姜 媛，丁 寧，胡學(xué)軍*

(1.大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院，遼寧 大連 116000；2.大連大學(xué) 醫(yī)學(xué)研究中心，遼寧 大連 116622)

目前，重組蛋白已被廣泛應(yīng)用于臨床治療、醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)、環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域[1]。低成本高效的純化重組蛋白是蛋白生產(chǎn)的關(guān)鍵技術(shù)。通常采用各種色譜柱進(jìn)行蛋白質(zhì)純化，該方法同時(shí)需要輔助設(shè)備，比如蛋白質(zhì)分離純化系統(tǒng)[2]。而類(lèi)彈性蛋白多肽(elastin-like polypeptides，ELPs)的出現(xiàn)給純化重組蛋白提供了新的途徑。

1973年，Urry等發(fā)現(xiàn)天然彈性蛋白疏水區(qū)域中含有大量的Val-Pro-GIy-Val-Gly(VPGVG)重復(fù)氨基酸序列[3]。ELPs是根據(jù)重復(fù)五肽氨基酸序列人工合成的溫度敏感的蛋白質(zhì)聚合物(VPGVG)n，具有響應(yīng)溫度變化的可逆相變性質(zhì)[4-6]。因此，近年來(lái)ELPs因其具有明顯的可逆相變特性而備受關(guān)注[7]。ELPs在低于其可逆相變溫度(inverse transition temperature，ITT)下可溶于水溶液，但在高于ITT時(shí)變成不溶性聚集體[8]。隨機(jī)的單個(gè)ELPs鏈在達(dá)到ITT之前，隨著溫度的升高開(kāi)始呈現(xiàn)β-轉(zhuǎn)構(gòu)象，接著是β-螺旋構(gòu)象，然后在達(dá)到ITT時(shí)相互堆疊形成 “扭曲的細(xì)絲”并相互結(jié)合形成不溶性聚集體。此過(guò)程是可逆的，當(dāng)溫度降低到ITT以下時(shí)，聚集體重新溶于溶液中[9](圖1)。

圖1 ELPs可逆相變機(jī)理Fig.1 Inverse transition mechanism of ELPs

研究[10-13]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)ELPs基序與另一蛋白融合時(shí)，ELPs的可逆相變性質(zhì)得以維持。由此推斷ELPs允許重組蛋白的非色譜熱刺激相分離。自此ELPs便作為純化標(biāo)簽參與蛋白質(zhì)純化。雖然ELPs標(biāo)簽與現(xiàn)有純化標(biāo)簽均可用于標(biāo)準(zhǔn)化重組蛋白的純化過(guò)程，但現(xiàn)有純化標(biāo)簽的一個(gè)共同缺點(diǎn)是：大多數(shù)依賴(lài)于親和層析，成本較高，特別是大規(guī)模制備時(shí)。相比之下，ELPs標(biāo)簽的純化過(guò)程簡(jiǎn)單而直接，可以顯著降低重組蛋白的生產(chǎn)成本[14]。Hassouneh團(tuán)隊(duì)[2]將ELPs作為一種純化標(biāo)簽，當(dāng)加熱到溫度低于ITT時(shí)，采取多次可逆相變循環(huán)(inverse transition cycle,ITC)技術(shù)成功純化了ELPs融合蛋白。到目前為止，ITC技術(shù)已成功用于純化不同種類(lèi)蛋白質(zhì)[10,12,15]。ITC技術(shù)主要是依據(jù)ELPs標(biāo)簽特有的可逆相變特性[16-17]，通過(guò)改變ITT來(lái)改變ELPs重組蛋白的狀態(tài)(圖2)。該過(guò)程需要適當(dāng)?shù)娜芤涵h(huán)境，通常添加鹽溶液，如NaCl溶液(1～3 mol·L-1)、硫酸銨溶液(0.4～1.0 mol·L-1)或檸檬酸鈉溶液(0.15～0.50 mol·L-1)[18],然后進(jìn)行升溫以誘導(dǎo)ELPs重組蛋白聚集沉淀和離心，隨后降溫，在所需緩沖液中再次溶解沉淀蛋白。在大多數(shù)情況下，兩到三輪的升溫離心步驟足以純化得到所需的蛋白質(zhì)。ITC技術(shù)不需要昂貴的色譜設(shè)備、樹(shù)脂和試劑，儀器配置簡(jiǎn)單，僅用常規(guī)離心機(jī)或過(guò)濾裝置即可，并且所得蛋白質(zhì)的純化量及純度與親和色譜所得的基本一致。因此,ITC技術(shù)是一種非常經(jīng)濟(jì)有效且易于放大的純化技術(shù)。作者對(duì)ELPs標(biāo)簽相變條件的優(yōu)化、ELPs標(biāo)簽與靶蛋白重組方式的優(yōu)化、ELPs標(biāo)簽的切除及ELPs標(biāo)簽在純化重組蛋白中的應(yīng)用的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

