任迎虹，祁偉亮，陳 潔

(成都師范學(xué)院 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都 611130)

桑樹(Mulberry)屬于重要的經(jīng)濟(jì)植物[1]，葉片互生、葉緣有鋸齒、花雌雄同株或異株。?？乒布s53屬，1400余種，我國是目前世界上桑樹資源分布最多的國家。最初的植物學(xué)分類依據(jù)主要是形態(tài)學(xué)，如瑞典植物分類學(xué)家林奈將桑屬植物分為7個種[2]。1842年Moretti將桑屬分為10個種[3]。1873年法國植物分類學(xué)家Bureau根據(jù)桑葉和雌花特征進(jìn)一步劃分為19個變種以及12個亞變種[4]。后期夏明炯在1991年發(fā)表的《桑樹分類概述》一文中指出我國桑樹分為15個桑種和4個變種，是世界上桑種分布最多的國家[5]。桑樹作為家蠶的飼料經(jīng)過了上千年的栽培和雜交，在形態(tài)上發(fā)生了很多變異，形成了許多種和變種，因此單純依靠形態(tài)學(xué)依據(jù)的分類顯然可信性不高。

隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，分類學(xué)家開始在分子水平上尋找分類依據(jù)。在被子植物基因組中，ITS(Internal trnscribed spacer)基因序列具有長度變異小、非常保守等特性，適合用于低分類群的系統(tǒng)發(fā)育分析。史全良和趙衛(wèi)國[6]以蒙桑(M.mongolica)為材料采用PCR產(chǎn)物直接測序法，測定了核糖體基因轉(zhuǎn)錄內(nèi)間隔區(qū)序列，指出ITS序列在桑樹分子系統(tǒng)學(xué)研究的潛在重要性。2012年，Nepal和Ferguson[7]采用ITS和trnL-trnF將全球的桑屬分為13個種，并強調(diào)桑屬可能不是單源進(jìn)化，分為北美和亞洲兩個亞屬。

本研究旨在對10份收集的桑樹資源進(jìn)行ITS序列分析，結(jié)合形態(tài)學(xué)調(diào)查和相關(guān)指標(biāo)，從分子學(xué)和形態(tài)學(xué)角度闡明10個野外收集的桑樹資源和已知桑屬的親緣關(guān)系，這對于桑種質(zhì)的指紋鑒別、親緣關(guān)系分析、育種親本選擇以及桑的分子育種等技術(shù)問題均具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗材料主要收集于涼山州各主要蠶種場。由于地方蠶桑種植戶對于引進(jìn)的品種或者部分栽培品種信息不能準(zhǔn)確描述，故將收集的10份桑種質(zhì)資源以嫁接苗的形式，繁種于成都師范學(xué)院桑樹資源圃，以編號形式暫命名為1，R-2016JLJ-1；2，R-2016HYB1-2；3，R-2016XYJL-2；4，湖桑32(已知品種)；5，R-2016HYB2-2；6，R-2016KJ-1；7，R-2016LH-2；8，R-2016BL-2；9，R-2016SM-3；10，R-2016CS2-2。

1.2 DNA提取及PCR產(chǎn)物擴(kuò)增

每個樣品取2～3片嫩葉，采用CTAB法[8]提取桑樹基因組DNA。PCR擴(kuò)增20 uL反應(yīng)體系中，包含Tag mix(10 uL)、ddH2O(7 uL)、DNA(1 uL)、引物ITS-F(ITS 5)(5'- GGAAGTAA AAGTCGTA ACAAGG-3')1 uL、引物ITS-R(ITS 4)(5'-TCCTC CGCTTATTG ATATGC-3')1 uL(購自上海生工生物工程有限公司)。

擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共38個循環(huán)，再72℃保溫延伸10 min，12℃條件下保存。PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳，電壓為120 V(穩(wěn)壓)，電泳約10 min，溴化乙錠(Ethidium bromide，EB)染色5 min，在凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄[9]。

1.3 序列數(shù)據(jù)處理

測序結(jié)果用SeqMan5.01軟件轉(zhuǎn)換，對少數(shù)誤判堿基，根據(jù)堿基峰形更正。用MEGA7.0.14軟件進(jìn)行裁剪比對，除去兩端非ITS序列部分。根據(jù)GenBank Blast檢索得到親緣關(guān)系相近的白桑(M.alba，XNS0052)、魯桑(M.multicaulis，AM042003)、雞桑(M.australis，XNSK0024)和山桑(M.bombycis，XNS0277)4份桑屬ITS序列，與本試驗的10份ITS序列一起，利用MEGA7.0.14軟件進(jìn)行序列長度、G + C含量對比分析，單獨分析變異位點和計算遺傳距離。根據(jù)GenBank上檢索到的暹羅桑(M.rotundiloba，AY345150)、蒙桑(M.mongolica，AY345158)、貴14號長穗桑(M.wittiorum，AY345155)、北美默里桑(M.murrayana，F(xiàn)J605515)、新疆黑桑(M.nigra，XNS0218)5份桑屬ITS序列和Blast得到的4份ITS序列與本試驗桑種質(zhì)材料ITS序列一起，構(gòu)樹(Broussonetiapapyrifera，XNS0377)、冠毛榕(Ficusgasparriniana，JQ773883)和柘樹(Macluratricuspidata，XNS0007)作為外類群(Outgroup)，通過MEGA7.0.14軟件采用最大簡約法(Maximum)分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 形態(tài)特征調(diào)查

