王一川，劉小靜，葉 峰，楊雪亮，陳 娜，吳劍華，李彥霖

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院 感染科，陜西 西安 710016)

線粒體提供細(xì)胞生命活動(dòng)的大部分能量，其功能障礙與人類疾病有關(guān)，包括神經(jīng)和肌肉退化、心血管疾病、肥胖、糖尿病、衰老和罕見的線粒體疾病。線粒體移植治療是從正常組織細(xì)胞分離線粒體，然后注入患者線粒體損傷或缺失的部位，使損傷細(xì)胞獲得救治、器官功能得以恢復(fù)的全新干預(yù)技術(shù)。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，線粒體移植作為治療包括心臟、肝臟、肺和大腦在內(nèi)的各種組織的線粒體損傷的有效性已經(jīng)有報(bào)道。在臨床試驗(yàn)中，這種方法僅在一項(xiàng)改善先天性心臟病的心肌缺血再灌注損傷的研究被報(bào)道[1]，尚未廣泛應(yīng)用。因此，本文總結(jié)了線粒體移植的研究現(xiàn)狀，希望能對(duì)研究者有所啟發(fā)。

1 線粒體的結(jié)構(gòu)、功能和病理狀態(tài)

線粒體由雙層膜結(jié)構(gòu)套疊而成，將線粒體內(nèi)部空間分成兩個(gè)膜性空間。線粒體外層單位膜光滑平整，由1/2的脂類和1/2的蛋白質(zhì)組成。線粒體內(nèi)膜比外膜稍薄，將內(nèi)膜基質(zhì)分成膜間腔和基質(zhì)腔兩個(gè)部分，內(nèi)膜上大量向基質(zhì)腔凸起的結(jié)構(gòu)形成嵴，這樣的結(jié)構(gòu)擴(kuò)大了線粒體內(nèi)膜面積，提高了線粒體內(nèi)化學(xué)反應(yīng)的效率。線粒體DNA是裸露在基質(zhì)或附著于內(nèi)膜的雙鏈環(huán)狀分子，編碼線粒體的少部分RNA和蛋白質(zhì)。功能上，外膜上有大量物質(zhì)進(jìn)出線粒體的通道蛋白和特異性受體負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)。內(nèi)膜的電子傳遞鏈與內(nèi)膜表面附著的三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)合酶復(fù)合體共同完成氧化磷酸化和ATP的合成。線粒體基質(zhì)則是各種有機(jī)物進(jìn)行最后氧化過程的場(chǎng)所。只有經(jīng)過三羧酸循環(huán)，有機(jī)物才能完全氧化，產(chǎn)生比無氧酵解所提供的更多能量。

線粒體的形態(tài)、大小、數(shù)量和排列分布根據(jù)細(xì)胞的類型和生理狀態(tài)而不同。線粒體應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激損傷時(shí)，啟動(dòng)mtDNA轉(zhuǎn)錄程序緩解應(yīng)激、將部分線粒體轉(zhuǎn)移到線粒體衍生囊泡、激活線粒體自噬[2]以及誘導(dǎo)細(xì)胞死亡等機(jī)制；在結(jié)構(gòu)上表現(xiàn)為線粒體腫脹破裂，內(nèi)膜結(jié)構(gòu)液化消失等。這些病理狀態(tài)下線粒體功能異常，導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生代謝障礙，引起肌肉、神經(jīng)、心肌疾病和凋亡等。現(xiàn)有的治療措施主要基于分子水平，包括補(bǔ)充輔酶，減少對(duì)缺陷線粒體的排斥和替代缺陷mtDNA等。

2 線粒體轉(zhuǎn)移的機(jī)制

2.1 線粒體細(xì)胞間轉(zhuǎn)移機(jī)制

線粒體起源的內(nèi)共生學(xué)說認(rèn)為，古線粒體作為一種需氧菌被原始真核細(xì)胞吞噬，在長(zhǎng)期互利共生中演化成了現(xiàn)在的線粒體細(xì)胞器。這個(gè)假說提示了細(xì)胞具有觸發(fā)細(xì)胞器交換的機(jī)制，以響應(yīng)來自受累細(xì)胞的損傷信號(hào)。然而，啟動(dòng)這一過程的分子線索仍然不明。以神經(jīng)元為例，當(dāng)大鼠皮層神經(jīng)元受到缺氧葡萄糖剝奪時(shí)，細(xì)胞內(nèi)ATP水平下降，神經(jīng)元活力下降；當(dāng)添加星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞外線粒體顆粒后，神經(jīng)元活力恢復(fù)[3]。目前的動(dòng)物器官缺血再灌注模型大多通過血管輸送或直接注射的方法快速有效地完成移植。經(jīng)腹腔靜脈注射后，外源性線粒體分布于小鼠腦、肝、腎、肌肉、心臟等多種組織。然而細(xì)胞間線粒體轉(zhuǎn)移途徑，外源性線粒體通過生理屏障(如血腦屏障)的機(jī)制依然有待研究。

