薛正陽(yáng)，盧紅艷，唐煒，樂(lè)濤

(江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院兒科，江蘇 鎮(zhèn)江 212001)

研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群改變與認(rèn)知發(fā)育異常存在明顯相關(guān)性[1]。人類腸道菌群多樣性和豐度下降與自閉癥發(fā)生密切相關(guān)[2]，且與糞便短鏈脂肪酸含量變化有關(guān)。短鏈脂肪酸是一組少于六個(gè)碳的有機(jī)脂肪酸，主要包括乙酸、丙酸、丁酸、戊酸等，前三者占腸道中短鏈脂肪酸95%以上。對(duì)自閉癥患兒的研究發(fā)現(xiàn)，主要產(chǎn)丁酸的腸道菌群豐度降低，產(chǎn)戊酸相關(guān)細(xì)菌豐度增加，糞便中乙酸和丁酸含量較低，戊酸水平較高[3]。腹腔注射丁酸鈉可減輕自閉癥小鼠社交功能缺陷[4]。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥患者糞便中乙酸及丙酸明顯較低，將其糞便微生物群移植到缺乏微生物群的大鼠身上會(huì)傳播焦慮樣行為[5]。以上研究結(jié)果提示，腸道菌群代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸可能直接影響大腦功能。目前，糞便短鏈脂肪酸變化是否會(huì)導(dǎo)致早產(chǎn)后認(rèn)知障礙尚不明確。本研究應(yīng)用高通量測(cè)序與氣相色譜技術(shù)定量檢測(cè)早產(chǎn)認(rèn)知障礙大鼠糞便腸道菌群以及短鏈脂肪酸含量，探討腸道菌群及其代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸與早產(chǎn)后認(rèn)知障礙發(fā)生的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑與儀器

60只SPF級(jí)健康孕16～17 d SD孕鼠，11周齡，體質(zhì)量(410±40) g，由江蘇大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SYXK(蘇)2013-0036。

脂多糖(美國(guó)Sigma公司)；Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)相關(guān)儀器由江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供；Illumina MiSeq測(cè)序儀(美國(guó)Illumina公司)；Onedrop儀器(南京五義科技有限公司)；GC-14B型氣相色譜儀(日本Shimadzu公司)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理 認(rèn)知障礙大鼠模型制備參考本實(shí)驗(yàn)室方法[6]。將60只孕鼠隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組，每組30只，實(shí)驗(yàn)組連續(xù)2 d腹腔注射脂多糖，對(duì)照組注射PBS；孕21 d(足月為22～23 d)對(duì)兩組孕鼠行剖宮術(shù)取出早產(chǎn)大鼠，獲得30只實(shí)驗(yàn)組早產(chǎn)大鼠和15只對(duì)照組早產(chǎn)大鼠。通過(guò)定位航行實(shí)驗(yàn)，從實(shí)驗(yàn)組早產(chǎn)大鼠中篩選出21只得分低的早產(chǎn)大鼠作為認(rèn)知障礙組，從對(duì)照組早產(chǎn)大鼠中篩選出10只作為對(duì)照組。比較兩組大鼠在定位航行實(shí)驗(yàn)中找到平臺(tái)平均時(shí)間，采集大鼠糞便，并于-80 ℃保存待用。

1.2.2 高通量測(cè)序檢測(cè)腸道菌群 糞便腸道菌群檢測(cè)采用高通量測(cè)序16S rRNA檢測(cè)方法[6]，提取的基因組建庫(kù)后，在MiSeq平臺(tái)上進(jìn)行300×2 bp測(cè)序，該測(cè)序服務(wù)由天益健康科學(xué)研究院(鎮(zhèn)江)有限公司提供。

菌群數(shù)據(jù)應(yīng)用Ribosomal Database Project (RDP) Classifier 2.3軟件，與細(xì)菌數(shù)據(jù)庫(kù)Silva(v129)，生成各樣品分類學(xué)數(shù)據(jù)。采用PICRUSt方法，分析各樣品中菌群代謝基因豐富度及多樣性。

1.2.3 氣相色譜技術(shù)檢測(cè)糞便短鏈脂肪酸含量 取1 g糞便樣本，加入超純水5 mL，振蕩混勻；取 1 mL上清液，按照5 ∶1加入偏磷酸巴豆酸混合溶液(內(nèi)標(biāo))，-20 ℃保存過(guò)夜；解凍后12 000 r/min離心10 min；取上清液再加入樣品1 mL，迅速振蕩搖勻。測(cè)定前再12 000 r/min離心10 min；取上清液直接進(jìn)樣，用 1.0 μL微量進(jìn)樣器瞬時(shí)注入色譜儀，進(jìn)樣量為0.2～1.0 μL。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)樣品和內(nèi)標(biāo)巴豆酸各自的峰面積計(jì)算出各個(gè)樣品中乙酸、丙酸及丁酸濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 定位航行實(shí)驗(yàn)