本次共調(diào)查10份桑樹資源的農(nóng)藝形狀，參照《桑樹種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》[10]，包括描述性狀，如葉形、側(cè)枝、葉色、葉尖、葉緣等，以及數(shù)量性狀，如葉寬、葉長、葉柄長、葉柄寬等，每個植株隨機(jī)抽樣9根枝條并利用數(shù)據(jù)處理軟件Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。最后結(jié)合ITS數(shù)據(jù)分析結(jié)果，并參考中國高等植物圖鑒[11]、中國桑樹品種志[12]、中國數(shù)字植物標(biāo)本館(中國植物智 http://www.iplant.cn/)進(jìn)行資源鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 ITS序列長度及堿基比例

對10份材料進(jìn)行凝膠電泳，圖像大致在700 bp左右(圖1)，根據(jù)來自Genbank的魯桑種(AM042003)的18S rRNA基因3′端、26S rRNA基因5′端、5.8S rDNA基因堿基序列，確定本試驗各材料的ITS1、5.8S、ITS2序列范圍[13-15]。

圖1 引物ITS4/ITS5對10份桑樹種質(zhì)材料ITS 基因組DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳譜圖Fig. 1 ITS4/ITS5 10 parts of mulberry germplasm material ITS Genomic DNA PCR products electrophoresis spectrum

軟件分析顯示，桑樹ITS序列(包含5.8S rDNA)全長為576～578 bp，G+C含量為59.17%～59.97%(見表1)，其中5.8S rDNA編碼區(qū)極為保守，在所有測得以及對照的序列中，長度均為100 bp，且G+C含量都為48.00%；而ITS1和ITS2序列表現(xiàn)出差異性，長度分別為174～175 bp和302～303 bp，G+C含量分別為60.00%～62.07%和62.38%～62.71%。其中R-2016SM-3的ITS1、ITS2的長度分別為174 bp、303 bp，G+C的含量分別為62.07%、62.71%，與雞桑一致，推測R-2016SM-3可能屬于雞桑(M.australis)。此外，R-2016HYB2-2、R-2016LH-2、R-2016BL-2和R-2016CS2-2都存在不同程度的變異。剩下的R-2016JLJ-1、R-2016HYB1-2、R-2016XYJL-2、湖桑32以及R-2016KJ-1的ITS序列長度及G+C含量與白桑相同，推測他們可能屬于白桑(M.alba)。

表1 桑屬種質(zhì)資源ITS序列長度、G + C含量變異Table 1 The length of ITS sequences and contents of G + C in Morus

2.2 ITS序列遺傳距離及變異位點分析

利用MEGA7.0.14軟件采用Kimura 2-parameter model方法分析了10份桑種質(zhì)材料的ITS序列的遺傳距離(Genetic distance)(表2)。10份桑種質(zhì)材料的遺傳距離為0.000～0.102。R-2016JLJ-1、R-2016XYJL-2、湖桑32、R-2016HYB2-2、R-2016KJ-1和R-2016LH-2的遺傳距離最近(0.000)，表明其親緣關(guān)系最近；R-2016HYB1-2與R-2016BL-2的遺傳距離最遠(yuǎn)(0.102)，表明其親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

通過ITS序列堿基—長度、G+C的含量變化及遺傳距離分析，排除相似性高的材料，本研究單獨對R-2016HYB1-2、R-2016HYB2-2、R-2016LH-2、R-2016BL-2、R-2016SM-3以及R-2016CS2-2進(jìn)行ITS序列變異位點(Variable sites)對比分析(表3)。采用王潔等[16]的方法，可以發(fā)現(xiàn)這6個材料共有60個變異位點，變異位點集中在ITS1與ITS2區(qū)，其中ITS1區(qū)最多，R-2016BL-2在ITS1區(qū)域變異位點最多(50個)，變異類型有A-C、A-G、A-T、T-G、C-T、G-C等。ITS1區(qū)有52個變異位點，其中簡約信息位點(Parsimony informative site)占21個，分別占ITS1序列平均長度(175 bp)的29.71%和12.00%。ITS2區(qū)有8個變異位點，其中簡約信息位點占1個，分別占ITS2序列平均長度(303 bp)的2.31%和0.33%，表明ITS1序列所包含的信息含量明顯高于ITS2序列。

