尹偉力，吳 葳，劉曉靜，馬曉玲，韓 偉，吳寧寧，陳燕平

(1.煙臺(tái)海關(guān)技術(shù)中心，山東 煙臺(tái) 264000；2.武漢農(nóng)業(yè)檢測(cè)中心，湖北 武漢 430016；3.榮成海關(guān)，山東 榮成 264300；4.上海醫(yī)藥集團(tuán) 青島國風(fēng)藥業(yè)股份有限公司，山東 青島 266000；5.青島海關(guān)技術(shù)中心，山東 青島 266000)

2014年9月，浙江省養(yǎng)殖的凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)暴發(fā)了一種高死亡率的新疫病，患病蝦出現(xiàn)蝦殼變軟、顏色變淡，空胃，伴隨肝胰腺萎縮[1]。經(jīng)中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所研究表明，這種疾病是由一種新發(fā)現(xiàn)的虹彩病毒引起的，命名為十足目虹彩病毒1(Decapodiridescentvirus1，DIV1)[2-3]，舊稱為蝦血細(xì)胞虹彩病毒(SHIV)。對(duì)主要衣殼蛋白(MCP)和ATP酶的氨基酸序列分析，該病毒屬于虹彩病毒科下的一個(gè)新屬[4]。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，十足目虹彩病毒1也可感染中國明對(duì)蝦(Fenneropenaeuschinensis)和羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)[5-6]。近年來，該病已蔓延至我國沿海部分地區(qū)，并有加速擴(kuò)散趨勢(shì)，若未有效防控，將成為嚴(yán)重影響我國蝦類養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的疫病之一。

蝦類疫病的傳統(tǒng)檢測(cè)方法是PCR[7]，但該方法需要專用擴(kuò)增儀器，不適合基層及現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。近來，愈來愈多操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)周期短的分子生物檢測(cè)技術(shù)廣泛應(yīng)用于十足目虹彩病毒1，其中，重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)(RPA)發(fā)展較為迅速。該技術(shù)無需造價(jià)高昂的升降溫儀器，在恒溫條件下20 min內(nèi)即可完成核酸擴(kuò)增，反應(yīng)快速而靈敏，擴(kuò)增產(chǎn)物可以通過構(gòu)建熒光探針法進(jìn)行實(shí)時(shí)定量檢測(cè)，也可以與DNA芯片、瓊脂糖凝膠電泳、側(cè)流層析試紙條等多種檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合進(jìn)行檢測(cè)[8-10]，適合基層實(shí)驗(yàn)室及一線口岸的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。筆者根據(jù)十足目虹彩病毒1保守序列ATP酶基因設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物，基于重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)，建立一種操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)時(shí)間短、特異性好、靈敏度高的僅需普通恒溫設(shè)備的十足目虹彩病毒1檢測(cè)方法，適用于一線口岸實(shí)驗(yàn)室的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，可以有效對(duì)十足目虹彩病毒1進(jìn)行早期監(jiān)控及日常檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 主要試驗(yàn)材料

白斑綜合征病毒(WSSV)泰國株由本實(shí)驗(yàn)室保存，十足目虹彩病毒1、傳染性皮下造血器官壞死病毒(IHHNV)廣西株、Taura綜合征病毒(TSV)ZHZC3 株、黃頭病毒基因1型(YHV-1) Qingdao201603 株由廣西水產(chǎn)研究科學(xué)院提供。

2016—2018年，共采集國內(nèi)養(yǎng)殖蝦樣品509批，每批至少30尾。蝦類主要有中國明對(duì)蝦、斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeusmonodon)、羅氏沼蝦、凡納濱對(duì)蝦。采集蝦苗、幼蝦和成蝦，取每尾蝦的鰓、血淋巴、胃部和腹部肌肉。

DNA和RNA提取試劑盒(西安天隆科技有限公司)；質(zhì)粒DNA抽提試劑盒、Pmd18-T載體、DL2000 Marker、PCR Master Mix[寶生物工程(大連)有限公司]；重組酶及聚合酶試劑盒(北京強(qiáng)欣博瑞生物科技有限公司)。