早產(chǎn)認(rèn)知障礙大鼠找到平臺(tái)的平均時(shí)間[(40±5)s]明顯長(zhǎng)于對(duì)照組[(18±4)s，t=13.29,P<0.01]。

2.2 大鼠糞便腸道菌群多樣性指數(shù)分析

Chao1及Ace指數(shù)常代表菌群豐富度，Shannon 指數(shù)及Simpson 指數(shù)常代表菌群多樣性。認(rèn)知障礙組Chao1、Ace及Shannon指數(shù)明顯低于正常對(duì)照組 (P均<0.05)，兩組間Simpson 指數(shù)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組大鼠腸道菌群豐富度及多樣性指標(biāo)比較

2.3 大鼠糞便腸道菌群分析

從門(mén)水平而言，擬桿菌門(mén)與厚壁菌門(mén)構(gòu)成所有樣本中主要優(yōu)勢(shì)菌群。其中，認(rèn)知障礙組變形菌門(mén)豐度較對(duì)照組增加(P<0.05)，其他菌門(mén)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)表2。從目、屬水平而言，與對(duì)照組比較，認(rèn)知障礙組大鼠腸道中乳桿菌屬、擬桿菌目明顯降低(P均<0.05)。見(jiàn)表3。

表2 兩組大鼠腸道菌群門(mén)水平優(yōu)勢(shì)菌群比較

表3 兩組大鼠腸道菌群目、屬水平優(yōu)勢(shì)菌群比較 M(P25，P75)，%

2.4 兩組大鼠糞便短鏈脂肪酸變化

經(jīng)檢驗(yàn)分析，認(rèn)知障礙組總短鏈脂肪酸與乙酸水平明顯低于對(duì)照組(P均<0.05)，其他短鏈脂肪酸差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)表4。

表4 兩組大鼠糞便短鏈脂肪酸含量比較 M(P25，P75)，μmol/g

2.5 糞便短鏈脂肪酸與代表菌屬的相關(guān)性分析

將認(rèn)知障礙組大鼠短鏈脂肪酸與腸道菌群進(jìn)行Spearman相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，乳酸桿菌、擬桿菌與乙酸呈一定的正相關(guān)(r=0.488，0.361，P均<0.05)。

3 討論

定位航行實(shí)驗(yàn)是一種研究動(dòng)物大腦認(rèn)知功能的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)手段。本研究結(jié)果顯示，在定位航行實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，早產(chǎn)認(rèn)知障礙大鼠找到平臺(tái)的平均時(shí)間明顯延長(zhǎng)，提示造模成功，表明認(rèn)知障礙組存在認(rèn)知障礙。

SD大鼠1月齡與人類2～5歲即幼兒期等同，此時(shí)能充分評(píng)估認(rèn)知功能發(fā)育正常與否，且Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)是評(píng)估嚙齒類動(dòng)物認(rèn)知障礙的金標(biāo)準(zhǔn)，故早產(chǎn)大鼠出生30 d后，通過(guò)Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中的定位航行實(shí)驗(yàn)，可證明早產(chǎn)大鼠是否存在認(rèn)知障礙。

腸道菌群結(jié)構(gòu)的改變與認(rèn)知障礙聯(lián)系緊密。Liu等[7]研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，認(rèn)知障礙患者腸道菌群多樣性下降。Kelly等[8]發(fā)現(xiàn)，患有認(rèn)知障礙疾病患者腸道菌群數(shù)量與多樣性較健康者顯著降低。Cattaneo等[9]發(fā)現(xiàn)，輕度認(rèn)知障礙患者體內(nèi)變形菌門(mén)豐度增加。以上研究表明，認(rèn)知障礙患者腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，認(rèn)知障礙組早產(chǎn)大鼠腸道菌群豐富度及多樣性下降，擬桿菌門(mén)及厚壁菌門(mén)這兩種優(yōu)勢(shì)菌門(mén)豐度降低，變形菌門(mén)豐度明顯增加，同樣提示認(rèn)知障礙大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，表明腸道菌群結(jié)構(gòu)改變可能是早產(chǎn)合并認(rèn)知障礙的重要原因。

