崔衛(wèi)正，劉 爽

(邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 056001)

膿毒癥是一種由感染引起的全身性炎癥反應(yīng)綜合征，每天約1.4萬(wàn)人死于其多器官功能障礙并發(fā)癥[1]。急性肺損傷是膿毒癥最常見(jiàn)的并發(fā)癥，具有較高的并發(fā)率和致死率[2]。在內(nèi)毒素(LPS)和炎癥趨化因子作用下，肺組織炎癥反應(yīng)過(guò)度激活而導(dǎo)致肺功能障礙，繼而誘發(fā)氧化應(yīng)激損傷，是膿毒癥急性肺損傷的主要病理機(jī)制[3-5]。芹菜素是一種天然存在的黃酮類(lèi)化合物，以傘形科植物旱芹中含量較高而得名，其具有良好的抗氧化、抗炎、降壓、抗腫瘤等作用[6-8]。本實(shí)驗(yàn)觀察了芹菜素預(yù)處理對(duì)膿毒癥大鼠急性肺損傷的保護(hù)作用，并從炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激損傷、NF-κB信號(hào)通路角度探討了其可能作用機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 180只SPF級(jí)健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量(240±20)g，購(gòu)自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào)：SCXK(冀)2018-004]；開(kāi)展實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周[12 h光照黑暗交替、(25±1)℃、相對(duì)濕度(55±5)%]。數(shù)字編碼所有大鼠后，按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、芹菜素低劑量預(yù)處理組、芹菜素中劑量預(yù)處理組、芹菜素高劑量預(yù)處理組和地塞米松預(yù)處理組，每組30只。實(shí)驗(yàn)過(guò)程嚴(yán)格按照國(guó)家衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南進(jìn)行。

1.2主要藥物與試劑 芹菜素購(gòu)自陜西慧科植物開(kāi)發(fā)有限公司(純度≥98%，批號(hào)：HK20190124)；地塞米松購(gòu)自山東大陸藥業(yè)有限公司(規(guī)格：1 mL∶5 mg，批號(hào)：1903016)；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)酶聯(lián)免疫(ELISA)試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司(批號(hào)：2019003，2019014，2018027)；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、總抗氧化能力(T-AOC)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所(批號(hào)：20181125，20190307，20190114，20181206)；磷酸化核因子-κB(p-NF-κB)單克隆抗體購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司(批號(hào)：201903017)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1給藥預(yù)處置和模型制備 ①給藥預(yù)處置：精確稱(chēng)量芹菜素并加入適量0.9%氯化鈉溶液制備濃度為5 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL的芹菜素溶液，取地塞米松注射液加入適量0.9%氯化鈉溶液制備濃度為2.5 mg/mL的地塞米松溶液；芹菜素低、中、高劑量預(yù)處理組分別于造模術(shù)前7 d開(kāi)始1次/d腹腔注射給予濃度為5 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL的芹菜素溶液，地塞米松預(yù)處理組同步腹腔注射給予濃度2.5 mg/mL的地塞米松溶液，假手術(shù)組和模型組同步給予0.9%氯化鈉溶液，注射劑量均為2 mL/kg。②模型制備：參考文獻(xiàn)[9]方法，實(shí)施麻醉后仰位固定，剔除腹部毛發(fā)，沿腹部正中切口3～5 cm，于回盲口和盲腸末端之間結(jié)扎盲腸，于結(jié)扎線和盲腸末端之間用18號(hào)穿刺針頭對(duì)穿2次，擠出少量盲腸內(nèi)容物，然后逐層縫合；假手術(shù)組除不盲腸結(jié)扎和穿刺外，其他操作同模型組。術(shù)后皮下注射0.9%氯化鈉溶液(2 mL/100 g)抗休克。造模手術(shù)24 h后行各指標(biāo)檢測(cè)。

1.3.2肺功能檢測(cè) 各組隨機(jī)取大鼠10只，計(jì)數(shù)每分鐘呼吸次數(shù)(呼吸頻率)；實(shí)施麻醉、開(kāi)腹、經(jīng)腹主動(dòng)脈取血、肝素抗凝，通過(guò)血?dú)夥治鰞x(NF05DH-1831型，廣州華西科創(chuàng)科技有限公司)測(cè)定動(dòng)脈血氧分壓；取大鼠血漿及支氣管肺泡灌洗液并通過(guò)溴甲酚氯法測(cè)定各自蛋白含量，肺泡通透指數(shù)=支氣管肺泡灌洗液中蛋白含量/血漿蛋白含量。

