徐陽純，許澤群，李栩欣，彭焱輝，王志強

(廣東省科學(xué)院測試分析研究所(中國廣州分析測試中心)，廣東省化學(xué)危害應(yīng)急檢測技術(shù)重點實驗室，廣東 廣州510070)

桃金娘(Rhodomyrtustomentosa)是桃金娘科、桃金娘屬植物，是一種常綠灌木，最高達2 m，主要生長于我國東西南部，南方各省皆有分布，喜生于低海拔的丘陵坡地，為酸性土指示植物，耐旱好光；國外主要分布于菲律賓、馬來西亞、印度尼西亞、印度、泰國、斯里蘭卡、日本等地[1-2]。桃金娘可用于水土保持、山坡復(fù)綠。桃金娘全株可入藥，據(jù)記載，根能活血、通絡(luò)，果能收斂、補虛，葉能祛風(fēng)、安神。

桃金娘果含黃酮類、酚類、氨基酸和糖類。單寧又稱多酚，是植物體內(nèi)的復(fù)雜酚類次生代謝產(chǎn)物，具有多元酚結(jié)構(gòu)[3-5]。目前，單寧的常用提取方法主要有浸提法、超聲波提取法、超臨界CO2萃取法、微波提取法、亞臨界水萃取法、半仿生提取法等[6-10]。其中浸提法具有操作簡單方便、成本低、無需特殊設(shè)備等特點，應(yīng)用較廣泛，但也存在耗時長、提取效果易受外界環(huán)境影響等問題；超聲波提取法是利用超聲波所產(chǎn)生的強烈振蕩空化效應(yīng)，使細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的植物組織破裂，通透性提高，加速了植物細(xì)胞中有效成分進入溶劑，提高提取率，該法具有耗時短、能耗低等特點。

作者通過水浴回流浸提的方式，在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken設(shè)計響應(yīng)面實驗優(yōu)化桃金娘果單寧的提取工藝，并采用磷鉬絡(luò)合物法評價桃金娘果單寧粗提液的抗氧化活性，為桃金娘果單寧的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

桃金娘果，減壓低溫烘干、粉碎、過80目篩。

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品(含量90.8%)，中國食品藥品檢定研究所；鎢酸鈉、鉬酸鈉、無水碳酸鈉、無水乙醇均為分析純；實驗用水為去離子水。

UV-2450型紫外可見分光光度計，日本島津公司；BSA224S型電子天平，Sartorius公司；高速多功能粉碎機，永康久品工貿(mào)有限公司；WBK-4B型電熱恒溫水浴鍋，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱、真空干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2 溶液的配制

1.2.1 顯色劑鎢酸鈉-鉬酸鈉混合溶液(Folin-Denis)的配制

稱取50.0 g鎢酸鈉、12.5 g鉬酸鈉置于燒杯中，用300 mL去離子水溶解，加入25 mL磷酸、50 mL鹽酸，混合均勻后回流2 h；再加入75.0 g硫酸鋁，滴加幾滴溴水后繼續(xù)加熱15 min；待溶液冷卻至室溫后，定容于500 mL容量瓶中，用中速定性濾紙過濾，濾液保存于棕色瓶中。測定時使用50%濃度溶液顯色。

1.2.2 穩(wěn)定劑碳酸鈉溶液的配制

稱取75.0 g無水碳酸鈉置于燒杯中，加入900 mL去離子水，用玻璃棒攪勻溶解，靜置，待溶液冷卻至室溫后，定容于1 000 mL容量瓶中。

1.2.3 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取適量沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，配制成濃度為1 000 μg·mL-1的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)母液；再吸取5.00 mL母液，稀釋并定容于100 mL容量瓶中，混勻，即得50 μg·mL-1沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3 桃金娘果單寧的提取

精密稱取適量桃金娘果，按一定料液比加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液。在一定水浴溫度下提取一定時間，進行兩次回流提取后，過濾，濾液定容于50 mL容量瓶中。吸取10.0 mL粗提液于4 000 r·min-1離心5 min，取上清液備用。

1.4 單寧提取率的測定

1.4.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別精密吸取0 mL、0.10 mL、0.25 mL、0.50 mL、0.75 mL、1.00 mL、1.50 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液置于10個比色管中；加入2.0 mL顯色劑Folin-Denis和2.0 mL穩(wěn)定劑碳酸鈉溶液，用去離子水定容至10 mL，搖勻，靜置1 h后，測定758 nm處吸光度，參比試劑作空白。以沒食子酸含量(c)為橫坐標(biāo)、吸光度(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合得線性回歸方程：A=0.0099c+0.0746，相關(guān)系數(shù)R2=0.9985。