圖2 采用ITC技術(shù)純化ELPs標(biāo)簽蛋白示意圖[3]Fig.2 Schematic diagram for purification of ELPs tag protein by ITC technique[3]

1 ELPs標(biāo)簽相變條件的優(yōu)化

最常用的ELPs有五肽序列(VPGXG)n，其中X為除脯氨酸以外的任何氨基酸占據(jù)的客體殘基，既可以是單個(gè)氨基酸，也可以是氨基酸的組合，n表示實(shí)現(xiàn)所需的ELPs鏈長(zhǎng)度。在ELPs設(shè)計(jì)中，ELPs的客體殘基組成和長(zhǎng)度是兩個(gè)正交的參數(shù)，可以用來(lái)控制ITT[16，19]。親水性客體殘基會(huì)提高ITT，而疏水性客體殘基會(huì)降低ITT。脯氨酸不能用作客體殘基，因?yàn)樗茐牧薊LPs的可逆相變性質(zhì)[20]。對(duì)于相同五肽重復(fù)序列組成的不同長(zhǎng)度ELPs，ELPs長(zhǎng)度和分子質(zhì)量增加會(huì)導(dǎo)致ITT降低[8]。ELPs的濃度也會(huì)對(duì)ITT造成影響，隨著ELPs濃度的增加，ITT呈對(duì)數(shù)式降低[21]。同時(shí)在溶液環(huán)境中，溶液中鹽濃度和溶液pH值也會(huì)影響ELPs的ITT。由于水分子和疏水基團(tuán)之間的極性越強(qiáng)，疏水水合作用越弱，因此提高有序化的共溶劑鹽的濃度也會(huì)降低ITT[22-23]。當(dāng)溶液pH值為客體氨基酸的pKa值時(shí)，蛋白離子化殘基部分最少，ITT最低[24]。ELPs標(biāo)簽的ITT選擇對(duì)目標(biāo)蛋白分離純化過(guò)程十分重要。若ELPs標(biāo)簽的ITT太高，加熱溫度過(guò)高容易影響目標(biāo)蛋白的穩(wěn)定性，導(dǎo)致其在高溫條件下發(fā)生變性。同時(shí)客體殘基的性質(zhì)也會(huì)對(duì)ITC技術(shù)中雜蛋白的產(chǎn)生量造成影響,疏水性太強(qiáng)的客體殘基ELPs標(biāo)簽產(chǎn)生更多的雜蛋白[2]。因此，應(yīng)優(yōu)先選擇在較溫和條件下就可進(jìn)行高效分離重組蛋白的短肽ELPs標(biāo)簽。表1為幾種已成功廣泛應(yīng)用于重組蛋白純化的ELPs標(biāo)簽。

表1 幾種已用于重組蛋白純化的ELPs標(biāo)簽

2 ELPs標(biāo)簽與靶蛋白的重組方式的優(yōu)化

ELPs在N-或C-末端與靶蛋白的融合基因水平使它們易于被開(kāi)發(fā)為廉價(jià)的實(shí)驗(yàn)室非色譜純化技術(shù)[14,27]。靶蛋白的融合點(diǎn)與ELPs融合蛋白的表達(dá)水平和表達(dá)活力有關(guān)系。ELPs標(biāo)簽在目標(biāo)蛋白的C端或N端沒(méi)有固定的模式可循，如果目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平很高，ELPs標(biāo)簽在N端可能會(huì)干擾目標(biāo)蛋白的正確折疊。在這種情況下，將ELPs標(biāo)簽設(shè)計(jì)到靶蛋白的C端可能更合適。如果目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平相對(duì)較低，ELPs標(biāo)簽設(shè)計(jì)在目標(biāo)蛋白的N端，從而增強(qiáng)靶蛋白的可溶性表達(dá)。它可能通過(guò)與未折疊的目標(biāo)蛋白形成疏水作用，防止蛋白質(zhì)聚集，促進(jìn)折疊，最終維持ELPs的空間構(gòu)象[28-29]。在優(yōu)化ITC的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)當(dāng)ELPs標(biāo)簽在目標(biāo)蛋白的C-末端融合時(shí)，其蛋白質(zhì)產(chǎn)量比在目標(biāo)蛋白的N-末端融合時(shí)高出約50%～90%[30]。

