黃 博，程苾恒，解美婷，劉珊汕，魏 敏

(湖北省人民醫(yī)院 婦產(chǎn)科，湖北 武漢 430000)

子宮內(nèi)膜癌(endometrial carcinoma)是常見的婦科惡性腫瘤，目前手術(shù)仍是其主要的治療方法[1]。Forkhead家族轉(zhuǎn)錄因子叉頭框蛋白M1(forkhead box protein M1，F(xiàn)OXM1)作為調(diào)控細(xì)胞周期的癌基因，對(duì)腫瘤的病理改變起促進(jìn)作用，并對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲與轉(zhuǎn)移具有調(diào)控作用[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXM1是一種細(xì)胞增殖特異性轉(zhuǎn)錄因子，與非惡性前列腺上皮細(xì)胞相比，其在前列腺癌細(xì)胞中高表達(dá)，提示FOXM1異常過表達(dá)有助于前列腺癌的發(fā)生發(fā)展[3]。另有研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌細(xì)胞中抑制FOXM1的表達(dá)可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和藥物敏感性[4]。然而，F(xiàn)OXM1對(duì)子宮內(nèi)膜癌的影響目前研究甚少，本研究探討抑制FOXM1的表達(dá)對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系HEC-1B增殖、遷移和侵襲的影響，為子宮內(nèi)膜癌的臨床治療提供新靶點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系：選擇人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系HEC-1B和人正常子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞系hEECs，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑：LipofectamineTM2000(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；siRNA-NC和siRNA-FOXM1(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)；Trizol(賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司)；CCK8試劑盒(蘇州瑞諾德生物科技有限公司)；FOXM1、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、GAPDH上下游引物(生工生物工程(上海)股份有限公司)；FOXM1兔多克隆抗體(Abcam公司)；VEGF、bFGF兔多克隆抗體、山羊抗兔二抗(LI-COR公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染：子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系HEC-1B，培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2、相對(duì)濕度90%、含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，采用LipofectamineTM2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染。根據(jù)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的不同，將細(xì)胞分為3組：空白對(duì)照組(不轉(zhuǎn)染，細(xì)胞正常生長(zhǎng))、陰性對(duì)照組[轉(zhuǎn)染100 nmol/L siRNA-negative control(NC)]、siRNA-FOXM1組(轉(zhuǎn)染100 nmol/L siRNA-FOXM1)，分別于轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR：Trizol法提取各組細(xì)胞總RNA，并測(cè)定RNA的濃度和純度，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行操作，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，取1 μL cDNA采用SYBR Green RT-qPCR試劑盒進(jìn)行基因檢測(cè)。FOXM1上游引物為：5′-TGCCCAGCAG TCTCTTACCT-3′，下游引物為：5′-CTACCCACCTTC TGGCAGTC-3′；VEGF上游引物為：5′-AGGGCAGAA TCATCACGAAGT-3′，下游引物為：5′-AGGGTCTC GATTGGATGGCA-3′；bFGF上游引物為：5′-TATTT CTTTGGCTGTACTTG-3′，下游引物為：5′-TCCAGC ATTTCGGTGTTG-3′；GAPDH上游引物為：5′-GAAG GTGAAGGTCGGAGTC-3′，下游引物為：5′-AAGAT GATGGATTTC-3′。反應(yīng)體系：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。按公式(2-△△Ct法)計(jì)算各組細(xì)胞FOXM1、VEGF和bFGF mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 CCK8法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)：收集轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞，接種于96孔板(每孔2×103個(gè)細(xì)胞)。然后分別于0、24、48、72 h培養(yǎng)細(xì)胞，加入10 μL CCK-8試劑。再孵育2 h后，用酶標(biāo)儀測(cè)量每個(gè)孔在450 nm吸收波長(zhǎng)下的吸光度值(A)。

1.2.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)：在6孔板背面用記號(hào)筆均勻劃線，每隔0.5～1.0 cm劃一道，每道線均橫穿過孔。在孔中加入約1×105個(gè)細(xì)胞，加入培養(yǎng)液過夜孵育。用槍頭垂直于6孔板劃線，PBS洗滌細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24 h觀察拍照，觀察細(xì)胞的遷移情況，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：取300 μL無血清培養(yǎng)基加入30 μL基質(zhì)凝膠，混勻后鋪于Transwell小室的上室內(nèi)，調(diào)節(jié)各組細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL，各取200 μL加入上室內(nèi)，下層小室內(nèi)加入600 μL培養(yǎng)液，常規(guī)培養(yǎng)24 h；取出Transwell用PBS洗滌3遍，用0.4%多聚甲醛固定30 min，結(jié)晶紫染色10 min，PBS洗滌3次，顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 Western blot檢測(cè)實(shí)驗(yàn)：BCA法檢測(cè)各組細(xì)胞蛋白濃度。取30 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜后用5%脫脂牛奶封閉，2 h后TBST緩沖液漂洗；分別與VEGF、bFGF、β-actin蛋白特異性一抗(1∶1 000)4 ℃孵育過夜后，TBST緩沖液漂洗，加入二抗(1∶2 000)，室溫孵育后ECL化學(xué)發(fā)光劑顯色。Image J分析軟件計(jì)算各組細(xì)胞目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞FOXM1 mRNA及蛋白表達(dá)水平