1.2 引物設(shè)計(jì)

登錄GenBank，根據(jù)已發(fā)表的十足目虹彩病毒1的ATP酶基因(KY681040)保守序列，參照重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)引物設(shè)計(jì)要求[11-12]設(shè)計(jì)引物，上下游引物序列如下：

上游引物S1:5′-GACAGGAGAGGGAAATAACGGGAAAACGGT-3′(KY681040中318～347位點(diǎn))；下游引物S2:5′-ATTTGGTTCATCCATGACTGCCCATCTAACA-3′(KY681040中471～501位點(diǎn))。預(yù)期擴(kuò)增條帶為184 bp。采用中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所的巢式PCR的引物，進(jìn)行巢式PCR。

第1輪PCR引物:F1,5′-GGGCGGGAGATGGTGTTAGAT-3′;R1,5′-TCGTTTCGGTACGA AGATGTA-3′。第2輪PCR引物:F2,5′-CGGGA AACGATTCGTATTGGG-3;R2,5′-TTGCTTGA TCGGCATCCTTGA-3′。上述引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)的優(yōu)化

構(gòu)建50 μL重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)反應(yīng)體系：向含有重組酶及聚合酶的反應(yīng)管中加入25 μL(2×)反應(yīng)緩沖液、濃度為5 μmol/L的上下游引物S1、S2各4 μL，加入模板DNA 2.0 μL，加入雙蒸水至總體積為47.5 μL后混合均勻，加入2.5 μL濃度為280 mmol/L的醋酸鎂溶液后充分混勻。試驗(yàn)共設(shè)置25、30、35、40、42 ℃ 5個(gè)溫度梯度，探尋最優(yōu)反應(yīng)溫度，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照。將待優(yōu)化樣品放置于金屬浴內(nèi)，37 ℃條件下，反應(yīng)時(shí)長為30 min，經(jīng)瓊脂糖電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物確定最佳反應(yīng)溫度。以相同反應(yīng)體系，在最優(yōu)反應(yīng)溫度條件下優(yōu)化反應(yīng)時(shí)間，恒溫孵育15、20、25、30 min，產(chǎn)物經(jīng)電泳分析確定最優(yōu)反應(yīng)時(shí)間。最終確定完整的重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)反應(yīng)體系。

1.4 G基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

參照文獻(xiàn)[13]設(shè)計(jì)的擴(kuò)增十足目虹彩病毒1 ATP酶基因的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增目的片段進(jìn)行膠回收，純化后連接pMD18-T載體構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18-S，將構(gòu)建好的陽性質(zhì)粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行序列分析鑒定。測(cè)定pMD18-S質(zhì)粒含量，計(jì)算拷貝數(shù)。

1.5 重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)特異性試驗(yàn)

利用DNA提取試劑盒提取十足目虹彩病毒1、白斑綜合征病毒、傳染性皮下造血器官壞死病毒病毒株的DNA；利用RNA提取試劑盒提取Taura綜合征病毒、YHDV-1，以RNA逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。以上述DNA、cDNA作為模板，利用建立的重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)方法進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)該方法的特異性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.6 重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)靈敏度試驗(yàn)

以倍比稀釋的重組質(zhì)粒pMD18-G作為模板進(jìn)行重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)反應(yīng)，確定該方法的敏感性。同時(shí)采用中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所設(shè)計(jì)的巢式PCR[6]對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR，比較兩種方法的檢測(cè)結(jié)果。

1.7 臨床樣品的檢測(cè)

采集自養(yǎng)殖場(chǎng)的樣品中，整個(gè)蝦苗被用作樣本；幼蝦和成蝦取鰓等組織均勻化以提取DNA，利用建立的重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。50 μL反應(yīng)體系，其中25 μL反應(yīng)緩沖液(2×)、上下游引物S1、S2(5 μmol/L)各4 μL以及2.0 μL 樣品DNA，用雙蒸水補(bǔ)至總體積為47.5 μL后充分混勻，加入2.5 μL 280 mmol/L醋酸鎂溶液并混合均勻。同時(shí)利用巢式PCR方法檢測(cè)，比較二者結(jié)果。