1.4.2 單寧提取率的計算

精密吸取粗提液上清液于10 mL比色管中，按1.4.1方法測定758 nm處吸光度，計算單寧提取率。

1.5 提取工藝優(yōu)化

1.5.1 單因素實驗

采用單因素實驗，分別考察水浴溫度(40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃)、料液比(1∶10、1∶20、1∶40、1∶60、1∶80、1∶100，g∶mL，下同)、水浴時間(30 min、45 min、60 min、75 min、90 min、105 min、120 min)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(0%、20%、40%、60%、80%、100%)對單寧提取率的影響。

1.5.2 響應(yīng)面實驗

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，選取影響單寧提取率的4個因素料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、水浴時間、水浴溫度，采用Box-Behnken設(shè)計響應(yīng)面實驗，因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面實驗的因素與水平

1.6 抗氧化活性的測定

配制9種含量梯度(0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45，mg·mL-1)的桃金娘果單寧粗提液和陽性對照溶液(VC溶液和單寧酸溶液)。準(zhǔn)確移取各濃度溶液1.0 mL置于10 mL比色管中，分別加入2 mL 0.6 mol·L-1H2SO4溶液，搖勻后，繼續(xù)加入2 mL 3.5%(四水合)鉬酸銨溶液和2 mL 0.65 g·L-1磷酸三鈉溶液，定容至10 mL后，置于95 ℃水浴鍋中水浴1 h，取出冷卻，測定695 nm處吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 水浴溫度對單寧提取率的影響

以60%乙醇溶液為提取溶劑，在料液比為1∶60、水浴時間為1.5 h的條件下，考察水浴溫度對單寧提取率的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 水浴溫度對單寧提取率的影響Fig.1 Effect of water-bath temperature on extraction rate of tannin

由圖1可以看出，隨著水浴溫度的升高，分子間的熱運動加快，單寧提取率逐漸升高，當(dāng)水浴溫度為70 ℃時，單寧提取率達到最高；繼續(xù)升高水浴溫度，提取率稍有下降并趨于穩(wěn)定。這是因為，水浴溫度過高導(dǎo)致聚合單寧液化而失去活性[11-12]。因此，水浴溫度以70 ℃較為適宜。

2.1.2 料液比對單寧提取率的影響

以60%乙醇溶液為提取溶劑，在水浴溫度為70 ℃、水浴時間為1.5 h的條件下，考察料液比對單寧提取率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 料液比對單寧提取率的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of tannin

由圖2可以看出，隨著料液比的減小，即提取溶劑用量的增加，單寧提取率先逐漸升高后趨于穩(wěn)定。這是因為，料液比較大時，提取溶劑用量較少，桃金娘果中的單寧沒有充分溶解，仍有殘留，因而提取效果差；隨著提取溶劑用量的增加，料液之間的接觸面積增大，物料充分浸潤，桃金娘果中的單寧成分有利于擴散到溶劑中，當(dāng)料液比為1∶60時，溶劑與單寧的擴散已達到飽和狀態(tài)，單寧已完全溶出，繼續(xù)增加提取溶劑用量，單寧量也不會增加[13-16]。因此，料液比以1∶60較為適宜。

2.1.3 水浴時間對單寧提取率的影響

以60%乙醇溶液為提取溶劑，在料液比為1∶60、水浴溫度為70 ℃的條件下，考察水浴時間對單寧提取率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 水浴時間對單寧提取率的影響Fig.3 Effect of water-bath time on extraction rate of tannin

由圖3可以看出，隨著水浴時間的延長，桃金娘果單寧提取率先逐漸升高后趨于穩(wěn)定。這是因為，提取初期，有效成分濃度差大，隨著水浴時間的延長，單寧更容易析出，當(dāng)水浴時間為90 min時，溶劑中有效成分濃度差小，基本已達到飽和狀態(tài)，提取率保持穩(wěn)定。因此，水浴時間以90 min較為適宜。

2.1.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對單寧提取率的影響

在料液比為1∶60、水浴溫度為70 ℃、水浴時間為90 min的條件下，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)對單寧提取率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對單寧提取率的影響Fig.4 Effects of volume fraction of ethanol on extraction rate of tannin

