劉文鑫 劉亞男

(九江學(xué)院江西油茶研究中心 江西九江 332005)

油茶(Camellia oleifera)屬山茶科(Theaceae)山茶屬(Camellia)的常綠小喬木，是中國(guó)南方特有的木本油料樹種[1]。近年來(lái)，由于中國(guó)南方地區(qū)冬季頻發(fā)凍害、雪災(zāi)，特別是長(zhǎng)江中下游地區(qū)等油茶主產(chǎn)區(qū)常發(fā)生低溫凍害，導(dǎo)致油茶產(chǎn)量降低，因此，對(duì)油茶開展系統(tǒng)的耐寒相關(guān)研究尤為重要。通過(guò)研究油茶在低溫下的生理反應(yīng)和調(diào)控機(jī)制，明確其響應(yīng)低溫的內(nèi)在機(jī)理，從而在低溫脅迫來(lái)臨前及時(shí)采取措施，以達(dá)到降低低溫凍害對(duì)油茶產(chǎn)生的不利影響的目的，對(duì)油茶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展有重要意義。低溫使植物的生理活動(dòng)受到影響，同時(shí)植物的各種蛋白含量、酶活性也隨之發(fā)生改變，相應(yīng)抗寒基因的表達(dá)和響應(yīng)機(jī)制也發(fā)生了改變。

盡管油茶對(duì)低溫環(huán)境有較高的耐受性，但嚴(yán)重低溫造成的凍害也會(huì)導(dǎo)致樹勢(shì)減弱，引發(fā)病害，影響未來(lái)的生長(zhǎng)和產(chǎn)量，嚴(yán)重限制了其主要產(chǎn)區(qū)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展。在植物中，冷脅迫會(huì)引起植物在生理學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)方面的變化[2-4]。冷脅迫主要通過(guò)誘導(dǎo)光系統(tǒng)I和光系統(tǒng)II的光抑制進(jìn)而影響光合機(jī)制[5]。此外，葉綠體電子傳遞鏈的缺陷會(huì)導(dǎo)致活性氧(ROS)的過(guò)量產(chǎn)生[6-7]。ROS的過(guò)量積累會(huì)導(dǎo)致膜脂過(guò)氧化反應(yīng)的增加，進(jìn)而損害重要的生物大分子[8]。因此，為了消除過(guò)量的ROS，植物形成了一系列的抗氧化防御機(jī)制，包括酶抗氧化劑和非酶抗氧化劑，以保護(hù)細(xì)胞免受ROS的傷害[6-8]，主要的酶抗氧化劑包括過(guò)氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、多酚氧化酶(PPO)、過(guò)氧化氫酶(CAT)和抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)等；非酶抗氧化劑包括谷胱甘肽(GSH)、抗壞血酸(ASA)、半胱氨酸(Cys)等[9]。低溫脅迫導(dǎo)致光合碳還原電子通量的減少與SOD和APX活性的顯著增強(qiáng)密切相關(guān)[10]。雖然關(guān)于植物耐冷的分子機(jī)制在其他物種上已經(jīng)進(jìn)行了深入的研究，但對(duì)于油茶關(guān)于低溫脅迫下分子的相關(guān)研究停留在轉(zhuǎn)錄組分析層面上[11-12]。

植物葉片的內(nèi)部和外部結(jié)構(gòu)能在一定程度上反映植物的生理適應(yīng)性，因此葉片結(jié)構(gòu)的差異和變化可以作為研究植物抗逆性的依據(jù)之一[13]，而在生理結(jié)構(gòu)上起主要作用的是葉片[14-15]。前人對(duì)多種植物進(jìn)行低溫脅迫處理后的研究發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育會(huì)造成不利影響。因此，在油茶的抗寒性研究中葉片解剖結(jié)構(gòu)的差異及生理生化特性的變化成為了研究油茶抗寒性與否的重要指標(biāo)。

