陳海元　朱曉妹　張所兵　張云輝　方先文

摘要： 通過甲基磺酸乙酯（EMS）誘變，獲得了1個可以穩(wěn)定遺傳的水稻斑馬葉突變體zebra2-2。與野生型相比，突變體從苗期開始表現(xiàn)出黃綠相間的斑馬葉表型，而且不同葉位葉片的表型存在差異，新葉較老葉的表型更加明顯。30 ℃條件下可恢復(fù)為綠-淡黃相間表型。此外，突變體的抽穗期延遲，株高、穗長、每穗粒數(shù)和籽粒大小均顯著降低。遺傳分析結(jié)果表明，突變體的突變表型受1對隱性基因控制。圖位克隆結(jié)果表明，突變體ZEBRA2基因的第3 342位堿基由G突變?yōu)锳，使得編碼的氨基酸由甘氨酸突變成天冬氨酸，導(dǎo)致突變體呈現(xiàn)斑馬葉表型。

關(guān)鍵詞： 水稻;斑馬葉;遺傳分析;基因定位

中圖分類號： S511.035.2 文獻標識碼： A 文章編號： 1000-4440（2021）01-0001-07

Genetic analysis and gene mapping of a zebra leaf mutant in rice

CHEN Hai-yuan， ZHU Xiao-mei， ZHANG Suo-bing， ZHANG Yun-hui， FANG Xian-wen

（Institute of Germplasm Resources and Biotechnology， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014， China）

Abstract： A zebra leaf mutant zebra2-2 with stable inheritance was identified through ethyl methanesulfonate （EMS） mutagenesis. Compared with the wild type， the mutant displayed yellow and green zebra leaf phenotype since seeding stage， and leaves at different positions showed variable mutant phenotypes， new leaves showed more significant zebra leaf phenotype than the older leaves. Seedlings at 30 ℃ could recover the yellow and green zebra leaf phenotype. In addition， the heading date of mutant was delayed， and the plant height， panicle length， spikelet number per panicle and kernel size were significantly reduced. Genetic analysis demonstrated that the mutant phenotype was controlled by a single recessive nuclear gene. Map-based cloning results revealed that a single base G to A substitution at the 3 342 position from ATG start codon， caused a Gly-to-Asp substitution of ZEBRA2 gene in zebra2-2， which resulting in the zebra leaf phenotype of zebra2-2.

Key words： rice;zebra leaf;genetic analysis;gene mapping

類胡蘿卜素在植物中具有多種功能[1]。除了作為光系統(tǒng)中的捕光色素外，類胡蘿卜素還能保護光合元件免受活性氧（ROS）的傷害[2-3]。類胡蘿卜素還是合成脫落酸（ABA）的前體物質(zhì)，ABA是植物中一類重要的激素，調(diào)節(jié)植物種子成熟及萌發(fā)和對外界脅迫的響應(yīng)[4]。因此類胡蘿卜素合成的缺陷可能會導(dǎo)致ABA的缺失，引起種子不休眠或者提前發(fā)芽的表型[5-7]。類胡蘿卜素異構(gòu)酶（CRTISO）是類胡蘿卜素生物合成過程中的關(guān)鍵酶[8-9]。綠色組織中，其活性可被光照（比如光異構(gòu)化）部分替代[10-11]。擬南芥CRTISO突變體ccr2的光形態(tài)建成中，由于前片層體的缺失導(dǎo)致葉綠素積累的延遲[12]。