由圖4可以看出，乙醇體積分?jǐn)?shù)對單寧提取率影響較大，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，單寧提取率先升高后降低，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時，單寧提取率達到最高。可能是因為，高體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液對單寧的溶解減弱[13-16]。因此，乙醇體積分?jǐn)?shù)以60%較為適宜。

2.2 響應(yīng)面實驗結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面實驗設(shè)計與結(jié)果(表2)

表2 響應(yīng)面實驗設(shè)計與結(jié)果

2.2.2 方差分析與顯著性檢驗

運用Design Expert軟件對表2數(shù)據(jù)進行擬合，得到二次多項回歸方程為：Y=2.19-0.024A-0.036B+0.029C-0.148D+0.073AB-0.033AC-0.017AD+0.058BC+0.023BD-0.037CD-0.18A2-0.19B2-0.16C2-0.16D2。

回歸模型的方差分析見表3，單寧提取率的殘差分布見圖5。

表3 方差分析

圖5 單寧提取率的殘差分布Fig.5 Residual distribution of extraction rate of tannin

由圖5可以看出，29個實驗點基本分布在一條直線上，表明各測得值之間相關(guān)性好，該模型可以很好地反映各因素與單寧提取率之間的真實關(guān)系，該回歸方程能夠?qū)憫?yīng)值進行預(yù)測分析[17-18]。

2.2.3 響應(yīng)面結(jié)果分析與優(yōu)化

各因素交互作用對單寧提取率影響的響應(yīng)面圖見圖6。

圖6 各因素交互作用對單寧提取率影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface map for effect of interaction between each factor on extraction rate of tannin

由圖6可以看出，響應(yīng)面實驗優(yōu)化得到的桃金娘果單寧的最佳提取工藝條件為：料液比1∶58.3(g∶mL)、乙醇體積分?jǐn)?shù)58.5%、水浴時間90.9 min、水浴溫度72.2 ℃，在此條件下，桃金娘果單寧預(yù)測提取率為2.20 g·(100 g)-1?？紤]實驗條件的可操作性，將最佳提取工藝條件調(diào)整為：料液比1∶58(g∶mL)、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、水浴時間90 min、水浴溫度72 ℃，在此條件下進行3次驗證實驗，得到桃金娘果單寧平均提取率為2.24 g·(100 g)-1，與預(yù)測理論值僅相差0.04%，說明響應(yīng)面法優(yōu)化得到桃金娘果單寧的最佳提取工藝條件可行、可靠、可信，可為桃金娘果單寧的開發(fā)利用提供借鑒。

2.3 抗氧化活性的測定

以VC和單寧酸為陽性對照，采用磷鉬絡(luò)合物法評價桃金娘果單寧粗提液的抗氧化活性，結(jié)果見圖7。

由圖7可以看出，桃金娘果單寧有一定的抗氧化活性，隨其濃度增加而逐漸增強，在濃度為0.4 mg·mL-1時，單寧粗提液的抗氧化活性分別是VC溶液、單寧酸溶液的23%、31%。分別以桃金娘果單寧粗提液、VC溶液和單寧酸溶液的濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)，擬合得回歸方程分別為y=0.0060+0.7587x(R2=0.9974)、y=-0.1397+3.7813x(R2=0.9941)、y=0.0763+2.2410x(R2=0.9951)。表明在一定濃度范圍內(nèi)，桃金娘果單寧的抗氧化活性與濃度之間存在著較好的效量關(guān)系，在0.2～0.45 mg·mL-1范圍內(nèi)，抗氧化活性大小依次為:VC溶液>單寧酸溶液>桃金娘果單寧粗提液。

圖7 不同濃度試樣的抗氧化活性Fig.7 Antioxidant activity of samples with different concentrations

3 結(jié)論

以單寧提取率為評價指標(biāo)，在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化桃金娘果單寧的提取工藝，并采用磷鉬絡(luò)合物法評價桃金娘果單寧粗提液的抗氧化活性。結(jié)果表明，桃金娘果單寧的最佳提取工藝條件為：料液比1∶58(g∶mL)、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、水浴時間90 min、水浴溫度72 ℃，在此條件下，桃金娘果單寧提取率為2.24 g·(100 g)-1。桃金娘果單寧具有一定的抗氧化活性，并呈劑量依賴性，可作為天然的抗氧化劑應(yīng)用于食品行業(yè)中。