3 ELPs標(biāo)簽的切除

與其它純化標(biāo)簽類(lèi)似，ELPs標(biāo)簽需要在純化后從目標(biāo)蛋白中分離出來(lái)。最初通過(guò)在ELPs標(biāo)簽和特定靶蛋白之間設(shè)計(jì)蛋白酶切割位點(diǎn)來(lái)實(shí)現(xiàn)。相關(guān)實(shí)驗(yàn)表明，在融合蛋白中插入煙草蝕刻病毒(tobacco etch virus,TEV)或重組蛋白識(shí)別位點(diǎn)，在最終的純化步驟后利用蛋白酶來(lái)切斷酶識(shí)別位點(diǎn)，這一步驟將遵循附加溫度循環(huán)步驟，最終將ELPs標(biāo)簽從目標(biāo)蛋白中切除。盡管這一過(guò)程簡(jiǎn)單有效，但蛋白酶位點(diǎn)的殘留氨基酸仍留在目標(biāo)蛋白上，這可能導(dǎo)致免疫原性問(wèn)題或影響蛋白活性[31-33]。

內(nèi)含肽的發(fā)現(xiàn)給ELPs標(biāo)簽的切除提供了新思路。常用的內(nèi)含肽系統(tǒng)有兩種：一種是基因工程篩選的變異小分子內(nèi)含肽，利用特定pH值和溫度可以引發(fā)其C-末端發(fā)生快速的自身剪切反應(yīng)；另一種是天然小分子內(nèi)含肽，在反應(yīng)體系中加入硫醇后，在其N(xiāo)-末端可以發(fā)生自我剪切反應(yīng)。內(nèi)含肽系統(tǒng)大幅度地提高了ELPs標(biāo)簽特異性切除效率[26，34-35]。這兩種內(nèi)含肽系統(tǒng)通過(guò)滲透壓、pH值和溫度的變化或硫醇的加入，可以同時(shí)啟動(dòng)選擇性的可逆沉淀反應(yīng)和內(nèi)含肽自裂反應(yīng)[36]。與傳統(tǒng)的蛋白酶切ELPs標(biāo)簽方法相比，避免了酶切反應(yīng)過(guò)程緩慢和切除反應(yīng)后分離蛋白酶的過(guò)程，這不僅大幅度降低了分離純化成本，并且提高了重組蛋白的純化效率。但使用這種方法，需要評(píng)估pH值變化或硫醇添加對(duì)最終蛋白質(zhì)的物理、化學(xué)性質(zhì)產(chǎn)生的影響及其它任何可能性。

4 ELPs標(biāo)簽在純化重組蛋白中的應(yīng)用

4.1 簡(jiǎn)化蛋白質(zhì)的純化過(guò)程

融合標(biāo)簽技術(shù)的最初設(shè)計(jì)是依據(jù)目標(biāo)蛋白與純化基質(zhì)之間不發(fā)生任何直接的相互作用，來(lái)避免發(fā)生蛋白質(zhì)變性的可能性，最終用于純化重組蛋白[37-41]。現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室常用親和層析、離子交換層析、疏水層析等層析技術(shù)分離純化重組蛋白[42]。其中親和層析是最為高效的分離純化方法，其原理為偶聯(lián)特異親和配基吸附介質(zhì)、分離純化目標(biāo)蛋白[43]。 常用于親和層析的純化標(biāo)簽谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶蛋白、鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽、FLAG標(biāo)簽、S肽標(biāo)簽等雖然可以滿(mǎn)足大多數(shù)生物應(yīng)用需求，但都對(duì)融合蛋白展示了高的特異性,同時(shí)用于固定其配基蛋白的樹(shù)脂成本較高,而且結(jié)合能力較低，操作費(fèi)時(shí)，因此生產(chǎn)成本較高，并不適用于大規(guī)模生產(chǎn)。短肽ELPs純化標(biāo)簽與其它標(biāo)簽相比有很明顯優(yōu)勢(shì):其純化目標(biāo)蛋白采取ITC技術(shù)，利用ELPs融合的蛋白質(zhì)的可逆溶解度和可溶性-不溶性相變行為純化目標(biāo)蛋白。ITC技術(shù)不僅成本低，而且效率高，極大地簡(jiǎn)化了純化過(guò)程，所以ITC技術(shù)可應(yīng)用于較大規(guī)模生產(chǎn)純化重組蛋白。