1.3.3肺組織濕/干重比測(cè)定 取1.3.2中各組10只大鼠，脫臼處死后開(kāi)胸取肺組織，0.9%氯化鈉溶液沖洗、濾紙吸干后稱(chēng)重為濕重，置恒95 ℃烘箱24 h至重量不再變化為干重，然后計(jì)算肺組織濕/干重比。

1.3.4肺組織病理學(xué)檢查及損傷評(píng)分 各組隨機(jī)取大鼠10只，頸部脫臼處死，開(kāi)胸取肺組織，0.9%氯化鈉溶液沖洗后置4%多聚甲醛溶液固定72 h，常規(guī)石蠟包埋、5 μm厚度切片(CUT 4050型旋轉(zhuǎn)切片機(jī)，德國(guó)Leica公司)，經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇水洗后行HE染色，脫水、二甲苯透明后封片，通過(guò)光學(xué)顯微鏡(CKX41型，日本Olympus公司)觀察肺組織病理學(xué)變化。損傷評(píng)分：參照文獻(xiàn)[10]分別對(duì)肺泡水腫、肺泡出血、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、肺不張、透明膜形成狀況5個(gè)方面進(jìn)行評(píng)價(jià)，正常、輕度、中度、重度分別計(jì)分0，1，2，3分，總計(jì)15分。

1.3.5肺組織內(nèi)毒素(LPS)水平測(cè)定 取各組剩余的10只大鼠，麻醉后頸部脫臼處死，開(kāi)胸取肺組織，經(jīng)4 ℃預(yù)冷0.9%氯化鈉溶液洗滌后研磨勻漿，勻漿液經(jīng)4 ℃離心(離心半徑15 cm、轉(zhuǎn)速3 500 r/min、時(shí)間10 min)后取上清，然后通過(guò)細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定系統(tǒng)(EDS-99型，湛江正杰科學(xué)儀器有限公司)測(cè)定LPS水平。

1.3.6肺組織炎癥和氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè) 取1.3.5制備的肺組織勻漿液，經(jīng)4 ℃離心(離心半徑15 cm、轉(zhuǎn)速3 500 r/min、時(shí)間10 min)后取上清，按照ELISA試劑盒操作方法步驟檢測(cè)TNF-α、IL-1β、IL-6水平；硫代巴比妥酸法測(cè)定MDA水平，黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD活性，高錳酸鉀滴定法測(cè)定CAT活性，生化分析法檢測(cè)T-AOC活性。

1.3.7肺組織p-NF-κB蛋白表達(dá)量測(cè)定 取1.3.5制備的肺組織勻漿液，經(jīng)4 ℃離心(離心半徑15 cm、轉(zhuǎn)速12 000 r/min、時(shí)間20 min)，提取總蛋白并由BCA法測(cè)定總蛋白含量后，沸水浴蛋白變性、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(Tetra Systerm型垂直電泳槽，美國(guó)Bio-Rad公司)、轉(zhuǎn)PVDF膜(Power Pac Basic轉(zhuǎn)膜槽，美國(guó)Bio-Rad公司)、5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，滴加兔抗鼠p-NF-κB單抗和兔抗鼠β-actin單抗后4 ℃孵育過(guò)夜，洗膜后滴加山羊抗兔IgG二抗，室溫振蕩孵育1 h，PBS洗膜后滴加DAB顯色；以β-actin為內(nèi)參，以條帶灰度值對(duì)p-NF-κB蛋白進(jìn)行半定量分析。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠肺功能指標(biāo)比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠呼吸頻率和肺泡通透指數(shù)明顯升高(P均<0.05)，動(dòng)脈血氧分壓明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，芹菜素中、高劑量預(yù)處理組和地塞米松預(yù)處理組呼吸頻率和肺泡通透指數(shù)明顯降低(P均<0.05)，動(dòng)脈血氧分壓明顯升高(P均<0.05)；與地塞米松預(yù)處理組比較，芹菜素高劑量預(yù)處理組肺泡通透指數(shù)更低(P<0.05)，動(dòng)脈血氧分壓更高(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2各組大鼠肺組織濕/干重比、病理學(xué)損傷評(píng)分和LPS水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠肺組織濕/干重比、病理?yè)p傷評(píng)分、LPS水平均明顯升高(P均<0.05)；與模型組比較，芹菜素中、高劑量預(yù)處理組和地塞米松預(yù)處理組肺組織濕/干重比、病理?yè)p傷評(píng)分、LPS水平均明顯降低(P均<0.05)；與地塞米松預(yù)處理組比較，芹菜素高劑量預(yù)處理組肺組織濕/干重比、病理?yè)p傷評(píng)分、LPS水平更低(P均<0.05)。見(jiàn)表2。