腸道中乳桿菌及擬桿菌與認(rèn)知功能障礙關(guān)系密切。Yu等[10]發(fā)現(xiàn)，抑郁癥模型大鼠乳桿菌水平相對(duì)豐度較低；Saji等[11]發(fā)現(xiàn)，認(rèn)知功能障礙患者擬桿菌水平較低。本研究對(duì)腸道菌群分析，同樣發(fā)現(xiàn)認(rèn)知障礙組早產(chǎn)大鼠腸道擬桿菌目及乳桿菌屬豐度明顯減低。妊娠20周至產(chǎn)后3歲為腦發(fā)育關(guān)鍵期，而腸道菌群的定植也發(fā)生在該關(guān)鍵窗口期。在該窗口期內(nèi)，若腸道菌群紊亂，短期有感染增加和炎癥進(jìn)程延長(zhǎng)風(fēng)險(xiǎn)，長(zhǎng)期可導(dǎo)致神經(jīng)發(fā)育異常。

腸道菌群產(chǎn)生的短鏈脂肪酸對(duì)大腦功能和行為有顯著影響。小膠質(zhì)細(xì)胞在大腦發(fā)育、可塑性和認(rèn)知方面起關(guān)鍵作用。Erny等[12]研究顯示，短鏈脂肪酸能促進(jìn)大腦小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育，影響少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞分化和髓鞘形成。在無(wú)菌模型小鼠中[12]，短鏈脂肪酸受體缺失，大腦小膠質(zhì)細(xì)胞整體缺陷，提示短鏈脂肪酸是調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞成熟和功能的關(guān)鍵分子。此外，血腦屏障形成也與短鏈脂肪酸有關(guān)[13]，由細(xì)菌產(chǎn)生的短鏈脂肪酸可降低血腦屏障通透性。給無(wú)菌小鼠補(bǔ)充可產(chǎn)生短鏈脂肪酸的細(xì)菌，小鼠血腦屏障恢復(fù)正常，提示調(diào)節(jié)短鏈脂肪酸含量，就有可能維持血腦屏障功能[13]。本研究中，認(rèn)知障礙組總短鏈脂肪酸水平與乙酸水平明顯低于對(duì)照組，也表明短鏈脂肪酸減少對(duì)大腦認(rèn)知功能形成產(chǎn)生影響。

乳桿菌與擬桿菌是常見(jiàn)的產(chǎn)乙酸菌。研究表明，口服乳酸桿菌12周可明顯改善認(rèn)知功能[14]。阿爾茨海默病模型小鼠的糞便和腦組織短鏈脂肪酸含量降低，而通過(guò)口服乙酸鹽能改善小鼠腦神經(jīng)損傷及認(rèn)知功能障礙[15]。由此提示，總短鏈脂肪酸及乙酸含量下降可能會(huì)導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙，且總短鏈脂肪酸及乙酸濃度降低可能與乳桿菌降低有關(guān)[16]。本研究分析發(fā)現(xiàn)，乙酸與擬桿菌目、乳桿菌屬呈一定正相關(guān)性，提示早產(chǎn)合并認(rèn)知障礙大鼠腸道內(nèi)乙酸含量下降可能與擬桿菌目、乳桿菌屬含量下降有關(guān)。擬桿菌目、乳桿菌屬水平下降所導(dǎo)致的總短鏈脂肪酸及乙酸水平下降可能導(dǎo)致早產(chǎn)合并認(rèn)知障礙。研究發(fā)現(xiàn)，大鼠自閉癥樣行為可由腦室內(nèi)高濃度丙酸引起[17]。Liu等[3]研究發(fā)現(xiàn)，自閉癥患兒糞便中丁酸含量較低。本研究中，認(rèn)知障礙組丙酸與丁酸含量與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明丙酸及丁酸改變是否與早產(chǎn)后認(rèn)知障礙有關(guān)尚需進(jìn)一步研究。本研究建立于動(dòng)物模型，短鏈脂肪酸是否造成人類早產(chǎn)合并認(rèn)知障礙，需要進(jìn)一步的人體試驗(yàn)論證。此外，本實(shí)驗(yàn)缺乏糞群移植等干預(yù)手段；未來(lái)研究可增加干預(yù)手段，多角度觀察論證菌群及其代謝產(chǎn)物與早產(chǎn)認(rèn)知障礙的關(guān)系。

綜上所述，早產(chǎn)認(rèn)知障礙大鼠的腸道菌群特征為變形菌門(mén)富集與擬桿菌目、乳桿菌屬含量降低。其擬桿菌目及乳桿菌屬低豐度所致總短鏈脂肪酸與乙酸下降可能導(dǎo)致早產(chǎn)合并認(rèn)知功能障礙。