引物F1和R1進(jìn)行第1輪PCR，反應(yīng)體系：PCR Master Mix 12.5 μL，引物 F1 (10 pmol/μL)和R1 (10 pmol/μL)各1 μL，樣品DNA 2 μL，加ddH2O至25 μL。反應(yīng)程序:94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，共36個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min；4 ℃保存。第1輪PCR預(yù)計(jì)目標(biāo)條帶為457 bp。

第1輪的產(chǎn)物稀釋100倍后作為第2輪的模板。使用第2輪PCR的特異性引物F2和R2再次進(jìn)行PCR。反應(yīng)體系和程序與第1輪PCR一致。反應(yīng)結(jié)束后產(chǎn)物經(jīng)電泳分析預(yù)測(cè)目標(biāo)條帶為129 bp。

2 結(jié) 果

2.1 ATP酶基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建

以十足目虹彩病毒1基因組DNA為模板擴(kuò)增ATP酶基因，提取擴(kuò)增片段后純化，連接載體轉(zhuǎn)化，對(duì)重組質(zhì)粒pMD18-S進(jìn)行篩選，重組質(zhì)粒經(jīng)PCR擴(kuò)增鑒定，結(jié)果顯示，擴(kuò)增出一條約1200 bp的片段，與設(shè)計(jì)相符，表明成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pMD18-S。用核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)定pMD18-S的含量，根據(jù)公式計(jì)算出拷貝數(shù)為7.0×1010拷貝/μL(圖1)。

圖1 ATP酶基因重組質(zhì)粒的PCR鑒定結(jié)果Fig.1 Identification of recombinant plasmid ATPase gene by PCRM.DL2000;1.ATP酶基因;2.陰性對(duì)照.M.DL2000;1.ATPase gene;2.negative control.

2.2 十足目虹彩病毒1的重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)建立

設(shè)置5個(gè)溫度梯度，用以摸索最佳反應(yīng)溫度。擴(kuò)增結(jié)果顯示，溫度為25～42 ℃時(shí)，均可以擴(kuò)增出184 bp的特異性目的條帶。擴(kuò)增溫度設(shè)置為35、40、42 ℃時(shí)，由圖2a可見，除目的條帶外，還出現(xiàn)了微弱的非目的條帶。擴(kuò)增溫度為25 ℃時(shí)擴(kuò)增的目的條帶不如30 ℃的擴(kuò)增條帶明亮，因此十足目虹彩病毒1的最佳擴(kuò)增溫度最終確定為30 ℃。在30 ℃下重組酶聚合酶擴(kuò)增反應(yīng)，20 min反應(yīng)時(shí)間特異性條帶比15 min更清晰明亮，因此20 min為十足目虹彩病毒1的最優(yōu)擴(kuò)增時(shí)長(圖2b)。

圖2 十足目虹彩病毒1的重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)優(yōu)化試驗(yàn)Fig.2 Optimization test of RPA for DIV1a:M.DL2000;1.陰性對(duì)照negative control;2.25 ℃;3.30 ℃;4.35 ℃;5.40 ℃;6.42 ℃.b:M.DL2000;1.陰性對(duì)照negative control;2.15 min;3.20 min;4.25 min;5.30 min.

2.3 重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)的特異性試驗(yàn)

運(yùn)用建立的重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)對(duì)十足目虹彩病毒1、白斑綜合征病毒和傳染性皮下造血器官壞死病毒的DNA，以及Taura綜合征病毒和黃頭病毒基因1型cDNA進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，只有十足目虹彩病毒1在約184 bp處出現(xiàn)明顯的特異性條帶，其余4種病毒均未出現(xiàn)特異性擴(kuò)增條帶(圖3)。表明所建立的重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)方法具有較好的特異性。

圖3 十足目虹彩病毒1的重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)特異性試驗(yàn)Fig.3 The specificity results of recombinase polymerase amplification technology(RPA) for DIV1 by RPAM.DL2000;1.十足目虹彩病毒1;2.白斑綜合征病毒;3.傳染性皮下造血器官壞死病毒;4.Taura綜合征病毒;5.黃頭病毒基因1型;6.陰性對(duì)照.M.DL2000;1.DIV1;2.WSSV;3.IHHNV;4.TSV;5.YHV-1;6.negative control.