細(xì)胞間轉(zhuǎn)移的機(jī)制主要由隧道納米管(tunnel-ing nanotube,TNT)、間隙連接和細(xì)胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)的釋放等發(fā)揮作用。TNT是由與靶細(xì)胞相連的絲狀細(xì)胞膜突起產(chǎn)生的納米管狀的動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)。每個(gè)細(xì)胞的膜延伸融合在一起，從而形成一個(gè)緊密連接的橋，它不是固定在膜上，而是懸浮在細(xì)胞外空間。TNT參與肺上皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞和急性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞等的線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)、修復(fù)細(xì)胞損傷、激活增強(qiáng)免疫反應(yīng)和細(xì)胞代謝重編程。ROS誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)磷脂肌醇3-激酶也與連接蛋白通道的打開有關(guān)[4]。供體細(xì)胞釋放的EVs可以與接收細(xì)胞融合或吞噬來釋放其中的線粒體，動(dòng)脈內(nèi)注射骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源的EVs可減輕局灶性腦損傷引起的神經(jīng)炎性反應(yīng)[5]。在糖尿病心肌缺血的大鼠模型中證實(shí)了肌動(dòng)蛋白在線粒體細(xì)胞間轉(zhuǎn)移的重要性[6]。

2.2 移植線粒體的來源和移植后免疫反應(yīng)

干細(xì)胞有強(qiáng)大的再生潛力，因此被認(rèn)為是可靠的線粒體來源。不同供體細(xì)胞的線粒體也有不同的功能。基于細(xì)胞對(duì)低氧的不同反應(yīng)，將大鼠從股動(dòng)脈分離出的線粒體與低氧的肺動(dòng)脈段共孵育培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，低氧時(shí)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞線粒體產(chǎn)生的ROS要遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于股動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞線粒體。股動(dòng)脈平滑肌線粒體移植能抑制低氧引起的肺循環(huán)阻力升高[7]。

免疫排斥方面，通過觀察小鼠自體和同種異體的線粒體移植產(chǎn)生的免疫排斥反應(yīng)發(fā)現(xiàn)，不管是單次注射還是連續(xù)注射，不管是自體細(xì)胞還是異體細(xì)胞線粒體注射，與空白對(duì)照組相比，血清炎性標(biāo)志物都無明顯差異[8]。結(jié)合古線粒體內(nèi)共生來源學(xué)說，外源性線粒體移植不易引起明顯免疫排斥反應(yīng)的現(xiàn)象有助于擴(kuò)大線粒體供體源，為推廣異體線粒體移植治療提供可能。

線粒體移植機(jī)制的研究為臨床應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)，也對(duì)線粒體移植的應(yīng)用提供了更多思路。

3 線粒體移植的臨床探索

3.1 線粒體移植改善缺血/再灌注損傷

3.1.1 心臟缺血/再灌注損傷:缺血/再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury,I/RI)是導(dǎo)致線粒體損傷最常見的原因，也是大多數(shù)實(shí)驗(yàn)的模型機(jī)制。在心肌缺血再灌注動(dòng)物模型中初步驗(yàn)證了心肌源性線粒體的治療作用[9]。結(jié)扎兔冠狀動(dòng)脈左前降支，缺血后將供體兔左心室的線粒體直接注射到心臟缺血的部位，發(fā)現(xiàn)心肌梗死標(biāo)志物水平顯著降低。隨后驗(yàn)證了自體線粒體移植的策略，即從骨骼肌中提取的健康的自體線粒體移植到損傷的心肌中，觀察到的線粒體移植組梗死范圍比空白對(duì)照組顯著減少[10]。超聲心動(dòng)圖顯示整體功能無明顯差異。組織化學(xué)和透射電鏡顯示，在對(duì)照組心肌組織受損，而在線粒體組則不明顯。用同樣方法提取的線粒體注入糖尿病大鼠冠狀動(dòng)脈也被證實(shí)能夠改善心肌缺血的損傷[1]。