根據(jù)肉眼可見的表型，葉色突變體可被分為淡綠葉（Virescent）、條紋（Stripe）、白化（Albino）、黃葉（Yellow）和斑馬葉（Zebra）等類型。其中virescent1- virescent3突變體是溫敏型葉色突變體[13-15]。LCM6-LCM8突變體對溫度不敏感[16]。斑馬葉突變體因葉片上黃綠（或黃白）相間的表型而得名，水稻、玉米和高粱等單子葉植物中已經(jīng)鑒定出了很多斑馬葉突變體[17-20]。斑馬葉的表型很大程度上依賴于溫度、光照以及發(fā)育時期等環(huán)境因子[19-20]。水稻、玉米和狼尾草（Pearl millet）中一些斑馬葉突變體只在發(fā)育的早期出現(xiàn)，隨后逐漸消失[19-20]。水稻斑馬葉突變體1103s對溫度敏感，只有在高溫（30 ℃）-低溫（20.0～23.1 ℃）-高溫（26 ℃或更高）的溫度循環(huán)誘導(dǎo)下才表現(xiàn)出斑馬葉的表型[21]。水稻zebra-necrosis（zn）突變體在光照/黑暗或高溫/低溫改變條件下，葉片不同部位葉綠體的形成受到不平衡損傷，導(dǎo)致斑馬葉表型的出現(xiàn)[22]。目前水稻中鑒定的16個非等位斑馬葉突變體中，ZEBRA-NECROSIS （ZN）、β-OsLCY、ZEBRA2和ZL16 4個基因已經(jīng)被克隆[22-28]。ZN基因編碼類囊體綁定蛋白，參與類囊體蛋白復(fù)合體的組裝，保護正在發(fā)育的葉綠體[22]。β-OsLCY基因編碼番茄紅素β-環(huán)化酶，可能通過保護葉綠體免受光氧化損傷維持葉綠體的發(fā)育[23-24]。ZEBRA2基因編碼類胡蘿卜素異構(gòu)酶，參與水稻的光保護[23，25-27]。ZL16 編碼一個羥酰ACP脫水酶，參與脂肪酸的從頭合成[28]。

本研究對一個通過甲基磺酸乙酯（EMS）誘變獲得的水稻斑馬葉突變體，從表型、遺傳等方面明確其遺傳特性，并對突變基因進行定位、測序與突變位點分析。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

通過EMS誘變粳稻品種南粳46，獲得了1份水稻斑馬葉突變體zebra2-2。經(jīng)過多代自交后，zebra2-2突變體斑馬葉的性狀穩(wěn)定遺傳。

1.2 葉綠素含量測定

于抽穗期取野生型（WT）和突變體的劍葉、倒二葉和倒三葉葉片各0.2 g，浸于2 ml 80%丙酮中，室溫避光浸提24 h，期間多次混勻。浸提液于5 000 r/min離心10 min，用分光光度計分別測定上清液在663 nm、645 nm和470 nm處的吸光值。參照Lichtenthaler[29]的方法， 測定和計算葉片單位質(zhì)量葉綠素a （Chl.a）、葉綠素b （Chl.b）和類胡蘿卜素（Car）的含量。

1.3 溫度敏感性試驗

野生型和突變體種子于32 ℃ 條件下催芽2 d，將萌發(fā)的種子分別播種于22 ℃和30 ℃的光照培養(yǎng)箱中（14 h光照/10 h黑暗），光照度為180 μmol/（m2·s）。每隔1 d觀察幼苗葉片表型的變化。

1.4 農(nóng)藝性狀考察

2018年5月中旬，將野生型和zebra2-2播種，1個月后移栽于大田，期間考察苗期性狀。正常水肥條件下生長至黃熟期，隨機選取野生型和zebra2-2突變體各10株，考察株高、分蘗數(shù)、劍葉長寬、一次枝梗數(shù)、二次枝梗數(shù)、每穗粒數(shù)、結(jié)實率、粒長、粒寬和粒厚等農(nóng)藝性狀。

1.5 遺傳分析與基因定位

2017年在南京試點正季以zebra2-2突變體為母本，分別與野生型、粳稻品種中花11（ZH11）和秈稻品種Dular雜交獲得F1代種子。隨后在海南試點加代繁殖，獲得用于遺傳分析和基因定位的F2群體的種子，F(xiàn)2群體于2018年南京正季種植。統(tǒng)計zebra2-2與野生型、ZH11及Dular雜交構(gòu)建的F2群體斑馬葉植株和葉片正常植株的比率，并用卡方測驗分析統(tǒng)計結(jié)果。在zebra2-2與Dualr雜交構(gòu)建的F2群體中，篩選隱性極端個體545個，用于連鎖分析與基因定位。首先選取10個極端個體，用均勻分布在水稻12條染色體上的zebra2-2和Dular之間多態(tài)性好的SSR標記進行連鎖分析，對突變基因進行初定位。在初定位區(qū)間內(nèi)，尋找其他有多態(tài)的SSR或者InDel標記，分析其他極端個體，完成突變基因的定位。