1低溫脅迫對(duì)油茶葉片形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

葉片是植物進(jìn)化過(guò)程中對(duì)環(huán)境變化較敏感且可塑性較大的器官。低溫脅迫后，植物通過(guò)改變外部形態(tài)來(lái)響應(yīng)脅迫環(huán)境，葉片的組織結(jié)構(gòu)與抗寒性密切相關(guān)。環(huán)境因子的臨時(shí)改變不會(huì)導(dǎo)致葉片結(jié)構(gòu)發(fā)生很大的變化，結(jié)構(gòu)是植物對(duì)環(huán)境條件長(zhǎng)期適應(yīng)的體現(xiàn)。因此，在抗寒性研究中，葉片的形態(tài)和解剖結(jié)構(gòu)特征可以作為一個(gè)評(píng)價(jià)植株抗寒性的重要指標(biāo)之一[16]。植物可以通過(guò)改變?nèi)~形、葉厚及結(jié)構(gòu)等特征來(lái)適應(yīng)環(huán)境脅迫，葉片結(jié)構(gòu)中各組織的大小和所占的比例等與抗寒性密切相關(guān)[17]。前人已經(jīng)做了很多關(guān)于葉片結(jié)構(gòu)與抗寒性的相關(guān)研究[18-20]，并且分析植物葉片解剖結(jié)構(gòu)已成為評(píng)價(jià)植物抗寒性的重要方法，并應(yīng)用于不同物種抗寒性的研究[18-22]。

曾建亮等[23]通過(guò)對(duì)6個(gè)油茶品種的葉片解剖結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)油茶的耐寒性主要受到葉片解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)中上表皮厚度、海綿組織厚度、組織結(jié)構(gòu)緊密度和氣孔密度的影響。張?chǎng)蝃24]通過(guò)對(duì)不同生態(tài)區(qū)域油茶品種葉片解剖結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察測(cè)定發(fā)現(xiàn)，不同地區(qū)間油茶的葉片表皮結(jié)構(gòu)差異十分顯著，組織厚度最大的鳳陽(yáng)油茶更能夠忍受低溫環(huán)境。氣孔開度最小的鳳陽(yáng)油茶，可能與其分布在安徽油茶的最北側(cè)有關(guān)。不同物種的油茶氣孔密度差異較大且顯著，同一物種間的無(wú)顯著差異，油茶品種不同氣孔開度不同，環(huán)境會(huì)導(dǎo)致相同品種油茶的氣孔開度差異。葉片氣孔密度越小，抗寒性越強(qiáng)，密度越大，抗寒性越弱。

2低溫對(duì)油茶生理特性的影響

2.1低溫對(duì)油茶光合特性的影響

光合作用是一個(gè)對(duì)非生物脅迫高度敏感的生理過(guò)程[25]。光合速率可作為研究植物光合特性的重要參數(shù)，是反映植物生長(zhǎng)狀況、抗逆性及推斷植物生產(chǎn)力的重要指標(biāo)。植物光合作用對(duì)環(huán)境條件變化非常敏感，可用來(lái)反映植物對(duì)不利環(huán)境的適應(yīng)性[26]。植物葉片的結(jié)構(gòu)對(duì)光合作用影響明顯。葉片越厚，光合能力越強(qiáng)，葉片越薄，光合能力越弱[27-28]。

低溫會(huì)導(dǎo)致植物吸收的光能超過(guò)能夠利用的光能，引起光抑制[29]。吳玲利等[30]人研究發(fā)現(xiàn)，“華碩”和“華鑫”油茶苗在冷馴化25d時(shí)兩個(gè)品種的Pn、Gs、Tr、Fv/Fm及qP均顯著降低，在常溫25°C恢復(fù)7d后以上指標(biāo)均增加。高璐鑫等[31]研究發(fā)現(xiàn)亞低溫脅迫處理的油茶葉片PSII與PSI活性均發(fā)生抑制；亞低溫脅迫下油茶葉片光合機(jī)構(gòu)電子傳遞鏈活性顯著降低，導(dǎo)致葉片光合機(jī)構(gòu)的光合性能降低。王雨水[32]研究發(fā)現(xiàn)“雜優(yōu)閩 1”油茶幼苗在冷脅迫處理時(shí)，經(jīng)低溫鍛煉的凈光合速率降低程度小于未經(jīng)低溫鍛煉的，且常溫恢復(fù)后，前者能很快恢復(fù)，后者的沒有恢復(fù)，說(shuō)明低溫鍛煉能顯著提高油茶幼苗的抗寒性，可以有效地避免冷脅迫的傷害。陳麗文等[33]研究發(fā)現(xiàn)低溫導(dǎo)致油茶的最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)降低。低溫預(yù)處理后可提高油茶的抗寒性，因此光合特性的變化可以作為判斷油茶抗寒性差異的指標(biāo)之一。