2.4 重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)與PCR方法靈敏度試驗(yàn)

以倍比稀釋的重組質(zhì)粒pMD18-G(7.0×104～7.0×100拷貝/μL)為模板，進(jìn)行靈敏度試驗(yàn)，并與巢式PCR方法進(jìn)行比較，結(jié)果顯示重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)的檢測(cè)限為7拷貝/μL，遠(yuǎn)高于巢式PCR方法的檢測(cè)限70拷貝/μL(圖4)，表明重組酶聚合酶擴(kuò)增方法比PCR方法靈敏度高。

圖4 重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)(a)與PCR(b)敏感性對(duì)比試驗(yàn)Fig.4 Sensitivity test of RPA(a) compared with PCR(b)M.DL2000;1.7.0×104拷貝/μL;2.7.0×103拷貝/μL;3.7.0×102拷貝/μL;4.7.0×101拷貝/μL;5.7.0×100拷貝/μL;6.陰性對(duì)照.M.DL2000;1.7.0×104copies/μL;2.7.0×103 copies/μL;3.7.0×102 copies/μL;4.7.0×101 copies/μL;5.7.0×100copies/μL;6.negative control

2.5 臨床樣品的檢測(cè)

用建立好的重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)法與巢式PCR方法對(duì)本實(shí)驗(yàn)室采集的509份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)比結(jié)果顯示，十足目虹彩病毒1的重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)法與巢式PCR法的檢測(cè)結(jié)果相同，共檢測(cè)出13份陽性樣品，但巢式PCR檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)了2份弱陽性樣品(表1)，結(jié)果表明，十足目虹彩病毒1重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)法可有效地檢出巢式PCR方法的弱陽性樣品，因此十足目虹彩病毒1重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)法的靈敏度高于巢式PCR方法。

表1 重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)法(RPA)和巢式PCR方法對(duì)臨床樣品檢測(cè)結(jié)果Tab.1 The detective result comparison of clinical samples by RPA and nested-PCR methods

3 討 論

3.1 重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)的特異性試驗(yàn)

十足目虹彩病毒1作為國內(nèi)新流行的蝦類疫病病原，是口岸檢疫的重要檢疫對(duì)象。因?yàn)槲r類病毒無法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，分子生物學(xué)技術(shù)成為主要檢測(cè)方法，如PCR、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增等成為檢測(cè)蝦類病毒的主要檢測(cè)技術(shù)。這些方法還存在一些不足，PCR需要價(jià)值較高的變溫?cái)U(kuò)增儀，某些基層實(shí)驗(yàn)室條件無法滿足，并且檢測(cè)周期較長，擴(kuò)增時(shí)長約2～3 h；而環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法需要設(shè)計(jì)2～3組引物，引物之間容易產(chǎn)生二聚體，造成結(jié)果假陽性[14-16]。與傳統(tǒng)核酸擴(kuò)增技術(shù)相比，重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)周期短，0.5 h內(nèi)即可完成，無需變溫?cái)U(kuò)增儀，使用恒溫水浴鍋等普通設(shè)備即可完成，檢測(cè)靈敏度高，結(jié)果判定簡(jiǎn)單、形式多樣化[17]。作為新發(fā)展起來的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，近些年被應(yīng)用于多種領(lǐng)域，如轉(zhuǎn)基因檢測(cè)、病原微生物檢驗(yàn)、動(dòng)物致病病原體檢疫等。鄧婷婷等[18]利用重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)，建立了Cry1Ab/c基因的37 ℃恒溫快速檢測(cè)方法，可以鑒別轉(zhuǎn)基因水稻；劉立兵等[19]建立了可以在38 ℃恒溫條件下快速檢測(cè)豬細(xì)小病毒的重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)。重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)最佳反應(yīng)溫度在25～42 ℃，本試驗(yàn)設(shè)置了25、30、35、40、42 ℃ 5個(gè)溫度梯度，對(duì)比各個(gè)溫度的擴(kuò)增結(jié)果，確定30 ℃為最佳反應(yīng)溫度。在確定最優(yōu)反應(yīng)溫度后，設(shè)計(jì)了15、20、25、30 min 4個(gè)反應(yīng)時(shí)間，結(jié)果表明，20 min反應(yīng)時(shí)間特異性條帶比15 min更清晰明亮，因此20 min為十足目虹彩病毒1的最優(yōu)擴(kuò)增時(shí)長。