表2 15份桑屬ITS序列遺傳距離及相似性Table 2 Genetic distances and percent identities of 15 mulberry germplasm materials based on ITS

2.3 ITS序列親緣關(guān)系分析

加上GenBank上的白桑(M.alba，XNS0052)等9份外源桑屬材料，用構(gòu)樹(B.papyrifera，XNS0377)等3份材料作為外類群，最大簡約(MP)法聚類分析結(jié)果顯示，分支圖顯示樹長為378，一致性指數(shù)(Consistency index，CI)為0.8862，趨同性指數(shù)(Homoplasy index，HI)= 0.1138，保持性指數(shù)(Retention index，RI)為0.7529，調(diào)整后一致性指數(shù)(Rescaled consistency index，RC)為0.6672。對比序列共計580個位點(含Gap)，其中有517個不變位點，38個變異非信息位點，22個簡約信息位點。

表3 ITS基因序列比較Table 3 Comparison of ITS gene sequences

續(xù)表3 ITS基因序列比較Table 3 Comparison of ITS gene sequences

從聚類結(jié)果來看，系統(tǒng)發(fā)育樹首先將柘樹、冠毛榕分出，自舉檢驗(Bootstrap)支持率為99%?？梢悦黠@看出，在桑科植物的構(gòu)屬、柘屬和榕屬中，構(gòu)屬和桑屬親緣關(guān)系最近。R-2016SM-3與雞桑單獨聚在一起，其自舉檢驗支持率為77%，推測R-2016SM-3屬于雞桑(M.australis)。R-2016BL-2和R-2016CS2-2聚在一起，與蒙桑的自檢支持率為96%，推測R-2016BL-2和R-2016CS2-2屬于蒙桑(M.mongolica)，為蒙桑的一個變種。R-2016HYB1-2與暹羅桑單獨聚為一小支，自檢支持率為86%，推測R-2016HYB1-2屬于暹羅桑(M.rotundiloba)。剩下的R-2016HYB2-2、R-2016KJ-1、R-2016JLJ-1、湖桑32、R-2016LH-2和R-2016XYJL-2與白桑和魯桑聚在一起，由于魯桑也是白桑的一個變種，表明它們屬于白桑(M.alba)(圖2)。

3 結(jié)論

中國是桑屬植物集中分布和分化中心，又是桑屬植物的遺傳多樣性中心，許多桑種起源于我國，如蒙桑(M.mongolica)，雞桑(M.australis)，滇桑(M.yunnanensts)，白桑(M.alba)，山桑(M.bombycis)等。桑屬由林奈[2]建立之后，先后有許多學(xué)者在分子學(xué)方面對桑屬的系統(tǒng)分類進(jìn)行了研究[17-20]。陳仁芳[21]采用MP法對桑ITS序列進(jìn)行聚類分析，結(jié)果表明桑樹進(jìn)化的順序依次為：新疆黑桑、北美默里?！咨?、暹羅桑(AM042005)、瑞穗桑、廣東桑、雞桑、魯桑(AM041999)、蒙桑、山?！A桑、奶桑、川?！ㄩL穗桑、咸豐長穗桑；73份桑資源只有33份材料有不同程度的變異，同源性高達(dá)93.1%～100%。本研究ITS進(jìn)化分析結(jié)果，首先將桑樹近緣屬植物柘樹、冠毛榕和構(gòu)樹分開，同時將黑桑、北美默里桑獨立出一支，這一結(jié)果與陳仁芳研究結(jié)果吻合，表明試驗分析結(jié)果可靠。吳征鎰等[22]研究報道，白桑(M.alba)在早期系統(tǒng)演化上是最大的一個干支，也是現(xiàn)存數(shù)量最多一類桑種，其中魯桑(M.multicaulis)屬于白桑的變種[23]。本研究中R-2016HYB2-2、R-2016KJ-1、R-2016 JLJ-1、湖桑32、R-2016LH-2和R-2016XYJL-2與白桑和魯桑聚在一起，10份桑樹資源多以白桑為主，這也證明了吳征鎰的觀點，同時鑒定出1份雞桑、2份蒙桑和1份暹羅桑。