2.2對(duì)保護(hù)酶系統(tǒng)的影響

植物在正常生命活動(dòng)中會(huì)產(chǎn)生ROS。冷脅迫影響植物的生長(zhǎng)，使植物對(duì)能量的利用率降低，從而導(dǎo)致光合作用降低和ROS的形成。在低溫條件下，ROS的過(guò)量產(chǎn)生對(duì)植物有一定的毒性，需要經(jīng)過(guò)一系列的抗氧化系統(tǒng)進(jìn)行清除。但隨著脅迫時(shí)間和程度的加劇，活性氧的積累量超過(guò)抗氧化系統(tǒng)的清除能力，導(dǎo)致膜脂過(guò)氧化，引起膜系統(tǒng)損傷，植物受到傷害甚至死亡[34]。在脅迫中，SOD能夠清除活性氧自由基，有利于提高植物的抗氧化能力；POD能夠分解產(chǎn)生的過(guò)氧化氫，有助于提高植物的抗氧化能力[35]。CAT能夠清除過(guò)剩的活性氧、保護(hù)細(xì)胞，從而增強(qiáng)植物的抗逆性。大量研究表明，這3種保護(hù)性酶與植物低溫脅迫密切相關(guān)。

低溫處理后，廣西油茶的CAT活性在20℃時(shí)最高，湖南油茶的在15℃時(shí)最高；兩種油茶中的SOD活性均在20℃時(shí)最高；廣西油茶中POD活性在15℃時(shí)最高，湖南油茶的在10 ℃時(shí)最高。大別山1號(hào)油茶隨低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，CAT和POD活性不斷降低降低[36]。遭受10～0℃范圍內(nèi)的低溫脅迫處理，油茶幼苗尚能形成低溫適應(yīng)機(jī)制；而遭受-10℃及以下低溫處理時(shí)，油茶幼苗機(jī)體代謝機(jī)能則幾乎失去平衡。經(jīng)低溫鍛煉的油茶幼苗葉片SOD、CAT和APX活性高于未經(jīng)低溫鍛煉的，說(shuō)明低溫鍛煉有利于保護(hù)酶在誘導(dǎo)油茶抗寒性上發(fā)揮著重要作用[32]。

2.3對(duì)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

低溫脅迫下，植物可通過(guò)積累各種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)如，可溶性糖、可溶性蛋白、游離脯氨酸等來(lái)提高自身的滲透調(diào)節(jié)能力，與植物耐寒性有密切關(guān)系[37]。可溶性糖含量的增加有助于細(xì)胞液濃度的提高，降低細(xì)胞的冰點(diǎn)，進(jìn)而減少細(xì)胞損傷，能顯著降低低溫脅迫對(duì)植物細(xì)胞造成的損害，提高植物抗逆性[38-39]。低溫脅迫下，可溶性蛋白能夠通過(guò)增加細(xì)胞內(nèi)束縛水的含量來(lái)降低細(xì)胞受損程度。低溫脅迫下脯氨酸通過(guò)保護(hù)蛋白質(zhì)的完整性，增強(qiáng)相關(guān)酶的活性來(lái)抵御冷害，還可以通過(guò)減少植物體內(nèi)因脅迫產(chǎn)生的ROS，防止細(xì)胞程序性死亡，保護(hù)植物細(xì)胞免受損害，降低膜脂過(guò)氧化程度[40]。

越冬自然低溫過(guò)程中，亞林4號(hào)其他4種油茶相比有更高的可溶性蛋白含量、SOD活性、脯氨酸含量，并且可溶性糖降幅最小，表明其具有更強(qiáng)的抗寒性[41]。隨著亞低溫脅迫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，油茶“華碩”葉片中可溶性糖含量增加，淀粉含量降低，表明油茶通過(guò)促進(jìn)淀粉向可溶性糖轉(zhuǎn)化，緩解了亞低溫對(duì)光合機(jī)構(gòu)的進(jìn)一步傷害[31]。隨低溫脅迫時(shí)間延長(zhǎng)葉片可溶性蛋白含量顯著上升，在低溫處理72h時(shí)，高州油茶的可溶性蛋白含量與對(duì)照相比上升了7倍；而普通油茶的與對(duì)照相比上升了4倍，普通油茶表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗寒性[42]。

2.4對(duì)膜透性的影響

生物膜是細(xì)胞的基本結(jié)構(gòu)，組成了各種細(xì)胞器的膜系統(tǒng)。低溫脅迫處理后，植物細(xì)胞膜物相發(fā)生變化，膜的透性增大，電解質(zhì)外滲，電導(dǎo)率升高。相對(duì)電導(dǎo)率越高，細(xì)胞膜透性越大，說(shuō)明細(xì)胞膜受害程度越大，導(dǎo)致抗寒性降低[43]。相對(duì)電導(dǎo)率和丙二醛含量呈顯著正相關(guān)。MDA是細(xì)胞膜膜脂過(guò)氧化作用的產(chǎn)物之一，其含量能反映膜受損程度和植物組織抗氧化的能力[44-45]。一般而言，MDA與植物抗性呈負(fù)相關(guān)，即MDA的含量越高，植物組織或器官受損的程度就越大，植物的抗性就越弱。