3.2 重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)的特異性試驗(yàn)

引物設(shè)計(jì)是重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)設(shè)計(jì)的核心。不同于PCR引物的設(shè)計(jì)，重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)引物沒有專門的生物軟件，只可人工比對(duì)序列，在保守區(qū)域設(shè)計(jì)[20]。重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)引物設(shè)計(jì)一般遵循以下幾個(gè)規(guī)律：一是重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)引物長度不多于45 bp，最優(yōu)堿基數(shù)為30～35 bp，引物堿基數(shù)太少會(huì)影響與重組酶的結(jié)合，降低了擴(kuò)增速度，但是堿基數(shù)大于45 bp的引物設(shè)計(jì)時(shí)會(huì)出現(xiàn)引物發(fā)夾、連續(xù)序列的重復(fù)、回文序列等問題，造成引物設(shè)計(jì)失敗[21-22]；二是擴(kuò)增目的片段長度的選擇，重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)目的片段通常長度在80～400 bp，100～200 bp之間的片段擴(kuò)增效果最佳，靈敏度高，特異性好[23-24]。

3.3 重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)的特異性和靈敏度

筆者根據(jù)十足目虹彩病毒1的ATP酶基因保守區(qū)域的序列設(shè)計(jì)了引物，建立了十足目虹彩病毒1的重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法。該方法在30 ℃效果最優(yōu)，無需昂貴的變溫儀器；20 min反應(yīng)即可完成檢測(cè)，相比常規(guī)的PCR方法，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，提高檢測(cè)效率；該方法對(duì)十足目虹彩病毒1的最低檢出限為7 拷貝/μL，比巢式PCR 70拷貝/μL的最低檢出限靈敏。夏小明[25]基于重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)，建立了白斑綜合征病毒和傳染性皮下造血器官壞死病毒的重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)方法，最低檢出限分別為10拷貝/μL和4 拷貝/μL，與本試驗(yàn)的檢出限類似，說明重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)在水生動(dòng)物病毒最低檢出限基本約為10拷貝/μL。利用本試驗(yàn)建立的方法對(duì)國內(nèi)養(yǎng)殖場(chǎng)采集的509份臨床樣品進(jìn)行重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)，采集樣品種類涉及國內(nèi)養(yǎng)殖最多的中國明對(duì)蝦、斑節(jié)對(duì)蝦、羅氏沼蝦、凡納濱對(duì)蝦等蝦類，其中凡納濱對(duì)蝦陽性率最高(6/293)。將重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)法檢測(cè)的結(jié)果與巢式PCR法進(jìn)行比較，重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)法可以有效地檢出巢式PCR法的弱陽性樣品，且其余樣品重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)法與巢式PCR法的檢測(cè)結(jié)果一致，證明重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)的靈敏度高于巢式PCR，避免假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。巢式PCR檢測(cè)出的弱陽性樣品因?yàn)閿U(kuò)增產(chǎn)物含量較低，無法進(jìn)行測(cè)序分析，從而不能確定樣品檢測(cè)結(jié)果是否為陽性。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)建立了十足目虹彩病毒1的重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)方法，20 min反應(yīng)即可完成檢測(cè)，最低檢出限為7 拷貝/μL。該方法快速靈敏、特異性好、操作簡(jiǎn)便，適用于基層養(yǎng)殖單位和一線口岸的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。