4.2 提高重組蛋白的產(chǎn)量

由于外源蛋白對(duì)于宿主菌的異質(zhì)性,當(dāng)外源蛋白在宿主菌內(nèi)表達(dá)時(shí),宿主菌會(huì)產(chǎn)生保護(hù)性反應(yīng)，即調(diào)動(dòng)各種機(jī)制來(lái)阻止外源蛋白過(guò)量表達(dá)，導(dǎo)致目標(biāo)蛋白表達(dá)量降低[42]。相關(guān)實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)外源蛋白融合ELPs純化標(biāo)簽后,能有效提高重組蛋白的產(chǎn)量。到目前為止,ELPs純化標(biāo)簽通過(guò)ITC技術(shù)可應(yīng)用到不同宿主中進(jìn)行表達(dá)純化重組蛋白,見(jiàn)表2。

表2 在不同表達(dá)系統(tǒng)中的ELPs融合蛋白

ELPs融合蛋白經(jīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)修飾后形成雙層膜包被的蛋白體，從而避免了正常的生理降解。表達(dá)的ELPs融合蛋白會(huì)逐漸積累在細(xì)胞中，大大提高了目標(biāo)蛋白的表達(dá)量[50-51]。Meyer團(tuán)隊(duì)[8]利用His6 純化標(biāo)簽和不同分子量ELPs純化標(biāo)簽(9 kDa和36 kDa)純化硫氧還蛋白，其短肽ELPs純化標(biāo)簽的蛋白表達(dá)量[(137±21) mg·L-1]高于傳統(tǒng)His6純化標(biāo)簽的蛋白表達(dá)量[(93±13) mg·L-1]。

5 展望

ELPs具有可逆相變的性質(zhì)，溫度低于ITT時(shí)保持可溶性，溫度高于ITT時(shí)可逆地形成聚集體，并且與其它蛋白融合表達(dá)時(shí)，ELPs的可逆相變特性保持不變；同時(shí)由于ELPs來(lái)源于原彈性蛋白，因此具有生物相容性、無(wú)毒性和非免疫原性。ELPs的獨(dú)特性質(zhì)使其成為一類(lèi)理想的融合標(biāo)簽，可在蛋白質(zhì)純化等生物、醫(yī)學(xué)方面應(yīng)用。ELPs標(biāo)簽純化過(guò)程簡(jiǎn)單且經(jīng)濟(jì)，主要包括在ELPs的ITT上下循環(huán)蛋白質(zhì)，然后離心獲得目標(biāo)蛋白，無(wú)需進(jìn)行層析。但研究發(fā)現(xiàn)，pH值觸發(fā)的ITC技術(shù)似乎更簡(jiǎn)單、更有效，省略了加熱和冷卻循環(huán)，但在不同pH值環(huán)境下ELPs的重組蛋白有可能發(fā)生生理性溶解。此外，雖然已有大量的研究表明ELPs融合標(biāo)簽在蛋白質(zhì)純化中的有效性，并且短肽ELPs標(biāo)簽已被證明適用于在4～37.5 ℃的不同鹽中的蛋白質(zhì)生產(chǎn)和純化，但是目前該技術(shù)還沒(méi)有完全發(fā)展到可以大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用階段。關(guān)于ELPs標(biāo)簽是否會(huì)影響目標(biāo)蛋白的翻譯后修飾、產(chǎn)量和活性，及殘留氨基酸(在ELPs標(biāo)簽被切除后可能殘留)對(duì)靶蛋白活性和免疫原性的影響方面仍然需要進(jìn)一步研究。

綜上，盡管目前需要繼續(xù)評(píng)估ELPs標(biāo)簽對(duì)大規(guī)模蛋白質(zhì)純化時(shí)所用設(shè)備、體積和系統(tǒng)等方面的可擴(kuò)展性問(wèn)題，但是該技術(shù)在快速、低成本、大規(guī)模生產(chǎn)蛋白質(zhì)方面有巨大的應(yīng)用潛力?？偠灾?，ELPs標(biāo)簽將會(huì)在生產(chǎn)生物活性靶蛋白和大規(guī)模純化目標(biāo)蛋白方面有更廣泛的應(yīng)用，同時(shí)也為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)更低的材料成本和更簡(jiǎn)化的操作步驟提供了新思路。