2.3各組大鼠肺組織病理學(xué)表現(xiàn) HE染色顯示，假手術(shù)組大鼠肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁薄，未見(jiàn)炎性浸潤(rùn)；模型組可見(jiàn)肺間質(zhì)水腫、肺泡壁增厚、大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、肺泡內(nèi)出血等病理學(xué)改變；芹菜素各劑量預(yù)處理組和地塞米松預(yù)處理組大鼠肺組織上述病理學(xué)改變明顯輕于模型組，以芹菜素高劑量預(yù)處理組最輕。見(jiàn)圖1。

表1 各組大鼠肺功能指標(biāo)比較

表2 各組大鼠肺組織濕/干重比、損傷評(píng)分和LPS水平比較

圖1 各組大鼠肺組織病理學(xué)HE染色表現(xiàn)(×400)

2.4各組大鼠肺組織中TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠肺組織中TNF-α、IL-1β、IL-6水平均明顯升高(P均<0.05)；與模型組比較，芹菜素中、高劑量預(yù)處理組和地塞米松預(yù)處理組TNF-α、IL-1β、IL-6水平均明顯降低(P均<0.05)；與地塞米松預(yù)處理組比較，芹菜素高劑量預(yù)處理組TNF-α水平更低(P<0.05)。見(jiàn)表3。

2.5各組大鼠肺組織中MDA水平和SOD、CAT、T-AOC活性比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠肺組織中MDA水平明顯升高(P<0.05)，SOD、CAT、T-AOC活性均明顯降低(P均<0.05)；與模型組比較，芹菜素中、高劑量預(yù)處理組和地塞米松預(yù)處理組MDA水平明顯降低(P均<0.05)，SOD、CAT、T-AOC活性明顯升高(P均<0.05)；與地塞米松預(yù)處理組比較，芹菜素高劑量預(yù)處理組MDA水平更低(P<0.05)，SOD活性更高(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表3 各組大鼠肺組織中TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較

表4 各組大鼠肺組織中MDA水平和SOD、CAT、T-AOC活性比較

2.6各組大鼠肺組織中p-NF-κB蛋白表達(dá)量比較 假手術(shù)組、模型組、芹菜素低劑量預(yù)處理組、芹菜素中劑量預(yù)處理組、芹菜素高劑量預(yù)處理組和地塞米松預(yù)處理組大鼠肺組織中p-NF-κB蛋白表達(dá)量分別為0.08±0.03，0.91±0.16，0.78±0.14，0.75±0.12，0.19±0.04，0.25±0.05，模型組明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)，芹菜素中、高劑量預(yù)處理組和地塞米松預(yù)處理組明顯低于模型組(P均<0.05)，芹菜素高劑量預(yù)處理組明顯低于地塞米松預(yù)處理組(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

A為假手術(shù)組；B為模型組；C為芹菜素低劑量預(yù)處理組；D為芹菜素中劑量預(yù)處理組；E為芹菜素高劑量預(yù)處理組；F為地塞米松預(yù)處理組

3 討 論

膿毒癥是臨床較為常見(jiàn)的一種重癥感染性疾病綜合征，通過(guò)LPS誘導(dǎo)全身炎癥反應(yīng)、導(dǎo)致多器官功能衰竭是膿毒癥的主要病理特征[11]。急性肺損傷是膿毒癥早期即可出現(xiàn)的嚴(yán)重并發(fā)癥，發(fā)生率達(dá)70%，治療不及時(shí)其病死率達(dá)50%～70%[12]。所以，保護(hù)肺組織、減輕急性肺損傷對(duì)改善膿毒癥治療預(yù)后具有重要意義。