在低溫處理過(guò)程中，油茶的相對(duì)電導(dǎo)率均隨溫度的降低而上升，基本呈“S”型[46]。10℃和0℃處理4d后，大別山1號(hào)油茶葉片的MDA含量與25℃處理下相比分別增加了85.81%和32%。-10℃處理下，MDA含量增加了3倍[36]。在低溫鍛煉期間，“雜優(yōu)閩1”油茶幼苗葉片的MDA含量沒有發(fā)生明顯變化，說(shuō)明低溫鍛煉沒有引起葉片的過(guò)氧化。但在冷脅迫期間，經(jīng)過(guò)和未經(jīng)過(guò)低溫鍛煉的油茶幼苗葉片的MDA含量均有所增加，但未經(jīng)低溫鍛煉的油茶幼苗MDA含量增加幅度顯著大于經(jīng)過(guò)低溫鍛煉的，說(shuō)明冷脅迫對(duì)經(jīng)過(guò)低溫鍛煉的油茶幼苗的膜脂過(guò)氧化影響較小[32]，說(shuō)明經(jīng)過(guò)低溫鍛煉后可減輕膜脂過(guò)氧化的影響。

3外源物質(zhì)對(duì)油茶低溫脅迫下抗性的影響

近年來(lái)，通過(guò)噴施外源調(diào)節(jié)物質(zhì)來(lái)提高植物抗寒性的方法已經(jīng)得到廣泛認(rèn)可，在其他物種中也有了大量研究，而油茶中的相關(guān)研究較少。與噴施清水組相比，外源甜菜堿能夠顯著緩解低溫脅迫下油茶相對(duì)電導(dǎo)率的升高，增加可溶性糖、可溶性蛋白的含量，提高SOD酶活性，降低超氧陰離子的含量，從而增強(qiáng)油茶對(duì)低溫的抗性[47]。向低溫脅迫的油茶噴施脫落酸(ABA)、CaCl2水溶液和抗壞血酸3種抗凍劑后發(fā)現(xiàn)，油茶的根系活力、可溶性蛋白質(zhì)含量、葉綠素含量、葉綠素?zé)晒鈪?shù)均高于對(duì)照組，油茶的MDA含量均低于對(duì)照組，說(shuō)明噴施抗凍劑可以有效減少低溫脅迫對(duì)油茶的損害，提高油茶的抗凍性和適應(yīng)性，對(duì)油茶的栽培和推廣有重要意義[48]。變溫低溫脅迫處理并噴施CaCl2溶液后能夠降低油茶葉片的相對(duì)電導(dǎo)率、可溶性糖、丙二醛的增幅，提高脯氨酸、可溶性蛋白含量，提高SOD、POD活性，且低溫前噴施CaCl2溶液較低溫后噴施的效果要好[49]。

4展望

低溫脅迫是限制植物生長(zhǎng)和發(fā)育的主要限制因素之一，特別是對(duì)于油茶這種具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的油料作物，低溫還會(huì)導(dǎo)致其產(chǎn)量降低、減少主產(chǎn)區(qū)的收益。目前關(guān)于油茶低溫脅迫的研究主要集中在比較不同品種油茶的抗性、脅迫下油茶的生理生化、光合特性及葉片結(jié)構(gòu)等變化的單一方面的研究。油茶抗性的差異受各個(gè)方面的影響，因此以后的研究要將不同方面的研究進(jìn)行綜合分析，這樣才能更全面地了解油茶不同抗性的差異原因。另外，關(guān)于油茶與抗寒相關(guān)的分子生物學(xué)研究較少，特別是關(guān)于抗寒相關(guān)基因的篩選及其表達(dá)機(jī)理的研究還不夠深入，因此對(duì)低溫脅迫下油茶抗寒或耐寒相關(guān)基因的挖掘是亟需解決的問(wèn)題。隨著現(xiàn)代研究手段的不斷發(fā)展以及其他物種的研究不斷完善，有必要通過(guò)現(xiàn)代分析育種技術(shù)以及其他物種的研究方法來(lái)有目的地改量高產(chǎn)但抗性差的油茶品種，為油茶產(chǎn)業(yè)提供技術(shù)支撐。