1.6 突變基因的鑒定與驗證

通過水稻基因組注釋計劃（Rice Genome Annotation Project， https：//rapdb.dna.affrc.go.jp）對定位區(qū)間內(nèi)的基因進行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)區(qū)間內(nèi)存在一個已經(jīng)報道的葉片發(fā)育相關(guān)基因ZEBRA2。對zebra2-2突變體進行ZEBRA2基因的基因組（包含啟動子和基因編碼區(qū)）測序，與野生型序列比對，并在定位群體中隨機挑選10個隱性極端個體對突變位點進行驗證。

2 結(jié)果與分析

2.1 zebra2-2突變體的表型分析

與野生型相比，zebra2-2突變體葉片從苗期開始就表現(xiàn)出黃綠相間的斑馬葉表型，新葉較老葉表型更加明顯（圖1A）。發(fā)育至抽穗期時，突變體的劍葉依然表現(xiàn)出明顯的斑馬葉表型，而老葉的表型部分恢復(fù)，最終呈現(xiàn)出淡黃葉的表型（圖1B、圖1C）。對抽穗期時不同葉位葉片的葉綠素含量進行測定，發(fā)現(xiàn)突變體劍葉、倒二葉和倒三葉的葉綠素a和葉綠素b的含量均比野生型顯著降低，而且葉綠素a/葉綠素b的比值也顯著下降;突變體劍葉（倒一葉）、倒二葉和倒三葉的葉綠素含量逐漸升高，表明后發(fā)育葉片的葉綠素合成逐漸恢復(fù)（圖2）。

2.2 zebra2-2突變體的低溫敏感性

對野生型和突變體進行不同溫度處理。zebra2-2突變體在22 ℃條件下生長14 d后，葉片呈現(xiàn)出黃-淡黃相間的表型;而30℃條件下生長14 d后，突變體的葉片呈現(xiàn)出綠-淡黃相間的表型，與野生型的差異已經(jīng)不明顯（圖3）。以上結(jié)果表明zebra2-2苗期斑馬葉表型與生長溫度密切相關(guān)，對低溫更加敏感。

2.3 野生型和zebra2-2突變體農(nóng)藝性狀的比較

突變體的抽穗期比野生型顯著延遲，成熟期時突變體的株高較野生型也顯著降低（圖1B）。為了進一步分析突變體株高降低的原因，我們對野生型和突變體各個節(jié)間的長度進行了測量，發(fā)現(xiàn)突變體倒1和倒2節(jié)間長度比野生型顯著降低，倒3和倒4節(jié)間沒有顯著差異，倒5和倒6節(jié)間增加（圖4）。

此外，我們對野生型和突變體的其他農(nóng)藝性狀進行比較，發(fā)現(xiàn)突變體的劍葉長、劍葉寬、每穗粒數(shù)、一次枝梗數(shù)、二次枝梗數(shù)、粒寬較野生型均顯著下降，而有效穗數(shù)、結(jié)實率和粒長沒有顯著差異（圖5）。

2.4 zebra2-2突變體的遺傳分析

將zebra2-2分別與野生型、粳稻品種ZH11和秈稻品種Dular雜交，其F1的葉片發(fā)育正常。zebra2-2/WT、zebra2-2/ZH11和zebra2-2/Dular的F2群體中，正常植株與斑馬葉植株的比例符合3∶1的分離比（表1），表明斑馬葉的表型受1對隱性基因控制。

2.5 zebra2-2突變基因連鎖分析與基因定位

用zebra2-2和Dular作為DNA模板，用463對SSR引物進行多態(tài)性分析，得到155對多態(tài)性較好的引物，多態(tài)性頻率為33.48%。用這些引物對zebra2-2/Dular F2群體中隨機挑選的10個與突變體表型相似的極端個體進行連鎖分析，發(fā)現(xiàn)突變基因與水稻第11染色體長臂上的2個分子標記RM1355和RM27154緊密連鎖。根據(jù)已經(jīng)公布的日本晴和9311的DNA序列，在此區(qū)間內(nèi)又開發(fā)了3個多態(tài)性好的標記RM26938、RM206和RM26998（表2）。利用這些標記對zebra2-2/Dular F2群體中的576個極端個體進行分析，最終將突變基因限定在分子標記RM26938和RM206之間，物理距離約為1 421 kb（圖6）。