本研究采用盲腸結(jié)扎穿孔法制備膿毒癥大鼠模型，使腸道內(nèi)容物進(jìn)入腹腔，導(dǎo)致大量細(xì)菌和LPS進(jìn)入肺組織而引發(fā)急性肺損傷，肺組織病理改變接近臨床，是目前應(yīng)用較多的造模方法。造模結(jié)果顯示，膿毒癥模型大鼠肺組織呈現(xiàn)肺間質(zhì)水腫、肺泡壁增厚、大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、肺泡內(nèi)出血等病理性改變，與袁園等[13]報(bào)道一致。

芹菜素是一種黃酮類(lèi)化合物，具有抗炎、抗氧化等多種藥理學(xué)作用。Li 等[14]研究發(fā)現(xiàn)芹菜素對(duì)LPS導(dǎo)致抗氧化酶活性降低而出現(xiàn)的氧化應(yīng)激具有抑制作用。王玉明等[15]研究發(fā)現(xiàn)芹菜素對(duì)LPS所致肺組織炎癥反應(yīng)具有抑制作用。本研究結(jié)果顯示，芹菜素中、高劑量預(yù)處理組和地塞米松預(yù)處理組呼吸頻率、肺泡通透指數(shù)、肺組織濕/干重比、病理?yè)p傷評(píng)分均明顯低于模型組，動(dòng)脈血氧分壓明顯高于模型組，肺組織病理學(xué)改變明顯輕于模型組，且芹菜素高劑量預(yù)處理組各指標(biāo)改善更明顯，提示芹菜素預(yù)處理對(duì)膿毒癥所致急性肺損傷大鼠肺組織病變、肺水腫、肺功能降低具有保護(hù)作用。

LPS是膿毒癥導(dǎo)致多器官并發(fā)癥的主要“介導(dǎo)者”，能夠刺激中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等釋放大量炎癥細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-6等。TNF-α除了能夠直接損傷肺組織血管內(nèi)皮細(xì)胞外，還能夠通過(guò)結(jié)合其他炎癥細(xì)胞的TNF結(jié)合蛋白而刺激機(jī)體免疫應(yīng)激，進(jìn)一步促進(jìn)炎癥因子的產(chǎn)生和釋放，導(dǎo)致炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生[16]；IL-1β為前炎性細(xì)胞因子，也能夠進(jìn)一步刺激免疫應(yīng)激和炎癥反應(yīng)；IL-6能夠?qū)е卵踝杂苫?ROS)大量釋放，以ROS為底物的抗氧化酶SOD、CAT大量消耗，T-AOC活性降低，使ROS不能及時(shí)清除而導(dǎo)致肺組織氧化應(yīng)激損傷[17]，其中MDA為脂質(zhì)氧化應(yīng)激反應(yīng)的終產(chǎn)物。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，芹菜素預(yù)處理能夠有效抑制膿毒癥大鼠肺組織LPS、TNF-α、IL-1β、IL-6、MDA水平升高和SOD、CAT、T-AOC活性降低，提示芹菜素預(yù)處理能夠抑制膿毒癥大鼠肺組織炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷。

NF-κB信號(hào)通路對(duì)機(jī)體炎癥反應(yīng)具有重要的調(diào)控作用，NF-κB結(jié)構(gòu)磷酸化(p-NF-κB)將激活NF-κB信號(hào)通路。鄒憲寶等[18]研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥患者肺血管內(nèi)皮細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路被激活，誘導(dǎo)TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥細(xì)胞因子大量釋放。何梅英等[19]研究證實(shí)白藜蘆醇可通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路而顯著減輕膿毒癥大鼠炎癥反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，中、高濃度芹菜素預(yù)處理組p-NF-κB蛋白表達(dá)量明顯低于模型組，提示芹菜素預(yù)處理對(duì)膿毒癥急性肺損傷的保護(hù)作用可能與抑制NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，芹菜素預(yù)處理具有抑制膿毒癥大鼠急性肺損傷、保護(hù)肺功能的作用，其機(jī)制可能與抑制炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激及NF- κB信號(hào)通路有關(guān)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。