黃振東鹿連明蒲占湑胡秀榮沈宣才呂 佳朱 莉

（ 1.浙江省柑橘研究所臺州 318026；2.浙江省臺州市農(nóng)資股份有限公司）

柑橘黃龍病（huanglongbing,CandidatusLiberibacter asiaticus） 是目前世界上最具破壞性的柑橘病害之一，而柑橘黃龍病可以通過亞洲柑橘木虱Diaphorina citri(Hemiptera:Liviidae)進行傳播，亞洲柑橘木虱為刺吸式口器的害蟲，主要為害植株的新芽嫩梢，成蟲分散在葉和嫩芽上吸食，若蟲群集在新梢、嫩芽和幼葉上為害，吸食芽梢汁液，黃龍病病原菌能在木虱體內(nèi)生活，帶菌木虱在健康橘樹上取食時，病原菌通過口針進入植株內(nèi)，在植株內(nèi)定居、繁殖，受害的植株葉片均勻黃化，脈間葉肉似缺鋅狀黃化，節(jié)間短，后期枝干枯死，果實小并畸形，根多腐爛，甚至全株枯死。因此，防治亞洲柑橘木虱是切斷柑橘黃龍病傳播蔓延的重要途徑，也是柑橘黃龍病綜合防控的關鍵環(huán)節(jié)。

根據(jù)亞洲柑橘木虱在柑橘軟組織和表皮的刺吸路徑相關的DC-EPG信號分別定義其產(chǎn)生 8種主要的取食波形，依次為非刺探波(Np波)、路徑波(C波)、 D波、韌皮部分泌唾液波(E 1波)、韌皮部被動吸食波(E 2波)以及木質(zhì)部主動吸食波(G波)。通過刺吸電位技術記錄亞洲柑橘木虱的刺吸行為，可以進一步明確亞洲柑橘木虱傳播柑橘黃龍病的機理和其在橘樹上的定殖、發(fā)育和適應性。

本試驗開展了亞洲柑橘木虱在柑橘葉片上的EPG信號初步研究，明確了其各種取食波形的特征，以及其在12小時內(nèi)和24小時內(nèi)刺吸波形的各種參數(shù)變化，為進一步開展亞洲柑橘木虱和黃龍病有效防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

健康真龍柚（Citrus grandis osbeck cv.Zhenlongyou）種子，來自浙江省柑橘研究所的國家柑橘品種改良中心浙江分中心，種子去皮，播于蛭石中萌發(fā)，發(fā)芽 2～ 3月（葉 3～ 5片）后，挑選生長一致的植株用于亞洲柑橘木虱寄主植物用于EPG測試。

試驗所用亞洲柑橘木虱從浙江省臺州市黃巖區(qū)頭陀鎮(zhèn)一處果園（28°38'35"N，121°09'30"）收集后飼養(yǎng)于浙江省柑橘研究所玻璃溫室內(nèi)，采用九里香罩籠飼養(yǎng) 3年，試驗前提前 1 d將日齡在15 d左右的成蟲移入EPG測試實驗室內(nèi)罩養(yǎng)蟲籠的真龍柚植株上。

1.2 實驗儀器和場地

EPG試驗是在一個專用房間進行，照明采用LED節(jié)能燈，300LUX光強度、溫度控制在26～28℃、相對濕度維持在65%～70%，測試從下午14：00開始，共記錄12 h和24 h，采用GIGA- 8型刺探電位儀(EPG系統(tǒng)，瓦赫寧根，荷蘭)，通過GIGA- 8型DC EPG放大器記錄信號，信號放大倍數(shù)調(diào)整為100倍，采用Stylet+d.exe Version 1.2軟件接受信號，貯存，采用Stylet+a.exe Version 1.2軟件進行信號分析(Laboratory of Entomology,Wageningen University,The Netherlands)，銀膠、銅釘、金絲購自上海應賽儀器設備有限公司。

1.3 實驗方法

將飼養(yǎng)在實驗室養(yǎng)蟲籠內(nèi)的亞洲柑橘木虱成蟲取出饑餓 2 h，置冰箱在 0℃下冷凍3～ 5min，迅速用導電性銀膠將18μ m直徑的金絲粘到亞洲柑橘木虱背板中間，粘結結束后，靜置 3～ 5min使其能正常活動后，轉入法拉第籠中的試驗處理過的真龍柚植株幼嫩并完全展開的葉片上，連接金絲到電極，植物電極則插入土壤，然后關上法拉第籠門，屏蔽外界干擾，開啟EPG儀器和記錄，一次同時進行 8組亞洲柑橘木虱的EPG信號記錄。

1.4 數(shù)據(jù)分析

將24 h波形總數(shù)除 2轉換為平均12 h波形次數(shù)與12 h進行比較，12 h和24 h內(nèi)完成有效刺吸的記錄的EPG波形圖像參考Bonani等人（2010）方法，按照不同的刺吸行為分為Np波、 C波（A+B+C）、 E 1、 E 2、 G波、 D波，各波形參數(shù)采用DPS14.5系統(tǒng)單因素試驗統(tǒng)計分析（Tukey法）進行差異顯著性分析（p= 0.05）。