2.6 zebra2-2突變體的候選基因分析

對定位區(qū)間內(nèi)的基因進行分析，發(fā)現(xiàn)ZEBRA2基因的突變表型與zebra2-2相似，因此對zebra2-2突變體中的ZEBRA2基因進行測序。結(jié)果顯示，突變體中ZEBRA2基因的第3 342位堿基由G突變?yōu)锳，使得編碼的氨基酸由甘氨酸突變成天冬氨酸。從zebra2-2/Dular F2群體中隨機挑選的10個極端個體進行混池測序，結(jié)果表明10個極端個體的ZEBRA2基因具有與zebra2-2相同的突變位點，表明zebra2-2中突變基因與ZEBRA2是一對等位基因。

3 討論

有研究者在篩選穗發(fā)芽突變體時發(fā)現(xiàn)OsCRTISO/ZEBRA2對穗發(fā)芽和葉片發(fā)育都具有重要作用，ZEBRA2突變體中ABA 含量顯著減少，而ROS顯著增加，葉片表現(xiàn)出斑馬葉的表型[23]。ZEBRA2是催化順式番茄紅素轉(zhuǎn)化為全反式番茄紅素的關(guān)鍵酶，主要在光合作用活躍的成熟葉片葉肉細胞中表達，ZEBRA2（z2）突變體在高光照度下表現(xiàn)出更明顯的斑馬葉表型，表明突變體斑馬葉的表型可能與光氧化損傷有關(guān)[25]。z2突變體的突變表型在持續(xù)光照條件下被完全抑制，光合色素含量和葉綠體的發(fā)育都恢復(fù)正常，而短日照條件下（10 h 光照/14 h 黑暗）z2突變體的活性氧積累顯著增加，持續(xù)光照條件下與野生型相當(dāng)[26]。此外，持續(xù)光照和短日照條件下，z2突變體的2種類胡蘿卜素Utein 和 Zeaxanthin含量都顯著下降，表明這2種類胡蘿卜素的缺失與斑馬葉表型無關(guān)。突變體CRTISO底物Tetra-cis-lycopene及活性氧在短日照條件下積累，是導(dǎo)致突變體斑馬葉表型的主要原因[26]。zl2是z2的一個等位突變體，其突變性狀比z2更加嚴重，兩個突變體的突變類型相似，都是在外顯子和內(nèi)含子交界處發(fā)生單堿基的替換、cDNA的錯誤剪切[27]。

本研究鑒定的斑馬葉突變體zebra2-2是z2和zl2的等位突變體。與zl2突變體相似，zebra2-2從苗期開始出現(xiàn)斑馬葉的表型，而z2的斑馬葉表型在分蘗早期開始出現(xiàn)。zebra2-2的株高、劍葉長寬、每穗粒數(shù)等農(nóng)藝性狀比野生型都顯著下降。此外，zebra2-2在低溫條件下（22 ℃）的斑馬葉表型更加嚴重，高溫可恢復(fù)為綠-淡黃相間表型（30 ℃），表明zebra2-2是一個低溫敏感突變體。與z2和zl2突變體不同的是，zebra2-2的結(jié)實率與野生型沒有顯著下降。這些表型上的差異，可能是zebra2-2突變體的突變位點不同造成的。突變體中ZEBRA2基因的第3 342位堿基由G突變?yōu)锳，使得編碼的氨基酸由甘氨酸突變成天冬氨酸，表明該位置的氨基酸對于基因的功能具有重要作用。本研究結(jié)果對于研究ZEBRA2基因功能及探索水稻葉片發(fā)育分子機制具有重要意義。

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（責(zé)任編輯：張震林）

收稿日期：2020-04-09

基金項目：江蘇省自然科學(xué)基金項目（BK20180309）

作者簡介：陳海元（1988-），男，江蘇徐州人，博士，助理研究員，主要從事水稻基因功能解析及分子設(shè)計育種研究。（Tel）025-84390321;（E-mail）15150530179@163.com

通訊作者：方先文，（E-mail）2431240491@qq.com