為了更準(zhǔn)確的評價系統(tǒng)歸類結(jié)果的可靠性，本研究參考《中國植物志》等資源對收集的10個桑樹資源進(jìn)行了形態(tài)特征及相關(guān)數(shù)量結(jié)果統(tǒng)計(表4)，結(jié)果表明10個桑樹資源的形態(tài)特征存在差異性和相似性。R-2016BL-2和R-2016CS2-2與蒙桑(M.mongolica)親緣關(guān)系較近，且R-2016BL-2(圖3g)和R-2016CS2-2(圖3h)的葉形為裂葉形、表面光滑，葉長分別為9.20 cm、12.90 cm，葉寬分別為8.80 cm、10.20 cm，葉柄長分別為2.43 cm、2.63 cm，尖端尾尖，葉緣單鋸齒形，形態(tài)學(xué)特征[11,24]與裂葉蒙桑的相似度高(圖3m)，該結(jié)果表明R-2016BL-2和R-2016CS2-2屬于蒙桑(M.mongolica)。R-2016SM-3(圖3j)與雞桑(圖3l)單獨聚在一起，且葉形態(tài)特征符合雞桑(M.australis)的生物學(xué)特征描述[25]，因此鑒定R-2016SM-3為雞桑。據(jù)《中國桑樹品種志》介紹，四川在1982年桑樹品種譜查中還發(fā)現(xiàn)蜀雅桑、雅中里、插桑、雅周桑、蜀名桑等扦插易生根的雞桑[12]，這也證實四川地區(qū)的確存在雞桑。

圖2 22份桑種質(zhì)材料基于ITS的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 2 A phylogenetic tree of 22 mulberry germplasm materials based on ITS

白桑不僅分布廣泛、且遺傳背景變異多，這也形成很多變種，如魯桑(M.multicaulis-俗名女桑、湖桑、白桑)、泰國的暹羅桑(M.rotunbiloba)等[21,26]。R-2016HYB2-2(圖3a)、R-2016KJ-1(圖3b)、R-2016JLJ-1(圖3c)、湖桑32(圖3d)、R-2016LH-2(圖3e)和R-2016XYJL-2(圖3f)的葉長在9.60～14.55 cm，葉寬在6.50～10.00 cm，葉柄長在2.43～4.77 cm，葉均為卵形、表面光滑、鮮綠色，葉形態(tài)特征符合魯桑的生物學(xué)特征描述(圖3k)。因此，鑒定R-2016HYB2-2、R-2016KJ-1、R-2016JLJ-1、湖桑32、R-2016LH-2和R-2016XYJL-2屬于白桑類。R-2016HYB1-2與暹羅桑單獨聚為一小支，該品種應(yīng)該屬于國外引進(jìn)品種。

4 討論

很多科研工作者對桑屬的分類和系統(tǒng)進(jìn)化工作做了大量的研究。1995年，向仲懷首次采用RAPD技術(shù)構(gòu)建了9個桑品種的DNA指紋圖譜[17]。隨后，許多子標(biāo)記技術(shù)如ISSR、SSR和ITS等相繼應(yīng)用到桑樹系統(tǒng)學(xué)分類研究工作中[27]。如Vijayan等[28]利用形態(tài)解剖和ISSR 分子標(biāo)記技術(shù)鑒定了17種野生桑樹資源的遺傳多樣性。2006年，印度人完成了首個桑樹品種的葉綠體全基因組測序[29]，同年，Venkateswarlu等[30]利用ISSR、RAPD和SSR 三種分子標(biāo)記繪制了印度桑K2的遺傳圖譜，該研究為桑樹近緣種屬分類提供了重要的參考。2012年，Nepal首次采用ITS和trnL-trnF將全球的桑屬分為13個種，研究發(fā)現(xiàn)?？赡懿皇菃卧催M(jìn)化，分為北美和亞洲兩個亞屬[7]。曾其偉等[31]利用ITS序列對桑屬做了較為系統(tǒng)的分析，提出白桑是最大的一種且種質(zhì)資源多，但因白桑資源形態(tài)多樣，將他們歸為一個大種存在爭議[32]。在本研究中，也發(fā)現(xiàn)超過一半的桑品種屬于白桑。因此，下一步將采用ITS與trnL-trnF進(jìn)行多片段聯(lián)合分析，同時綜合細(xì)胞學(xué)研究、解剖學(xué)等[33]，進(jìn)行桑樹品種的親緣關(guān)系分析，并為桑樹的資源選擇和雜交育種提供依據(jù)。

圖3 10份種質(zhì)資源的形態(tài)圖和標(biāo)本圖Fig. 3 Morphological maps and specimen figures of 10 mulberry 注：a，R-2016HYB2-2；b，R-2016KJ-1；c，R-2016JLJ-1；d，湖桑32；e，R-2016LH-2；f，R-2016XYJL-2；g，R-2016BL-2；h，R-2016CS2-2；i，R-2016HYB1-2；j，R-2016SM-3；k，魯桑標(biāo)本，中國植物智條碼SZG0Q005128；l，雞桑標(biāo)本，中國植物智條碼CSH0090591；m，蒙桑標(biāo)本，中國植物智條碼QFNU0018312

表4 10份桑樹種質(zhì)資源形態(tài)數(shù)據(jù)調(diào)查Table 4 Survey of morphological data of 10 mulberry germplasm resources