與人正常子宮內(nèi)膜上皮hEECs細(xì)胞相比，人子宮內(nèi)膜癌HEC-1B細(xì)胞FOXM1 mRNA和蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)(圖1)。siRNA-FOXM1組FOXM1 mRNA和蛋白表達(dá)與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比顯著降低(P<0.05)(圖2)。

A.expression of FOXM1 protein was analyzed by Western blot;B.expression of FOXM1 mRNA was analyzed by RT-qPCR;*P<0.05 compared with hEECs cells圖1 hEECs和HEC-1B細(xì)胞FOXM1 mRNA及蛋白表達(dá)水平Fig 1 Expression of FOXM1 mRNA and protein in hEECs and HEC-1B n=3)

A.expression of FOXM1 protein was analyzed by Western blot;B.expression of FOXM1 mRNA was analyzed by RT-qPCR;*P<0.05 compared with blank control;#P<0.05 compared with NC control圖2 轉(zhuǎn)染后HEC-1B各組細(xì)胞FOXM1 mRNA及蛋白表達(dá)水平Fig 2 Expression of FOXM1 mRNA and protein in each group of HEC-1B cells after n=3)

2.2 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞的增殖能力

24、48和72 h siRNA-FOXM1組HEC-1B細(xì)胞增殖較空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組顯著降低(P<0.05)(表1)。

表1 轉(zhuǎn)染后HEC-1B各組細(xì)胞的增殖能力Table 1 Proliferation ability of cells in each group of HEC-1B cells after transfection(A, n=3)

2.3 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞的遷移能力

siRNA-FOXM1組HEC-1B細(xì)胞劃痕寬度與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比顯著變寬，劃痕寬度比顯著增加(P<0.05)，而空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3)。

*P<0.05 compared with blank control group;#P<0.05 compared with NC control group圖3 轉(zhuǎn)染后HEC-1B各組細(xì)胞的遷移能力Fig 3 Migration ability of cells in each group of HEC-1B cells after transfection(×200, n=3)

2.4 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞的侵襲能力

與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，siRNA-FOXM1組HEC-1B細(xì)胞穿過Transwell小室的細(xì)胞數(shù)顯著減少，侵襲能力減弱(P<0.05)，而空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4)。

*P<0.05 compared with blank control group;#P<0.05 compared with NC control group圖4 轉(zhuǎn)染后HEC-1B各組細(xì)胞的侵襲能力Fig 4 Invasion ability of cells in each group of HEC-1B cells after transfection(×200, n=3)

2.5 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞VEGF、bFGF mRNA及蛋白表達(dá)

與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，siRNA-FOXM1組HEC-1B細(xì)胞VEGF、bFGF mRNA及蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.05)，而空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，HEC-1B細(xì)胞VEGF、bFGF mRNA及蛋白表達(dá)無差異(圖5)。

A.expression of VEGF and bFGF protein was analyzed by Western blot;B.expression of VEGF and bFGF mRNA was analyzed by RT-qPCR;*P<0.05 compared with blank control;#P<0.05 compared with NC control圖5 轉(zhuǎn)染后HEC-1B各組細(xì)胞VEGF、bFGF mRNA及蛋白表達(dá)Fig 5 mRNA and protein expression of VEGF and bFGF of cell in each group of HEC-1B cells after transfection

3 討論

FOXM1是一種原癌基因，在各類癌中高表達(dá)。由于它可在不同類型的癌細(xì)胞中調(diào)節(jié)腫瘤生長(zhǎng)、血管生成和轉(zhuǎn)移等，在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮不同的作用[5-6]。RNA干擾技術(shù)是一種基于靶基因同源雙鏈RNA對(duì)生物體內(nèi)基因序列的特異性沉默能力的一種基因技術(shù)，是臨床腫瘤靶向治療研究熱點(diǎn)之一[7]。有研究表明，F(xiàn)OXM1的表達(dá)與結(jié)腸癌的侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)，siRNA干擾FOXM1可有效抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[8]。有研究[9]發(fā)現(xiàn)，抑制FOXM1基因的表達(dá)可明顯降低鼻咽癌細(xì)胞增殖水平，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并提高細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干擾FOXM1表達(dá)后，HEC-1B細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力均減弱，提示降低FOXM1的表達(dá)可抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲水平。

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移依賴于新生血管和淋巴管的生成，VEGF是與腫瘤相關(guān)的重要的血管因子，而bFGF是細(xì)胞生長(zhǎng)分化的重要調(diào)節(jié)因子，VEGF和bFGF 具有協(xié)同促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的作用[10]。有研究[11]發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織中VEGFA、VEGFB和VEGFC高表達(dá)，且與FOXM1的表達(dá)呈正相關(guān)，表明VEGFA、VEGFB和VEGFC可能是FOXM1下游的靶基因。另有研究發(fā)現(xiàn)，抑制FOXM1可通過下調(diào)VEGF、MMP-9和MMP-2抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲性、遷移和血管生成能力[12]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，siRNA-FOXM1組VEGF、bFGF mRNA及蛋白表達(dá)均顯著降低，提示FOXM1可通過調(diào)控VEGF、bFGF的表達(dá)發(fā)揮作用。

綜上所述，抑制HEC-1B細(xì)胞中 FOXM1的表達(dá)可以抑制細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力，其機(jī)制可能是通過抑制VEGF、bFGF的表達(dá)發(fā)揮作用，為治療子宮內(nèi)膜癌的研究提供新思路。然而FOXM1是否進(jìn)一步影響VEGF下游相關(guān)信號(hào)通路有待深入研究。