送檢時(shí)可能未注明早產(chǎn)或低出生體重兒的一些特殊信息，如疾病情況、用藥情況、腸外營養(yǎng)輸注等。今后，將完善早產(chǎn)兒這一特殊群體的信息登記管理，以便于篩查結(jié)果的判讀。但筆者發(fā)現(xiàn)，即使存在腸外營養(yǎng)的影響，早產(chǎn)兒的多種氨基酸濃度仍然顯著降低。

綜上所述，東莞地區(qū)早產(chǎn)兒的氨基酸代謝水平與正常足月兒存在顯著差異，出生體質(zhì)量是影響氨基酸水平分布的重要因素。串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)是評(píng)估早產(chǎn)兒氨基酸代謝水平的重要且可靠的方法，實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)不同出生體質(zhì)量來建立早產(chǎn)兒的特異性參考范圍，以此降低篩查假陽性率的發(fā)生，提高篩查的準(zhǔn)確性，同時(shí)為臨床制定早產(chǎn)兒營養(yǎng)策略提供參考依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1]顧學(xué)范.臨床遺傳代謝病[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2015：1-95.

[2]楊宇奇，蔣曙紅，韓小亞，等.20027例新生兒遺傳代謝病串聯(lián)質(zhì)譜篩查的初步報(bào)告[J].重慶醫(yī)學(xué)，2018，47（2）：246-249.

[3] Slaughter J L，Meinzen-Derr J，Rose S R，et al.The effects of gestational age and birth weight on false-positive newborn-screening rates[J].Pediatrics，2010，126（5）：910-916.

[4]黃新文，楊建濱，童凡，等.串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對(duì)新生兒遺傳代謝病的篩查及隨訪研究[J].中華兒科雜志，2011，19（10）：765-770.

[5] Helenius K，Sjors G，Shah P S，et al.Survival in Very Preterm Infants：An International Comparison of 10 National Neonatal Networks[J/OL].Pediatrics，2017，140（6）：e20171264.

[6]閆磊，楊堯，王艷，等.足月和早產(chǎn)新生兒的LC-MS/MS氨基酸譜和?；鈮A譜分析[J].中國兒童保健雜志，2016，24（8）：791-794.

[7]林飛，徐鈺琪，闕婷，等.新生黃疸患兒與早產(chǎn)低體質(zhì)量兒體內(nèi)氨基酸水平變化原因分析[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2014，11（21）：2947-2949.

[8] LIU Qian，WU Jing，SHEN Wen，et al.Analysis of amino acids and acyl carnitine profiles in low birth weight，preterm，and small for gestational age neonates[J].The Journal of Maternal-Fetal & Neonatal Medicine，2017，30（22）：2697-2704.

[9] LIU Jing，CHEN Xinxin，LI Xiangwen，et al.Metabolomic Research on Newborn Infants With Intrauterine Growth Restriction[J/OL].Medicine，2016，95（17）：e3564.

[10]全美盈，孫秀靜.探尋新生兒氨基酸的最佳營養(yǎng)組成[J].中國新生兒科雜志，2013，28（3）：213-215.

[11] YANG Lili，ZHANG Yu，YANG Jianbin，et al.Effects of birth weight on profiles of dried blood amino-acids and acylcarnitines[J].Annals of Clinical Biochemistry，2017，55（1）：92-99.

[12]易芳，王玲，王梅，等.胎齡聯(lián)合出生體重對(duì)新生兒遺傳代謝病相關(guān)代謝物的影響[J].中國當(dāng)代兒科雜志，2018，20（5）：352-357.

[13] Mandour I，EI Gayar D，Amin M，et al.Amino Acid and Acylcarnitine Profiles in Premature Neonates：A Pilot Study[J].Indian Journal of Pediatrics，2013，80（9）：736-744.

[14] YANG Yuqi，YU Bin，LONG Wei，et al.Investigating the changes in amino acid values in premature infants：a pilot study[J].J Pediatr Endocrinol Metab，2018，31（4）：435-441.

[15]王淮燕，蔡青，楊宇奇，等.早產(chǎn)兒全血氨基酸代謝的變化特征分析[J].中國中西醫(yī)結(jié)合急救雜志，2018，25（4）：388-391，421.

[16]萬婷，劉洪喜，楊宇奇，等.低出生體重兒全血氨基酸水平的變化[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2018，45（11）：1971-1974，1979.

[17]宋文琪，彭曉霞，沈穎，等.臨床實(shí)驗(yàn)室兒童參考區(qū)間制定的流程與挑戰(zhàn)[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2017，40（5）：345-351.

[18] Heimler R，Bamberger J M，Sasidharan P.The Effects of Early Parenteral Amino Acids on Sick Premature Infants[J].Indian Journal of Pediatrics，2010，77（12）：1395-1399.

（收稿日期：2021-03-29） （本文編輯：程旭然）