線粒體移植在再灌注過程中，而不是在再灌注前立即給予冠狀動(dòng)脈的問題更接近實(shí)際[11]。超聲心動(dòng)圖分析顯示，再灌注時(shí)，局部I/RI后接受線粒體移植的心臟射血分?jǐn)?shù)、左室短軸縮短率和梗死面積/危險(xiǎn)區(qū)域(infarct size/area at risk IS/AAR)都有明顯改善。再灌注結(jié)束時(shí)，兩組在左室舒張末期壓和左室壓升高速率等整體左室功能測(cè)量值上存在差異。兩組之間在危險(xiǎn)區(qū)域沒有發(fā)現(xiàn)顯著差異。與對(duì)照組相比，接受線粒體移植的IS/AAR明顯減小。

循環(huán)死亡后捐獻(xiàn)(donation after circulatory death,DCD)提供了另一種異體心臟移植來源，但由于缺血的影響而受到限制。研究表明線粒體移植增強(qiáng)DCD心臟心肌功能的效果[12]。停止機(jī)械通氣使約克豬循環(huán)衰竭，熱缺血20 min后，給予心臟停搏液。然后在離體血液灌注系統(tǒng)進(jìn)行心臟再灌注，15 min后，心臟接受溶劑或含有自體線粒體的注射液，實(shí)驗(yàn)組在離體心臟灌注2 h后接受第二次線粒體注射。與溶劑組相比，接受線粒體注射液組的左心室/心室峰值發(fā)展壓力、最大左心室/心室壓力升高，左室縮短分?jǐn)?shù)和心肌耗氧量顯著增加，心肌梗死面積明顯縮小。這一研究表明線粒體移植顯著地保留了DCD心臟的心肌功能和耗氧量，從而為擴(kuò)大心臟供體池提供了可能的選擇。

對(duì)先天性心臟病手術(shù)干預(yù)和體外膜肺氧合(extracorporeal membrane oxygenation,ECMO)支持沒有改善的患兒從自體腹直肌中分離出線粒體，然后從心外膜注入超聲心動(dòng)圖提示有缺血再灌注損傷的心肌中[1]。所有患者均無與心外膜注射相關(guān)的心律失?；虺鲅?，5例患者中，4例心室功能改善，并成功脫離ECMO支持。注射前和注射后全身炎性反應(yīng)綜合征的標(biāo)志物(穩(wěn)定的呼吸和腎臟狀態(tài))無明顯差異，這與動(dòng)物研究數(shù)據(jù)一致。其中一例患者的尸檢顯示在注射部位沒有炎性或排斥的跡象，白細(xì)胞計(jì)數(shù)沒有臨床相關(guān)變化，提示自體線粒體移植不會(huì)引起明顯的炎性反應(yīng)。然而，選擇這組患者是因?yàn)镋CMO支持后心肌功能未恢復(fù)，而且心室功能的恢復(fù)也希望渺茫。評(píng)估不同治療時(shí)機(jī)，確定線粒體的劑量和不同給藥方法仍有待研究。

3.1.2 肺缺血/再灌注損傷：缺血/再灌注損傷是導(dǎo)致急性肺損傷(acute lung injury,ALI)最常見的原因之一。體外氣體交換、體外循環(huán)和機(jī)械通氣均可導(dǎo)致I/RI。I/RI對(duì)肺功能和細(xì)胞活力有深遠(yuǎn)影響，并顯著增加兒童和成人患者的發(fā)病率和病死率。線粒體損傷在ALI中起著重要作用，為肺I/RI的治療提供策略。

用雄性C57BL/6J小鼠研究了線粒體移植在小鼠肺I/RI模型中的效果。通過開胸手術(shù)在左肺門部應(yīng)用微血管鉗夾閉2 h誘發(fā)短暫性缺血[13]。再灌注后，小鼠通過肺動(dòng)脈血管或吸入氣管氣霧劑給藥，給小鼠注射含有線粒體的載體或空白載體。假對(duì)照組小鼠開胸不夾閉肺門。24 h后，評(píng)估肺力學(xué)參數(shù)并收集肺部組織進(jìn)行分析。結(jié)果表明，再灌注24 h后，與相應(yīng)的溶媒組相比，線粒體吸入組的動(dòng)態(tài)順應(yīng)性和吸氣量顯著增加，阻力、組織阻尼、彈性和吸氣峰壓(僅動(dòng)脈注射組)顯著降低；與假對(duì)照組相比，線粒體移植組中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、間質(zhì)水腫和凋亡明顯減少。各組間細(xì)胞因子和趨化因子無明顯差異。這些結(jié)果表明，血管輸送或霧化吸入線粒體移植都可以改善肺機(jī)械功能，減少肺組織損傷。