2 結果分析

2.1 亞洲柑橘木虱成蟲在橘苗上的各種刺吸行為圖譜

根據(jù)亞洲柑橘木虱各種波形特征及已知的生物學意義： C波是在細胞間穿刺尋找取食位點。這種波形出現(xiàn)于口針經(jīng)過葉表皮至吸食部位(韌皮部)的途中，稱為路徑波(Pathway waveform)。 D波：出現(xiàn)在 C波和 E 1波之間，頻率為 1～ 6Hz，主頻為 2Hz，持續(xù)時間15 s左右。電勢與 C波處在同一水平上，反映的是胞外電勢水平，可能與口針接觸和刺探篩管壁的活動有關。 E波：電勢水平較低，是胞內(nèi)電勢水平，反映了口針刺探韌皮部篩管的過程，持續(xù)時間較長，分為 E 1和E 2共 2個亞波， E 1波頻率為5～ 1 0Hz,主頻在7.5Hz，波峰朝上，與木虱主動分泌水溶性唾液到篩管中有關；E 2波頻率為4～ 9Hz，波峰朝下，與木虱在篩管中被動吸食有關。G波：電勢與 C波持平，但振幅在幾種取食波中最大，很容易分辨，反映的是胞外電勢水平，頻率為7Hz，與木質(zhì)部主動吸食有關。非刺探波(Np波)一般為柑橘木虱開始在柑橘上活動初期的一段波形，大部分情況下隨后開始出現(xiàn)的是C波，也有直接開始G波、 E 1和 E 2波的（圖1）。

圖1：亞洲柑橘木虱各種波形特征

2.2 亞洲柑橘木虱成蟲在真龍柚苗上的各種刺吸行為比例

12小時試驗過程 C波時間占整個試驗時間比例為52.75%，顯著低于24 h試驗過程的71.53%比例， E 2和 G波時間比例顯著高于24小時期間的比例，說明隨著亞洲柑橘木虱在柑橘上停留時間的延長，韌皮部吸入和木質(zhì)部刺吸的時間比例降低，而 E 2波是與柑橘黃龍病傳播相關的行為，因此可以推斷亞洲柑橘木虱在柑橘植株上短時期內(nèi)傳播效率更高。

亞洲柑橘木虱轉入真龍柚植株葉片后會很快轉移到背部進行韌皮部取食，也有一部分柑橘木虱在移動過程掉落。連續(xù)在柑橘葉片上完成12h刺吸不掉落的亞洲柑橘木虱比例為42.19%，而在24h試驗過程中，能完成有效刺吸不掉落的比例降低到38.75%，兩者之間沒有顯著性差異，亞洲柑橘木虱成蟲在長時間的刺吸過程中，必定會由于掉落而造成有效記錄信號比例的下降（圖3）。

圖3 亞洲柑橘木虱完成試驗期刺吸比例

圖4顯示，亞洲柑橘木虱在12 h完成波形總次數(shù)顯著大于24 h折斷成12 h的平均值，表明亞洲柑橘木虱經(jīng)過饑餓后釋放在柑橘葉片后12 h內(nèi)會較為活躍，而在12h后活躍期下降，同樣 C、D+E 1、 G波次數(shù)均顯示12h期間總次數(shù)大于24 h總次數(shù)，而 E 2波總次數(shù)12 h與24 h差異不顯著。

圖4 亞洲柑橘木虱波形次數(shù)

圖5顯示，亞洲柑橘木虱在12 h內(nèi)，Np、 D波形每次平均持續(xù)時間顯著大于24 h處理，而 C、 E 1、 E 2、 G波每次平均持續(xù)時間顯著小于24 h處理，同樣表明亞洲柑橘木虱經(jīng)過饑餓后釋放在柑橘葉片后12 h內(nèi)會較為活躍，而在12 h后活躍期下降。

圖5 亞洲柑橘各波形每次持續(xù)時間(各波形總時間/刺吸次數(shù))

圖6顯示，亞洲柑橘木虱在12 h內(nèi)， D波形總時間平均值顯著大于24 h處理，而 C、 E 1、E 2、 G波總持續(xù)時間顯著小于24 h處理。

圖6 亞洲柑橘各波形總時間（WDI)

3 結論

C 波稱為路徑波，是在細胞間穿刺尋找取食位點，這種波形出現(xiàn)于口針經(jīng)過葉表皮至吸食部位(韌皮部)的途中。12 h內(nèi)亞洲柑橘木虱花費在口針活動取食選擇的時間比例小于24 h，說明經(jīng)過長時間的適應，亞洲柑橘木虱在柑橘葉片上出現(xiàn)一定的取食疲倦，12 h韌皮部和木質(zhì)部取食比例均高于24h ，說明亞洲柑橘木虱一旦進入寄主會迅速地進行取食，這也可能與試驗前的饑餓處理有關。在12 h和24 h不同時間段，亞洲柑橘木虱由于調(diào)整位置而掉落的比例差異不大，說明在寄主柑橘葉片上活動性不強，從12 h和24 h波形次數(shù)、各波形每次持續(xù)時間、各波形總時間比較，也說明隨著木虱在寄主上停留時間加長后各波形出現(xiàn)頻率降低。

本研究初步對亞洲柑橘木虱在柑橘嫩葉上的刺吸電位信號進行分析，對亞洲柑橘木虱在寄主上12 h和24 h內(nèi)的刺吸行為參數(shù)進行了比較，初步發(fā)現(xiàn)亞洲柑橘木虱在寄主活動性一般，在短時間內(nèi)韌皮部取食的時間和頻率較高，因此一旦出現(xiàn)柑橘木虱，需要迅速撲滅，對于柑橘黃龍病低密度地區(qū)防治，一定要加強對柑橘木虱的預測預報，及時用藥防治柑橘木虱，才能更好地預防柑橘黃龍病的發(fā)生。