3.1.3 骨骼肌缺血/再灌注損傷:骨骼肌也是富含線粒體的重要器官。在小鼠的左后肢急性缺血模型中，用止血帶引起缺血2 h后，恢復(fù)后肢再灌注。將空白對(duì)照或線粒體溶液直接注射到后肢的所有肌肉中。線粒體以不同濃度梯度被注射到每塊肌肉。假性對(duì)照組不接受缺血或注射，但麻醉2 h后恢復(fù)。在后肢再灌注24 h后，線粒體移植組小鼠腓腸肌、比目魚肌和股內(nèi)側(cè)肌的梗死面積比空白對(duì)照組明顯減少，后肢的站立能力明顯增強(qiáng)，站立能力與非缺血組無明顯差異[14]。

3.1.4 腎臟缺血/再灌注損傷:腎臟的線粒體含量和耗氧率僅次于心臟。由于線粒體的功能和生存能力依賴于血液輸送的穩(wěn)定氧氣供應(yīng)，氧氣輸送的中斷或停止以及由此產(chǎn)生的I/RI嚴(yán)重?fù)p害線粒體的能量生產(chǎn)，導(dǎo)致腎功能不全或衰竭。以豬雙側(cè)腎缺血再灌注損傷為模型研究線粒體移植的腎臟作用[15]。用球囊導(dǎo)管對(duì)雌性約克郡豬進(jìn)行經(jīng)皮雙側(cè)腎動(dòng)脈暫時(shí)閉塞術(shù)，缺血60 min后，將球囊導(dǎo)管放氣，以單次給藥的方式將線粒體輸送至腎動(dòng)脈。注入的線粒體迅速被腎臟吸收，分布在皮質(zhì)和髓質(zhì)的管狀上皮細(xì)胞中。再灌注24 h后，與溶劑組相比，線粒體治療組血尿素氮明顯降低。大體解剖、病理組織學(xué)分析、急性腎小管壞死評(píng)分和透射電鏡顯示，溶劑組的腎皮質(zhì)主要是近端小管發(fā)生廣泛的凝固性壞死，而線粒體移植腎僅表現(xiàn)為斑片狀輕度急性腎小管損傷。與接受線粒體移植的腎臟相比，溶劑處理的腎臟的腎皮質(zhì)IL-6表達(dá)顯著增加。這些結(jié)果表明，動(dòng)脈內(nèi)注射線粒體可保護(hù)腎臟免受缺血再灌注損傷，顯著增強(qiáng)腎功能，減輕腎損害。

3.2 線粒體移植改善代謝功能

線粒體功能障礙導(dǎo)致肝細(xì)胞脂質(zhì)堆積，是引起非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)的一個(gè)重要機(jī)制。外源性線粒體對(duì)高脂肪飲食誘導(dǎo)的小鼠脂肪肝有治療作用[16]。他們用小鼠隨機(jī)分為4組(每組12只)。第一組為正常對(duì)照組，其余3組灌胃給予高脂高膽固醇飼料，線粒體治療1組小鼠3 d內(nèi)靜脈注射從肝癌細(xì)胞中分離的線粒體，共3次；治療2組小鼠接受線粒體6次。脂肪肝組給予等量0.9%氯化鈉溶液。用GFP標(biāo)記線粒體，觀察靜脈注射后外源性線粒體在體內(nèi)的分布。小鼠注射2 h后，肝、肺、腦、肌、腎出現(xiàn)熒光，表明熒光蛋白標(biāo)記的線粒體可進(jìn)入小鼠組織細(xì)胞。線粒體治療組血清轉(zhuǎn)氨酶活性和膽固醇水平呈劑量依賴性下降。同時(shí)減少了脂肪肝小鼠的脂質(zhì)積累和氧化損傷，提高能量的產(chǎn)生，從而恢復(fù)肝細(xì)胞功能。線粒體移植治療策略為NAFLD的治療提供了一種新的潛在的治療途徑。

3.3 線粒體移植改善神經(jīng)功能

神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞通過不同的細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間信號(hào)機(jī)制維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài),線粒體的跨細(xì)胞轉(zhuǎn)移已經(jīng)成為這種交流的一個(gè)重要例子。大量證據(jù)表明線粒體功能的損傷對(duì)于帕金森的疾病進(jìn)展有重要作用[17]。然而由于線粒體蛋白和DNA結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定，線粒體靶向藥物只能提供有限的神經(jīng)保護(hù)。在小鼠強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)中，補(bǔ)充線粒體組的小鼠耐力增強(qiáng);而在帕金森病模型小鼠中，線粒體移植通過增加電子傳遞鏈的活性、降低活性氧水平、防止細(xì)胞凋亡和壞死來阻止帕金森病的實(shí)驗(yàn)進(jìn)展[17]。

在一種短暫局部腦缺血模型中，用星形膠質(zhì)細(xì)胞來源的細(xì)胞外線粒體，注射到局灶性腦缺血小鼠模型的梗死周圍區(qū)域后，可被神經(jīng)元獲取，這表明線粒體注射可能是治療卒中的一種新的治療方法[3]。從進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在接受高壓氧預(yù)處理從星形膠質(zhì)細(xì)胞中轉(zhuǎn)移線粒體可以減輕大鼠神經(jīng)元的缺血死亡[18]。腦脊液mtDNA減少是神經(jīng)退行性疾病的一個(gè)特征，如帕金森病、阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)和多發(fā)性硬化癥[19]。一項(xiàng)阿爾茨海默病生物標(biāo)志候選物的蛋白質(zhì)組學(xué)篩選中發(fā)現(xiàn)的潛在AD信號(hào)中59%是線粒體蛋白，強(qiáng)調(diào)了線粒體功能障礙在AD中的重要地位[20]。然而，線粒體功能障礙是否存在于所有神經(jīng)退行性疾病中，以及它與神經(jīng)退行性病變的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

小膠質(zhì)細(xì)胞活化和線粒體功能障礙是膿毒癥引起腦功能障礙的兩個(gè)主要因素。線粒體功能障礙可改變小膠質(zhì)細(xì)胞的免疫特性，使其趨向促炎性表型。線粒體治療通過增強(qiáng)從M1表型到M2表型的小膠質(zhì)細(xì)胞極化和抑制小膠質(zhì)來源的炎性細(xì)胞因子的釋放來提供神經(jīng)保護(hù)，改善了膿毒癥幸存者的認(rèn)知障礙，支持了外源性線粒體移植療法的潛在應(yīng)用。

3.4 線粒體移植對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響

癌相關(guān)成纖維細(xì)胞(cancer-associated fibroblasts,CAFs)能重塑癌細(xì)胞的線粒體網(wǎng)絡(luò)和基因組表達(dá)，從而使癌細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性。在前列腺癌[21]和急性淋巴細(xì)胞白血病[22]中，初級(jí)CAFs已經(jīng)被證明通過TNT將線粒體轉(zhuǎn)移到癌細(xì)胞。從CAFs水平轉(zhuǎn)移功能性線粒體可提高前列腺癌細(xì)胞線粒體的質(zhì)量和活性，從而進(jìn)一步促進(jìn)惡性腫瘤的發(fā)生[21]。在骨髓微環(huán)境中，抗腫瘤藥物可以刺激胞吞作用的線粒體轉(zhuǎn)移，黏附于骨髓基質(zhì)細(xì)胞的急性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞的ATP含量增加，從而產(chǎn)生阿糖胞苷藥物的抗性[23]。線粒體轉(zhuǎn)移相關(guān)信號(hào)分子可能成為新的化療藥物作用靶點(diǎn)。

從星形膠質(zhì)細(xì)胞中提取的線粒體移植入人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中能有效地加劇輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞核DNA 損傷，通過對(duì)mtDNA缺失的細(xì)胞模型的構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞內(nèi)移植的外源線粒體能夠在增強(qiáng)X線損傷腫瘤細(xì)胞核DNA 的過程中起到至關(guān)重要的作用[24]。

4 問題與展望

隨著研究的深入，對(duì)線粒體的認(rèn)識(shí)已經(jīng)不局限于產(chǎn)生能量維持細(xì)胞功能，在清除自由基，延緩衰老，促進(jìn)代謝方面的作用也逐漸得到重視，但機(jī)制還不明確。線粒體移植為許多疾病開辟了新的視野，相關(guān)的動(dòng)物模型和臨床研究還有待完善。線粒體功能障礙威脅細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)，干擾能量生產(chǎn)，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡和疾病。為了治療更多的患者，強(qiáng)烈需要相關(guān)藥物開發(fā)以擴(kuò)大線粒體移植治療的使用范圍。